学 位 論 文 題 名
博 士 （ 水 産 学 ） 足 立 伸 次
硬骨魚類の卵成熟誘起ホルモンの同定と 生成機構に関する研究
学位論文内容の要旨
魚類 も 他 の脊 椎 動 物同 様 、 多 くは 有 性 生殖 を 行 なう が 、 人為 的 環 境下 で は 、産 卵 お よび 受 精 が困 難 な 魚種 も 少 な くな い 。 こう し た 問題 を 解 決す る た めに は 、 魚 ．q
類 を 生物 学 的 によ く 理 解す る こ と が必 要 で ある 。 特 に、 配 偶 子形 成 機 構、 す な わ ち 、 卵と 精 子 が作 ら れ るし く み を 理解 す る こと は 魚 類の 成 熟 、産 卵 お よび 受 精 を 人 為 的 に 統 御 す る 上 で 極 め て 重 要 な こ と で あ る 。
一般 に 、 魚類 の 卵 巣中 で は 、 卵の も と にな る 卵 原細 胞 が 体細 胞 分 裂に よ る 増殖 の 後 、卵 母 細 胞と な り 、卵 黄 な ど を蓄 積 し て著 し く 大き さ を 増す 。 十 分に 成 長 し た 卵 母 細 胞 は 、 脳 下 垂 体 か ら 分 泌 さ れ る 生 殖 腺 刺 激 ホ ル モ ン （GTH） の 作 用 に よ り 卵濾 胞 組 織で 生 成 され た 卵 成 熟誘 起 ホ ルモ ン の 刺激 に よ り卵 成 熟 を完 了 し 、 排 卵 され て 受 精可 能 な 卵と な る 。 魚類 で は 、プ ロ ゲ ステ ロ ン 系ス テ ロ イド が 強 い 卵 成 熟誘 起 活 性を 有 す るこ と が 知 られ て い たこ と か ら、 卵 成 熟誘 起 ホ ルモ ン は ス テ ロ イド ホ ル モン で あ ると 予 想 さ れて い た 。し か し 、そ の 化 学的 同 定 は行 な わ れ て い なか っ た 。そ こ で 、本 研 究 で は、 魚 類 の卵 成 熟 誘起 ホ ル モン の 同 定を 行 な う と と も に そ の 生 成 機 構 を 詳 細 に 調 べ た 。
本 研 究 で は 、 ま ず 、 ア マ ゴ 、 ヒ ラ メ 、 マ ダ イ お よ び ニ ホン ウ ナ ギを 材 料 にし て 、 生体 内 お よぴ 生 体 外の 卵 成 熟 に伴 う 形 態変 化 を 調べ た 。 その 結 果 、ア マ ゴ の 卵 成 熟は 他 の サケ 科 魚 類同 様 、 成 熟途 中 卵 門付 近 に 移動 し て きた 核 が 明瞭 に 観 察 1
さ れ るこ と と 黄色 不 透 明な 細 胞 質 が黄 色 透 明に な る こと で 外 観か ら 容 易に 確 認 す る こ とが で き た。 ま た 、卵 母 細 胞 を生 体 外 に取 り 出 し、 リ ン ガー 中 で ホル モ ン 処
理により卵成熟を誘導することも容易であった。ヒラメおよびマダイの生体内で の卵成熟 過程は、 両種とも 卵成熟開 始後約3ー4時間で油 球およぴ卵黄球の融合 と 核 移 動 が 始 ま り 、 約15ー16時 間 後 に は 核 崩 壊 が 起 こ り 、 約18ー20時 間 後には卵黄が完全に融合して透明化するとともに、吸水により卵径が急増した。
乙
生体外での卵成熟過程も生体内とほぼ同様に進行した。ニホンウナギの生体外で の卵成熟 過程は、 形態変化 などヒラ メやマダ イとぃく っかの点で異なっていた が、卵成熟の判定｜ま容易であった。以上のように、魚類の卵成熟は核崩壊や細胞 質の透明化を指標にすることにより、その判定が容易にできることが示された。
次 に 、卵 成熟期 のアマゴ の濾胞組 織付きの卵 母細胞をGTHとともに 培養し、
