博 士 （ 医 学 ） 宮 坂 知 宏
学位 論文 題 名
Molecular analysis of mutant and wild‑type tau deposited in the brain affected by the FTDP‑17 R406W mutation ．
(R406W 変異をもつ前頭側頭型痴呆患者脳に蓄積する野生型，
変異型夕ウの分子解析）
学位論文内容の要旨
神経原線維変化（neurofibrillarv tangle：NFT)はアルツハイマー病など多くの神経変 性疾患 において 、神経細 胞内に 形成され る不溶性の構造物である。NFTの脳内分布が神 経細胞 脱落の部 位と一致 するこ とから、NFTと神経細胞死の間に密接な関係があると考 えら れ て いる 。NFTは 、 超 徴形 態 的 には2本の より合 わさった 線維（paired helical filament：PHF)からなり 、サル コシルな どに対 し不溶性 を示す。PHFの 生化学的 解析 により、その主要な構成成分は、微小管結合蛋白のーつであるタウが異常にりン酸化され たもの であるこ とが明ら かとな っている 。これらのことから、夕ウの不溶化、PHF形成 を 伴 う 異 常 が 神 経 細 胞 死 を 引 き 起 こ す 重 要 な 経 路 で あ る と 考 え ら れ て い る 。 Frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17 (FTDP―17) は、常染色体優性遺伝を示す疾患であり、特徴的な病理学的変化として神経細胞の脱落と、
神経 細 胞 内、 ときに グリア細 胞内にNFT形成 が見ら れる。近 年、これ らのFTDPー17家 系でタウ遺伝子上に多くの種類のェクソン型、イント口ン型変異が発見され、夕ウと神経 細胞死の関係を解明する上で鍵を握る疾患として注目されている。エクソン型変異のほと んどは 、夕ウの 微小管結合領域およびその近傍に位置し、in vitroでの解析からその一 部は、 夕ウの微 小管重合能に影響を与えると考えられている。FTDP−17の患者ではその 変異型の違いにより様々な臨床症状、病理像を示すことが知られている。エクソン型変異 の中 で もR406W変異 は 発 症が50歳代 後 半 と遅 く 、 痴呆 の 進 行も 十 数年 かかるこ とが 知られ ており、 遅延型変 異と考 えられて いる。また、R406W変異脳では、アルツハイマ ー 病 脳 と 同 様に 、 多 数のNFTが 存 在 す る。 こ れ まで の 研 究か らR406W変異 は タ ウの 微小管 重合能に は影響は 与えず 、PHF形 成能も野生型と同等であると考えられている。
また、 培養細胞 を用いた 系では 、R406W夕 ウは野生型に比べ、リン酸化されにくいこと が報 告 さ れて いる。 しかし実 際の患 者脳にお けるR406W夕ウの 性質、 動態につ いては 不明で あり、こ の変異の細胞死への影響については明らかではない。そこでわれわれは R406W脳 より得ら れた可 溶性画分 、サルコ シル不溶性画分中の野生型、変異型夕ウの存 在比、およびそのりン酸化状態について、夕ンバク化学的、免疫化学的手法を用い解析し た。
2例 のR406W脳 （ 症 例1：70歳 、 男 性 ： 症 例2：71歳 、 女 性 ） は オ ラ ン ダ ブ レ インバンクより供与された。死後時間はともに約5時間半であった。両症例とも、生前高 度の 痴 呆 を呈 してお り、夕ウ 遺伝子 上にR406W変異が あること が確認 されてい る。は じめに 、合成ベ プチドを 抗原と して野生 型夕ウ、R406W変異夕ウを特異的に認識する抗 体を 作 製 した 。 こ れ ら抗 野 生 型、 抗406W変 異型 抗 体 を用 い 、R406W脳よ り調製し た サルコシル不溶性画分を、ウェスタンブ口ット法により解析した。その結果、サルコシル
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不溶性画分には野 生型、変異型夕ウがほぼ等量比で存在していることが明らかになった。
この結果をさらに 確認するため、夕ンパク化学的手法を用いて解析をおこなった。これま で に 、 私はR406W変異 型夕 ウと 野生 型夕 ウは 逆相 ク□ マト グラ フイ ー （RP―HPLC)で 分 離 可 能で ある こと を見 出し てい た。R406W患者 脳よ りPHF中に 含ま れる 不溶 性夕 ウ (PHF夕 ウ） を精 製し 、脱 リン 酸化 後RP―HPLCで展 開す ると 、野 生型 、変 異型 夕ウ と 思われるピークが ほぽ等量得られた。さらにこれらのピークをりシルェンドベプチダーゼ (AP1） で 消 化 しRPーHPLCで 展 開 し たと ころ 、406番目 のア ミノ 酸を 含む 野生 型、 変 異 型夕 ウ由来のべブチ ドがほば等量得られることが明らかになった。っぎに、R406W患 者脳における野生 型、変異型夕ウの局在を、免疫組織学的手法により検討した。それぞれ のタウを認識する 抗体をアフイニティー精製し、二種類の螢光色素で直接ラペルした。
R406Wの バラフィン包埋切片をこれらの抗体で二重 染色し、共焦点レーザー走査螢光顕 微 鏡下 で観察したとこ ろ、野生型、変異型夕ウは同一のNFTに共存していることが明ら か とな った 。以 上の 結果 より 、R406W脳 では 野生 型、 変異 型夕 ウはともに不溶性画分 (PHF画分）に蓄積 し、それらの比はほぼ1：1であることが明らかとなった。っづぃて、
可溶性画分のタウ について同様に検討したところ、野生型、変異型夕ウの量に明確な差は 認 め ら れ な か っ た 。 ま た 、 そ れ ぞ れのmRNAの発 現量 を、 定量 的RTーPCR法を 用い て 検討したところ、 明確な差は認められなかった。
