群 溶連菌 脂 質 関す 研究

2 14 金沢大 学 十 全 医 学 会雑 誌 第錮巻 第1 号 2 1 4‑^{2 2 4} (1 9 8 1)

A 群溶 連 菌^の脂質^に関 する研 究

〔^ⅠⅠ〕 溶 連 菌 脂 質^の瞳 瘍 細 胞傷害作用^につ い て

金沢 大学 医学 部 薬理学 教 室( 主 任^: 正 印 達教 授)

北 島 耕 作

( 昭和5 6年1 月^{2 6}日受付)

瓦cy ^{w or}ds H e m ol_{y t}ic str ep t^{o c o c c}i, Str ep tO C O C C al li_pids_! Cy t^OtO Xici_{t y},

E hrlich a s cite s c a r cin o m a.

A 群 溶連 繭^の抗 腫 瘍 作 用^{l ) 2 )}に^つ い て は多く^の研 究が な さ れ^{て い}る が, 溶 連 菌^の抗 腫 瘍 性 因 子^{につ い て はほ} と ん ど明ら か^にさ れ^{て い}ない. し か し な が ら, 溶 連 菌 溶 血 毒 素 (^{ス トレ}プトリ ジンS^{3 州} お よ び 0^引) ^には抗 腫 瘍 作 用が 認 め ら れ ず∴溶 連 菌^の培 養 濾 液^に抗 腫 瘍 性 物 質が見^いだ さ れ な^いが^{王) 2 )}, 無 細 胞 抽 出液^{8 ) 7 )}お よ びこれ よ り分 離さ れ た タ^ン′ヾク画 分^{銅 )}に抗 腫 瘍 活 性が み ら れ ること な ど が報告さ れ^{て い}る^こと か ら, 溶 連 菌^の菌 体 成 分が抗 腫瘍 作用^に関 与して いること が考え ら れ る.

他 方, あ る種^の真菌か ら抽 出さ れ た遊 離 脂 肪 酸やモ ノ グ リ^セリ ド が抗 腫 瘍 作 用を示 す^こと1 0 卜 1 2 )

,大 腸 菌や赤 痢 菌か ら抽 出^{さ れ た 1i}pi d A に抗 腫 瘍 作 用^{が 認 め ら れ} ること1 3 ) 1 4 )

な ど が報 告さ れ^{て い}る^{. こ}れ ら^{の こ}と か ら,

著 者は前 報^におい て各 種 連 鎖 球 菌よ り脂 質を分 離し,

これ らについ て定 性 定 量 実 験を行ない比 較 検 討^を行な

っ た が^{2 6 )}, 本 論 文では, 3 種 類^の A 群 溶 連 薗 (Su 菌,

B la ck m o r e 商お よ び C 2 0 3 U 菌) か ら ク^{ロ ロ} ホ ル ム ^･

メタノ ^ー ル液で抽 出し た総 脂 質t お よ び滞 層^{クロ マ ト} グラ フ ィ ^ー で分離し た総 脂 質^の画 分 (^リン脂 質, 糖 脂 質お よ び中性 脂 質) ^のエ ^ー ルリ^{ッ ヒ}腹 水が ん細 胞^に対 す る作 用^{につい て}実 験を行な^っ た.

材 料お よ び方 法 1. 溶連 菌

教 室 保 存^のA 群 溶連 菌Su 株 (3型. ス トレプ ト リ ジンS お よ び^{ス トレ}プトリ ジ^ン 0 産 生株, 以下Su 歯 と略 記), B la ckm o r e株 (1 1 型t ストレプトリ^ジンS

Stud ie s o n the L i_pids of Gr o up A H e m ol_{y t}ic

産 生 株^, 以 下B la ckm o r e 菌と略 記) お よ び C 2 03U株 (C 2 0 3S 菌^の変 異種t ス ト^レプトリ^ジン 0 産 生 株,以 下C 2 0 3 U 菌と略記) を用^いた^.