その培養 液中から 卵成熟誘 起ホルモ ンの精製 と同定を 行なったョ培養液を抽出 後、逆相 カラムを 用いた高 速液体ク ロマトグ ラフイー により20画分に分離精製 した。こ れらの画 分の卵成 熟誘起活 性を調ベ 、唯一活 性があった第10画分を薄 層ク ロ マ トグ ラ フ イー （TLC） に よ り純 品 であ る こ とを 確 認し た 。 この第10 画分と17 ，20p‑dihydroxy‑4‑pregnen‑3‑one（DHP）の 合成品を質量分析した 結果、全く同様の質量スベクトルを示した。また、様々な合成ステロイドの卵成 熟誘 起 活 性を調 ぺた結果 、DHPが最も 高い卵成熟 誘起活性 を示した 。以上の 結 果か ら 、 アマゴ の卵成熟 誘起ホル モンは、プ ロゲステ ロン系ス テロイド のDHP であることを脊椎動物で初めて化学的に同定した。さらに、ニホンウナギについ ても、卵濾胞をステロイド合成の最も上位の前駆体であるプレグネノロンととも に培養し、その培養液中から卵成熟誘起ホルモンの精製および同定を行なった。
培養 液 を 抽出 後 、TLCに よ り分 離 精 製し た 後、15種の 代 謝 物の 中 で最 も卵成 熟誘 起 活 性が あ っ た第9代 謝 物を 再 結 晶法によ り同定し た。標準 品のDHPと第 9代謝物の 混合物の 放射比活 性は異なる溶媒系による再結晶を繰り返してもほぼ 一定値を保った。また、様々な合成ステロイドの卵成熟誘起活性を調べた結果、
、｜
DHPが 最 も 高い卵成 熟誘起活 性を示し た。以上の 結果から 、ニホン ウナギの 卵 成熟 誘 起 ホル モ ン もDHPで ある と 同 定さ れ た。 ヒ ラ メお よ びマ ダ イ につい て は、まず、卵母細胞のホルモン感受性の日周変化を調ペ、卵成熟実験を行なうた めの最も適切な時刻を明らかにした。次に、この時刻の卵母細胞を用いて、卵成
熟に及ぼす各種合成ステロイードの効果について調べた。その結果、アマゴやニホ ンウナギとほぼ同様な結果が得られたことから、これら両種の卵成熟誘起ホルモ ンもDHP である可能性が示唆された。
その後、サケ科魚類の卵濾胞組織が外側の莢膜および内側の顆粒膜細胞層に分 離 でき るこ とに 着目 して 、DHP 生成 機構 が複 数の 研究 者に より詳細に調ぺられ た 。 そ の 結 果 、 GTH 刺 激 に よ り 莢 膜 細 胞 は 17a ．hydroxyprogesterone(17 OHP) を 生 成 し 、 こ の 17aOHP が 顆 粒 膜 細 胞 で DHP に 変 換 さ れ る こ と 、 さ ら に 、 GTH は 顆 粒 膜 細 胞 に も 作 用 し て ス テ ロ イ ド 20p 水 酸 基 脱 水 素 酵 素 (20p
‑HSD ） を 活 性 化 す る こ と が 明 ら か ｜ く さ れた 。ま た、 GTH の 作用 には 、主 に サ イ ク リ ッ ク AMP （ cAMP ） 系 が 関 与 し て い る こ と が 明 ら か に さ れ た 。 し か し、その他の系の関与についてはほとんど調ぺられていなかった。そこで、本研 究では、ニジマスを材料として、卵成熟誘起ホルモン生成に関わる細胞内情報伝 達 系 に 細 胞 内 カ ル シ ウ ム （ Ca ） や pH も 関 与 し てい る か 否 か 調 べ た 。 そ の 結 果 、 GTH 刺 激 に よ る 莢 膜 細 胞 で の 17dOHP 生 成 に は Ca − カ ル モ ジ ュ リ ン 系 お よ び 細 胞 内 pH が 関 与 し て お り 、 そ の Ca は べラ バ ミ ー ル 感 受 性 Ca チ ャ ン ネ ル に よ り 細 胞 外 か ら 流 入 す る こ と 、 Ca お よ ぴ pH 依 存 性 ス テ ッ プ は cAMP 生 成以 降、 プレ グネ ノロ ン生 成以前であること、さらに、Ca ．