次い でR406W脳 にお ける タウ のり ン酸 化に つい て検 討し た。 夕ウはりン酸化される と、電気泳動上の 移動度が遅くなることが知られている。可溶性画分のタウについて、脱 リン酸化後ウェス タンブ口ットをおこなったところ、野生型夕ウは脱リン酸化による明確 なパンドのシフ卜 が認められた。これに対し、変異型夕ウはこの様なバンドのシフ卜は認 められなかった。 このことから、可溶性画分中では変異型夕ウは野生型夕ウに比べ、リン 酸 化さ れにくいことが 明らかとなった。っづいて、R406W脳不溶性画分中に蓄積する野 生 型、 変異 型夕 ウの りン 酸化 状態 について検討し た。PHFーtauを精製後、RP―HPLCを 用いて野生型と変 異型タウを分離し、数種の抗リン酸化夕ウ抗体を用いたウェスタンブ口 ッ トを おこ なっ た。 その 結果 、R406W脳 に沈 着す る変 異型 夕ウ は、野生型と同様に高 度にりン酸化され ていることが明らかとなった。
本 研 究 に よ りR406W変 異 脳 で は 野 生 型 、 変 異 型 の タ ウ が ほ ぽ1：1の 比 でNFTに 組 み込 まれていること が明らかになった。このことから、R406W変異夕ウは野生型とほ ば同等の蓄積速度 であるか、あるいは野生型、変異型夕ウが特異的な1：1の複合体を形 成 し、 それ が単 位に なりPHFが 形成 され る可 能性 が考 えら れる 。また、可溶性画分で は りン 酸化 され にく いR406W変 異夕 ウが 、不 溶性 画分 中で は高 度にりン酸化されてい る こと は、R406W変異脳における神経細胞死の過程 に、強いりン酸化の亢進状態が関与 していることを示 唆している。
と こ ろ で 、FTDP―17の 中 で こ のR406W変 異 と 対 比 さ れ る も の と し てP301L変 異 が 知ら れている。P301L変異は臨床上早期に発症し 、進行も速いことから、促進型変異 と いえ る。 このP301L変異 脳を もち いて 、同 様に 特異 的抗 体を 用いた解析を行ない、
P301L脳 では変異型夕ウのみが蓄積しているという 結果を得ている。このような変異に よるタウ蓄積様式 の違いを明らかにすることは、各変異の細胞死に対する影響、および FTDP− 17家 系 間 の 多 様 性 を 理 解 す る 上 で 重 要 で あ る と 思 わ れ る 。
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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 田 代 邦 雄 副 査 教 授 長 嶋 和 郎 副 査 教 授 石 橋 輝 雄
学 位 論 文 題 名
IVIolecular analysis of mutant and wild‑type tau deposited in the brain a 抂 eCtedbytheFTDP ・ 17R406Wmutation ． （ R406W 変 異 をも つ 前頭 側 頭型 痴 呆 患者 脳 に蓄 積 する 野 生型 ， 変 異 型 夕 ウ の 分 子 解 析 ）
Frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17 (FTDP − 17) は、常染色体優性遺伝形質を示す神経変性疾患であり、その脳に はneurofibrillary tangle (NFT) な どのタウ封入体が認められる。FTDP ― 17 の中から 、夕ウ遺伝 子上に多く の種類のエクソン型、イント口ン型変異 が発見されており、夕ウの機能異常と封入体形成、および神経細胞死の関係 を解明する上で鍵を握る疾患と・して注目されている。中でもP301L 、R406W 変 異 は 臨 床 上 特 徴 的 な 表 現 型 を有 す るも の とさ れ てい る 。 本研 究 では FTDP ←17 変異夕ウの不容化、蓄積への関与について解明する目的で、R406W 、 P301L 変異 脳より得られた可溶性画分、サルコシル不溶性画分中の野生型、
変異型夕ウの存在、およびそのりン酸化状態について、夕ンパク化学的、免 疫化学的手法を用い解析した。
はじめに合成ベプチドを抗原として野生型夕ウ、変異型夕ウを特異的に認 識する抗体を作製した。これらの抗体を用い、ウエスタンブ口ット法により 解析した 結果、R406W 脳より調製したサルコシル不溶性画分には野生型、変 異型夕ウがほぼ等量で存在していた。さらに共焦点レーザー走査顕微鏡を用 いた螢光 二重染色法による解析の結果、野生型、変異型夕ウは同一のNFT に 共存して いた。以上より、R406W 脳では野生型、変異型夕ウはともに不溶性 画分 (PHF 画 分） に 蓄積 し 、そ れ らの比はほ ぼ1 ：1 である という結諭 を得 た。次い でR406W 脳に おけるタウ のりン酸化 について解 析したとこ ろ、可 溶性画分のタウでは変異型夕ウは野生型夕ウに比べ、リン酸化されにくいこ とを明ら かとした。さらに、R406W 脳に沈着する変異型夕ウのりン酸化につ いて検討したところ、野生型と同様、高度にりン酸化されていることを明ら かとした。
また、P301L 変異脳についても同様に、特異的抗体を用いた検討を行った。
その結果 、P301L 脳より得られたサルコシル不溶性画分では、変異型夕ウの みが蓄積していた。また、免疫組織化学的解析の結果、変異夕ウのみがタウ 封入体に 存在していた。さらに、P301L 脳の可溶性画分について検討したと ころ、変異夕ウが選択的に減少していた。これに対し、野生型、変異型夕ウ
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