2^. 溶連 菌^の培 養

溶 連 菌^の培 養^には前 報^で用^いた W o od らの合 成 培

地を使 用し た^{l 紺 6 ).} 溶連 菌^の合 成 培 地^に よ る培 養 液

200 mエを 1 0￡^の合 成 培地に移 植し, 3 7 ℃で1 2時 間 培 養し たのちt 低 温 下^で連 続遠心 (1 0 0 00rp^m .1 00 m⊥/

分) して集 菌し, 得ら れ た菌 体を生理食塩 水で2 回洗 浄し た ( 菌 収 量^{: 2.0}‑^{2.5g/ J) .}

3^. 溶 連菌脂質^の抽 出

溶 連 菌^の脂 質^{は FoIch らの}方 法^によ っ て抽 出し

た^{1 7 ).} すな わ ち,2 0‑ ^{2 5g の溶連 菌を 2 0 倍量のクロロ}

ホル ム ^･ メタ^{ノ ー ル} ( 2^: 1,Ⅴ/v) で室 温で 2 回抽 出し たのち, 抽 出 液^に1^/5 量^の生理食 塩 水を加えて混 和し,4 ℃に放 置して混液が二層に分 離してか ら.水溶 性物 質を含む上 層を除 去し, 脂 質を含む下 層を^{ロ ー タ} リ ^{ー ･ エ バ} ボレ^ー ク ^ー を用い て窒 素気 流 下に 4 0 ℃^で 減 圧 濃 縮して油 状 物 質 ( 総 脂 質) を得た( 総 脂質 収量:

9 ^‑ 11 mg/g) ^.

4^. 簿層 ク^ロ マ ト グラ フ_ィ ^ー によ る溶連菌脂質^の 分離^■ 精 製

一 次 元 薄 層ク^{ロ マ} トグラ フィ ^ー によ^{っ て}溶連 菌^のリ

ン脂 質, 糖 脂 質お よ び中 性 脂 質を分 離し た^. 1) リ^ン脂 質と糖 脂 質

ク^ロ マ トプレ ^ー ト(2 0 ^× 2 0 c m, 厚さ 1 m m) ^{の 一}端 か ら 2.5 c mのところに溶 連 菌^の総 脂 質 (1 0 0 相前後)

Str ep t^{o c o c c}i. [^ⅠⅠ] ^Cy t^oto xic A ctivi_{t y}

of L i_pids fr o m He m ol_{y t}ic Str ep t^{o c o c c}i. K o u s ak^u K i_taj^{im a, De}p^{a r}tm e nt of P ha r m a c olog y

(^{D ir e cto r : Pr of. S. S h oin})^{,S cho ol of M edicin e, K}a n a z a w a Uⁿiv e r si_{t y}.

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A 群 溶 連 菌の脂 質^に関す る研 究 _{2 1 5}

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を線 状^{に スポットし, クロ ロ ホルム ■ メタノ ー ル ｡} 水 ( 6 5 ^: 2 5 ^: 4,Ⅴ/v)^{1 8 I}で1 6 c m展開し た^･ 展 開 後,

ヨ ^ー ド試 薬 ( 脂 質 検 出 用)^{1 9 )} を噴 零して ス ポッ ト の位 置を確認し た^のち^{, ヨ ー ド}が樋 色し^てか ら, 脂 質を含 む^シリ カ ゲ^ルを プ^レー ト よ り採取し, クロ ロホ ルム ^･

メタ^{ノー ル} (2 ^: 1, Ⅴ/v) ^で脂 質を抽 出し た. 単 ^一な 脂質を得る た め^に, 分 離し た リ^ン脂 質お よ び糖 脂 質に

っい て上記^の操 作を 2 ^‑ 3 回線 返^{し た が, 一}部の リ^ン 脂質と糖 脂質^の分 離が不 充 分であ^っ たの で, ク^{ロ ロ} ホ ル ム ^･ ア セ トン ^･ メタ^{ノ ー ル ･} 酢酸 ^･ 水 ( 65 : 3 5 ^:

1 1 ^: 4 :1^.5,Ⅴ/^v)^{2 0 ‑}を展 開 溶 媒と す る ^一 次 元薄 層ク

ロ マ トグラ フィ ^ー によ^っ てリ^ン脂 質と糖脂 質を分 離し

た.