ジアシルグリセ ロ ール依存性蛋白質燐酸化酵素（C キナーゼ）は不活性化状態にある方がよいこ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た 、 GTH 刺 激 に よ る 顆 粒 膜 細 胞 で の 20p ー HS"D 活 性 化 に も Ca − カ ル モ ジ ュ リ ン 系 お よ び 細 胞 内 pH が 関与 し て お り 、 そ の Ca は 細 胞 内 およ び細 胞外 の両 者に 由来 すること、Ca の細胞外からの流入はニフウジピン 感 受性 Ca チ ャン ネル 依存 であ るこ と、C キナ ーゼ が適 度に 活性化されているこ と が必 要で ある こと 、さ らに 、そ れらの 依存 性ス テッ プは c AMP 生成以降であ り 、 20p 一 HSD 活 性 自 身 t こ は 影 響 し な い こ と が 示 唆 さ れ た 。 こ の よ う に 、G TH の作 用も 細胞 によ り異 なる とともに、細胞内の情報伝達系も極めて複雑であ ることが明らかになった。
莢膜 細胞 は、 GTH の 作風 によ り卵 黄形 成期 には エス トロ ゲンの前駆体である
testosterone （ T ）を 、卵 成熟 期には17 OHP を生成する。これは莢膜細胞にお
け るス テ ロ イド 生 成 系がT生 成 系か ら17 OHP生成 系 に 転換 す るこ と を示 して いるが、この転換機構は全くわかっていな′い。本研究では、ニジマスの卵黄形成 後 期お よ び 卵成 熟 期 の莢 膜 細胞 層 を 用い て、17 OHP生成能獲 得機構を 推定す るた め、カルシ ウムアン タゴニス トのニフ ェジピン およびCキ ナーゼ阻害剤のH7 と 活性 化 剤 のSCー9の 効果 を 調べ た 。 その 結果、以 下のこと が示唆さ れたっ卵 黄形 成期の莢膜 細胞では 、ニフウ ジピン感受性カルシウムチャンネルから流入す るカルシウムイオンに依存性のCキナ一1rゼによりC 17，20リアーゼ活性が高く維持 さ れて い る ため 、17 OHPはほ と ん ど生 成 され ず 、 その 代 謝 物のTが 生成 され る 。し か し 、卵成熟 期の莢膜 細胞では 、Cキナーゼ が低下す ることに よりC1720 リ アー ゼ 活 性が 低 下 する た め、17ロOHPが 生成される ようにな る。莢膜 細胞で 生 成 さ れ た17 OHPは 穎 粒 膜 細 胞 に 局 在 す る20 ilーHSDに よ り 卵 成 熟 誘 起 ホ ルモ ン で あるDHPヘ 変換 さ れる 。 す なわ ち、卵濾 胞組織に おける卵 成熟誘起 ホ ルモ ン 生 成能は、 莢膜細胞 におけるCキナーゼ活 性の低下 に起因す る17ロOHP 生 成 能 の 出 現 お よ ぴ 顆 粒 膜 細 胞 に お け る20pーHSD活 性 化 によ り 獲得 さ れ る ものと推察された。
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学位論文審査の要旨 主査 教 授 山内晧平 副査 教 授 原 彰彦 副査 助教授 上田 宏
学 位 論 文 題 名
硬骨魚類の卵成熟誘起ホルモンの同定と 生成機構に関する研究
魚類も他の脊椎動物同様、多くは有性生殖を行なうが、人為的環境下では、産卵 および受精が困難な魚種も少なくない。こうした問題を解決するためには、魚類を 生物学的によく理解することが必要である。特に、配偶子形成機構、すなわち、卵 と粃子が作られるしくみを理解することは魚類の成熟、産卵および受粘を人為的に 統御する上で極めて重要なことである。
一般に、魚類の卵巣中では、卵のもとになる卵原細胞が体細胞分裂による増殖の 後、卵母細胞となり、卵黄などを蓄積して著しく大きさを増す。十分に成長した卵 母 細胞は、 脳下垂体 から分泌 される生 殖腺刺激 ホルモン（GTH）の作用 により卵 濾胞組織で生成された卵成熟誘起ホルモンの刺激により卵成熟を完了し、排卵され て受精可能な卵となる。゛魚類では、卵成熟誘起ホルモンはステロイドホルモンであ ると予想されていたが、その化学的同定は行なわれていなかった。そこで、本研究 では、魚類の卵成熟誘起ホルモンの同定を行なうとともにその生成機構を詳細に調 べた。
本研究では、まず、アマゴ、ヒラメ、マダイおよびニホンウナギを材料にして、
卵成熟に伴う形態変化を調べた。その結果、アマゴの卵成熟は他のサケ科魚類同様 成熟途中卵門付近に移動してきた核が明瞭に観察されることと黄色不透明な細胞質 が黄色透明になることで外観から容易に確認することができた。ヒラメおよびマダ イで は、両種 とも卵成 熟開始後 約3ー4時間 で油球お よぴ卵黄球の融合と核移動が 姉 ま り 、 約15ー16時 間 後 に は 核 崩 壊 が 起 こ り 、 約18ー20時 間 後 に は 卵 黄 が 完全に融合して透明化するとともに、吸水により卵径が急増した。ニホンウナギの 卵成熟過程は、形態変化などヒラメやマダイとぃくつかの点で異なっていたが、卵 成熟の判定は容易であった。以上のように、魚類の卵成熟は核崩壊や細胞質の透明 化 を 指 標 に す る こ と に よ り 、 そ1の 判 定 が 容 易 に で き る こ と を 示 し た 。 次 に、卵成 熟期のア マゴの濾 胞組織付 きの卵母 細胞をGTHとと もに培養 し、そ の培養液中から卵成熟誘起ホルモンの精製と同定を行なった。培養液を抽出後、逆 罰1カ ラムを川 いたI5述液体クロマトグラフイーにより20画分に分離精製した。こ れら の両分の 卵成熟誘 起活性を 調ベ、唯 一活性が あった第10画分を薄層クロマト
′ ／ ラフ イ ー によ り 純｜ 吊 で ある こ とを 確 認 した 。 こ の第10画分と17a，20ロ
tlihydlIoxy．41．pregnn131011e（DHP）の合成｜W｜を質：廿分巾tした紺f氷、全く1司様の質 量 ス ベ ク ト ル を 示 し た 。 ま た 、 様 々 な 合 成 ス テ ロ イ ド の 卵 成 熟 誘 起 活 性 を 調べ た 結 果 、DHPが 最 も 高 い 卵 成 熟 誘 起 活 性 を 示 し た 。 以 上 の 結 果 か ら 、 ア マ ゴ の 卵 成 熟 誘 起 ホ ル モ ン は 、DHPで あ る こ と を 脊 椎 動 物 で は 世 界 で 初 め て 化 学 的 に 同 定 し た 。 さ ら に 、 ニ ホ ン ウ ナ ギ に つ い て も 、 同 様 な 実 験 を 行 な い 、 ニ ホ ン ウナ ギ の卵成熟誘起ホルモンもDHPであることを同定した。
次 に 、 本 研 究 で は 、ニ ジマ スの 卵濾 胞組 織が 外側 の莢 膜お よび 内 側の 顆粒 膜糸nl 胞層に分離できることを 利J1亅して、卵成熟誘起ホルモン生成に関わる荊‖胞内´1竹報 伝 達 系 の 詳 細 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、 GTH刺 激 に よ る 莢 膜 細 胞 で の 17