分 離し た リ^ン脂 質お よ び糖 脂 質を同 定す る た め^に,

ク^{ロ マ} トプ^{レー ト} (5 ^×20c m, 厚さ 0^.25^{m m}) ^{の 一}端 か ら 2.5 ^{c mの}ところに脂 質 成分を点 状に スポ^ッ トし^, 上記^の展 開溶 媒^で1 5 c m展 開^{し たのち,リンモリ ブデ ン} 酸試薬 ( 脂 質 検 出 用)^{1 9 } ,} D it tm e r ^‑ Le ste r 試 薬 ( リ

ン脂質 検 出用)^{2 1 )} ま た は^{アンス ロ ン}試 薬 ( 糖 脂 質 検 出

用)^{2 2 }} を噴霧し^て脂 質^の種 類を調^べた( 表1)^{1 6 ) 2 5)}

2) 中性 脂 質

複 合脂 質^の場 合と同様^{に, クロ マ ト プ レ ー ト}( 2 0 ^× 20^{c m}, 厚さ 1 ^{m m}) に溶 連菌^の総 脂 質を線 状^{に ス ポッ ト} し^{, ヘ}キサ ン ^･ エチ ルエ ^ー テ ル ^･酢 酸 (7 0 : 3 0 : 2,

Ⅴ/v)^{2 別} を 展開 溶媒と して1 6 c m 展 開し た^. 展 開 後^,

ヨ ^ー ド試 薬^{によっ て スポッ ト の}位 置を確認 し, ク^ロ マ

トプ^{レ ー} トか ら脂 質 成 分を回収し た が^{t 一}部^の成 分は 完全に分離し な か^っ たの でl 分離が不 充分な脂 質 成 分 は塩化エ チ レ ン ^･ メタノ ^ー ル (9 8 ^: 2, Ⅴ/v) ^細■ を 展

開 溶 媒と す る ^一 次 元薄 層ク^{ロ マ} トグラ フ_ィ ^ー によ^っ て

分 離し た. 脂 質 成 分を同 定す る た めに, クロ マ トプレ

ー ト(5 ^×2 0 ^{c m}, 厚さ 0^.2 5 m 皿) に分 離し た脂 質お よ

び標 準物 質 ( ^{コ レ ス テロ ー ル}. パ ルミ チ ン酸, モ ノ^パ

ル ミ チ ン

, ジバル ミ チ ンな ど) を^スポッ ト し^, 上 記の

展 開 溶媒で展 開し たのちt リンモリ ブ デン酸 試 薬ま た は^{アンチ モ ン}試 薬 (ス テロ ^ー ル類 検 出用)^{用で スポット} を検 出して_, R f値お よ び里 色 反 応を比 較し た ( 表

2)1 8 ) 2 5 ) 2 8 1

5. ガスクロ マ ト グ ラフ ィ ^ー に よ る溶 連 菌 脂 質^の 脂 肪 酸の分 析

薄層クロ マ ト グラ フィ ^ー で分離し た溶連 菌^のリン脂 質, 糖 脂 質お よ び中 性 脂 質^の脂 肪 酸 構 成を ガスク^ロ マ

ト グラ フ_ィ ^ー で調^べ た^{2 6)}.

5 ^‑ 1 0 曙 の脂 質を 5 %硫 酸^メタ^{ノー ル}溶 液^で65 ^‑ 70 ℃ ^･ 1 5 時 間 処理 し た^のち, シクロ ^ヘキサ ン ^･ ク^ロ

ロホ ル ム (1 : 1, Ⅴ/v)^{2 7 )} を展 開 溶 媒と す る ^一 次 元 薄

層ク^{ロ マ} トグラ フ ィ ^ー によ^っ て脂 肪 酸^{メ チ ルエ ス テ ル} を分離し^てガスク^{ロ マ} トグラ フィ ^ー に用^いた,

使用し た装 置は 日立^モデ^ル0 6 3 ガ^スク^ロマ トグラ フ

( 水素 炎^イオン化 検 出 器 付き) ^で. N P G S を60 ^‑ 8 0 メ ッ シュのC hr o m o s o rb W (A W ^‑ D M C S) ^に20 %

コ ^ー テ ィ ング し た担 体を ガラ スカラ ム( 長さ 2 0 0 ^{c m}.

内径 3 m m) に充 填^して用^いた. 測 定 時^{のカラ ム}恵 度^は 210 ℃, 試 料 注 入口^の温 度は 230 ℃, 検 出器^の温 度は 2 8 0 ℃であ り, キ ャ リ^{ア ー} ガスと して用^いた窒 素ガス の流 量は 2 0Inエ/ 分^であ^っ た. な お.イ オン化 検 出 器^の 感度はレ ンジ が 1 0, アッ テネ ^ー ショ ンが 16 ^であ^っ た,

6. 溶 連 菌 脂 質^の腫瘍細 胞 傷 害 作 用に関 する実 験

Table l^･ C hr o m atog^{r a}p h i^{c c}ha r a cte riz atio n ofc o mp^{o u n}d lip ids of he moly tic str ep^{to c o c c}i

Fr a ctio n R fvalu e sin s oIv e nt^* Colo r r e a ctio nb_ysp^{r a}yr e ag^{e nt* *}

po s sib leide nti fic ado n

Ⅰ Ⅱ R l ^, R 2 R 3

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

Ⅳ

1 5 5 5 6 7 7

Qノ

0 0 0 0

0 0

3

′ h U

8 1 2 5

0 0

0 0 0 0

+ + D i_glu c o syl di_gl_yc ed d^{e s}

+' + D ip h^{o s}p h^atid_yl_gl_yc e r oIs

+ + Mo n og山c o syl di由y^c由 d^{e s}

+ + Ne ut細 川 pid^s

*SoIv e ntI, Ch lo r ofb m rm etha n ol^‑W at_{e r}(6 5^:2 5^:4_,by v ol)^,;S OIv e ntI【, Ch lo r ofo m ^‑a C etO n e^‑ m eth a Jl Oトa c etic a ci d^‑W ate r(6 5:3 5:1 1:4:1.5,b_yv ol.)^.

**

S pr ay r e age nts : R l,Pho sp h^{o m o}lyb datefo r h p id^s;R 2, D it tm e エ^ーLe ste r r e ag^{e nt}fbrp h^{o s}p h^o‑ 1ipi ds;R 3,a nthr o n e r e ag^{e n}tfo rgl_yc oh p id^{s o r ste r o}Is.

21 6

Tab le 2^. C hr o m a土Og^{r a}P hi^{c c}ha r a cte riz atio n ofn e utral u p id^{s o}f he m oly^tic str ep to c o c ci

R fv ah e sin s o帥e nt^* Colo = r e a Ctio n by Fr a ctio n

n O.

Sp^{r a}y^{r e a}ge nt^{* *} po s sibl^eid^{e nt}ific atio n

Ⅳ R I R 4

m M

Ⅵ

二

M

M M

7 0 7

(

U

4 2

爪 U

O O

9 0 2 7

(

U

(

U

0^.0 7 ⁺

0^.1 0 ⁺

0^.3 2 ^十

0^.5 2 ^十

0^.8 6 ⁺

0^.8 8 ⁺

+

+

Mo n ogけ^{c e戒de s} Fr e efat t y ^{a c}ids

St￠工01^s Diglyc e ride s

T dglyc e ride s

S^{t8 工0}1e ste r s

*S^obe ntⅢ_,he x a n e^>di^ethylethe r^‑a C etic a cid(^{7 0:3 0:2,byv oL});S OIv e nt Ⅳ,ethyle n e ch lori de^‑ m e仏独 Ol(9 8:2,bシ^{v oL)･}

* *S p^{r a}y ^{r e age nts :} R l,P h^{o s}p h^{o m o}lyb datefo rh p id^s;R 4,a ntim o ny tricl dod d^e董bI Ste r OIs･

Tab le 3. Co mp^{a ェat}iv e cy t^oto xicte stagai ^{n st}E h dich c a r cino m a cd k withtotal u pi d^{s o}f h^{e m o}ly tic str ep^{to c o c c}i

Str ep^{to c o c c}i

Co n c e ntr atio n Oftot山 王p id^s i

n te st mixtu r e^*

(^mg/^ml)

No.of$ u r V如o f S at6 0^th day

乱 加肌 8抄^ぬぴち S^ll

ぶた 加椚 βけ^{がe 以ち} B la ckm o 工e

飲 舶用 8砂^ガぐ叫 C 2 0 3 ロ

0 0 5

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5 3 0

*Total 1如^{ids s u s}p^{e n}ded in p hysiologi^{cal s 血 e c o ntaini}n g T ^{w e e n} 2 0 (0^･0 2 %)

w ｡ r ｡ mix ｡d wi th tu m o r c ens(^{2 ×1 07c ens}/^ml), a nd in c ubated at 3 7⁰c f^br 9 0

min. A fte r in 加 batio n,the mi ^{xtu r e w a s} ird^{e cted i･}P^･ into mic e(1 0^{1 tu m o r}

C ￠鮎/^{m o u s e)･}