・hydroxyprogesterone（17dOHP） 生 成 に は カ ル シ ウ ム （Ca） ― カ ル モ ジ ュ リ ン 系 お よ び 細 胞 内pHが 関 与 し て お り 、Ca゜ ジ ア シ ル グ リ セ ロ ー ル 依 存 性 斑 白 質 燐 酸 化 酵 素 （Cキ ナ ー ゼ ） は 不 活 性 化 状 態 に あ る 方 が よ ぃ こ と を 示 唆 し た 。 さ ら に 、 GTH刺 激 に よ る 顆 粒 膜 細 胞 で の ス テ ロ イ ド 20p水 酸 基 脱 水 素 酵 素 （20 p一HSD） 活 性 化 に もCa− カ ル モ ジ ュ リ ン 系 お よ び 毒lIl胞 内pHが 関 与 し て お り 、Cキ ナ ー ゼ は 適 度 に 活 性 化 さ れ て い る こ と が 必 要 で あ る こ と を 示 唆 し た 。 こ の よ う に 、GTHの 作 用 も 細 胞 に よ り 異 な る と と も に 、 糸uI胞 内 の 情 報 伝 達 系 も 極 めて複雑であることが明らかになった。
莢 腆 細 胞 は 、GTHの作 川に より 卵黄 形 成期 にtまエ スト ロゲ ンの 前 丐｜ ｛体 であ る testosterone（T） を 、 卵 成 熟 期 に は17aOHPを 糾： ．成 する 。こ れ は莢 嶼荊II胞 に お け る ス テ ロ イ ド 生 成 系 がT生 成 系 か ら17 OHP爿 こ 成 系 に 転 換 す る こ と を 示 し て い る が 、 こ の 転 換 機 構 は 全 く わ か っ て い な い 。 本 研 究 で は 、 ニ ジ マ ス の 卵黄 形 成 後 期 お よ び 卵 成 熟 期 の 莢 膜 細 胞 層 を 月 亅 い て 、17 OHP生 成 能 獲 得 機 構 を 推 定 す る た め 、Cキ ナ ー ゼ 阻 害 剤 と 活 性 化 剤 の 効 果 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、 以 下 の こ と が 示 唆 さ れ た 。 卵 黄 形 成 期 の 莢 膜 細 胞 で は 、Cキ ナ ー ゼ に よ りC17120リ ア ーゼf舌 性 が 高 く 維 持 さ れ て い る た め 、17aOHP は ほ と ん ど 生 成 さ れ ず 、 さ ら に 代 謝 さ れ たTが 生 成 さ れ る 。 し か し 、 卵 成 熟 期 の 莢 膜 糸EH胞 で は 、Cキ ナ ー ゼ が 低下 す る こ と に よ りC17・20リ ア ー ゼ 活 性 が 低 下 す る た め 、17ロOHPが 生 成 さ れ る よ う に な る 。 莢 膜 細 胞 で 生 成 さ れ た17 OHPは 顆 粒 膜 細 胞 に 局 在 す る20pー HS Dに よ り 卵 成 熟 誘 起 ホ ル モ ン で あ るDHPヘ 変 換 さ れ る 。 す な わ ち 、 卵 濾 胞 糾 織 に お け る 卵 成 熟 誘 起 ホ ル モ ン 生 成 能 は 、 莢 膜 細 胞 に お け るCキ ナ ー ゼ 活 性 の 低 下 に 起 因 す る17aOHP生 成 能 の 出 現 お よ び 顆 粒 膜 ネ 刪 包 に お け る20pー HSD活 性化により獲得されるものと推察された。
上 述 の よ う に 、 本 研 究 で は 、 魚 類 の 卵 成 熟 誘 起 ホ ル モ ン を 脊 椎 動 物 で は 世界 で 初 め て 化 学 的 に 同 定 し 、 そ の 生 成 機 構 を 詳 細 に 調 べ た 。 こ れ ら の 結 果 は 、 魚類 の 成 熟 お よ ぴ 産 卵 を 人 為 的 に 統 御 す る た め の 極 め て 重 要 な 知 見 を 提 供 し た も のと し て 高 く 評 価 さ れ 、 本 論 文 が 博 士 （ 水 産 学 ） の 学 位 請 求 論 文 と し て 相 当 の 業 績で あ ると認定した。
