149 香川大学農学部学術報告 第28巻第60号149〝155，1977
フクル酸エステルのテトラヒメナ増殖抑制作用
芳沢 宅実，寺浦 優，諸岡 信一
INHIBITORY EFFECT OF PHTIiALIC ACID ESTERS ON
MULTIPLICATION OF A PROTOZOAN，7ba砂menaAyrifbrmi5W
TakumiYosHIZAWA，MasaruTERAURAandNobuichiMoROOKA
Theinhibitorye仔bctof18kindsofphthalicacidesters（PAE）on7セIrLa砂menaAyrifbYmisW
WaSinvestlgatedwithfbllowlngreSults；
1）ThccytostatictoxicitywasobscrvcdinPAEhaving・aalkylchainofCltOC；initsalcohol
moiety，amOngthose di・nPbutylphthalate and di・isobutylphthalateinhibited the growthof
thccellscompletelyattheconccntrationof50／Lg／mlorhigher・Amoderatetoxicitywasshown
in di−n−PrOpylphthalate）di−isopropylphthalate）diallylphthalatc）di−n−butoxyethylphthalate，
benzyln−butylphthalateandn−butylphthalyln−butylglycolate‖ ThcseresultssuggeStthatabutyl
orananalogousgroupinthealcoholmoietymayhavesomccharacteristicc鮎ctsonsuchcyto−
toxICltyOfPAE・2）Theparal1clrdationshipbctwecnpenctrationofPAEintothecellsanditshydrophobicity
wasobserved，butthedcgrccofcytotoxICltyOfPAEdidnotcorrelatebothwithitspcrmCability
into thc cells andits conccntrationin thc cclls．
原虫Tも加んγ〝lβ乃α♪γr的′7乃よ5W株に対する各種フクル酸エステル（PAE）の増殖抑制作用を，化学構造をらびに 原虫細胞へ・の透過性との関連から検討した． 1− 各種PAEのアルコーー・ル部炭素数1∼8のホモジエステル型に毒性が示され，DBPをピークとする化学構造一 毒性相関が認められたブチル基を部分構造とするヘテロジエステル型にも毒性が示されたことから，活性発現にプ チル基もしくはこれと同程度の大きさの基を宥するアルコ・−ル部の有意性が示唆された巾 2．PAEの原虫細胞内への透過性は，PAEの脂溶性と相関を示した．しかし，透過性と毒性，あるいは細胞内濃 度と毒性の相関性は認められなかったり BBPおよびBPBGでは原虫による著明を代謝分解が推測された． 緒 ロ フクル酸エステル（以下PAEと略記）はプラスチックの可塑剤として汎用され，年々増産の傾向にあり，近年で は米国で年間約40フぎトン，日本でも約32万トン生産されているい その中でもジー2−エチルへキシルフクレートとジー 柁→・プチルフクレートの2種で全体の約70％が占められている． 従来，PAEの急性，亜急性，および慢性毒性は−・般に低いとされ（1），1972年末まではチエー・インガム用食品添加 物として使用されていたが，塩化ビニル製品用可塑剤，ノーカー・ボン紙用溶媒などを通じて環境へ・流出する結果，河 川，湾，湖などの環境汚染物質として問題となっている（Z）…最近では魚類（3），人間の臓器（4）からPAEが検出される をど，生体汚染の面でも注目されている… また近年，米国において増加しつつあるショック肺の原因は，医療用具に 広く使われている塩化ビニル樹脂からPAEが血中に溶出したことによるのではをいかという推測（5）や，ラソトや鶏 胚におけるPAEの催奇形性の誘発（6・7）が報告され，その毒性について再検討が加えられている．さらにPAE投与 によるラット肝臓肥大，肝臓グリコーゲン盈の減少（る），あるいはマウス肝細胞の空胞変性，尿細管上皮細胞の退行性
芳沢 宅実，寺浦 俊，諸岡 信一 香川大学農学部学術報告 150 変化が認められる（ひ）．そこでPAEの作用機序の解明，細胞毒性学的研究等が必要とされるn PAEの細胞毒性につ いては，鶏胚∴し細胞ならびにラット神経細胞をどに限られており（10ト（12），細胞毒性の生化学的研究についてはまだ 多くの問題点を含んでいる現状である． 著者らはこれまでに，若干の環境汚染化学物質の毒性学的究明を，それらの原虫細胞静性の面から追究してきた が（1B） ，本報では，各種PAEによる原虫7セれ‡々γ∽e乃α♪γγゆ7∽去5Wの増殖抑制作用，およびテトラヒメナ細胞への 移行について検討したのでその結果を報告する小 をお本報告の−・部は，日本食品衛生学金策27回学術講演会（1974年5月，東京），および第31回学術講演会（1976 年5月，東京）で発表した． 実験材料および方法 1．原 虫 本研究室保存の乃￡γαゐγ∽β乃α♪γrゆγ・∽≠ゞW株をプロテオーズ・ペプトン培地（14）（以下PYD培地と略記）および 完全合成培地（基本培地A）（15）を用い，pH65，260Cで前培養して使用した．細胞数は074％ホルマリンーブリリ アントダリ、−ン溶液で国定後，Fucks−Rosental血球計路盤で計数した。 2．供託フクル酸エステル 使用したPAEとその略号は次のようであるジメチル17クレー・ト（DMP），ジエチルフタレ‥−・ト（DEP），ジーn−プ ロピルフタL／1−・ト（DPP），ジイソプロピルフタL／・−ト（DIPP），ジアリルフタレー・ト（DALP），ジーn−ブチルフクレー・ ト（DBP），ジイソプチルフクレート（DIBP），ジアミル17クレート（DAMP），ジプトキシュチルフクレート（DBEP）， ジオクチルフタレーIト（DOP），ジr2−エチルヘキシル7タL／1−・ト（DEHP），ジノエル7タL／l−ト（DNP），ジイソデシ レ一斗（DIDP），ジトリデシルフタレ−ト（DTDP），ベンジルブチルフクレート（BBP），プチルフクリルプチルグ コレート（BPBG），0一フクル酸（PA）いいずれも東京化成工業株式会社の市販純度の製品である巾 モノ一花−ブチルフタ レ・−11・（BP）はDBPをKOHで部分加水分解して調製した．各PAEは，N，N岬ジメチルホルムアミドに溶解して から，025％Tween80溶液を用いて所要濃度とした． 3．増殖抑制試験 1）細胞致死作用 各種PAEの化学構造の違いによる毒性の比較を検討するために，所要濃度のPAEを作用さ せた後，3時間と24時間後のテトラヒメナ・を検鍵観察し，遊動性と細胞変形の有無から，PAEの致死作用をみた‖ 2）細胞増殖への影響 PYD培地で12時間培養した増殖初期，および24時間後の増殖期の細胞に所要濃度のDBP を作用させ，細胞増殖を経時的に観察した．また完全合成培地でも同様の試験を行をい，培地組成の違いによる抑制 の相異を検討した小 さらにPYD培地で前培養した細胞にDBP（25FLg／ml）を10∼30分間作用させ，直ちに無機塩溶 液（14）で細胞を洗浄し，次いでPAE無添加のPYD培地に移した後，細胞増殖を観察して増殖回復を検討した． 4．PAEの細胞への移行 PAE（1FLg／ml）を作用させ，12時間および24時間後の培養液をSchemeに示す方法で処理し，培地と細胞内のPAE をガスクロマトグラフィー・で定盤分析し，供試PAEの培地中の減少率および細胞内への移行率を求めた．ガスクロ マト分析条件：電子捕獲型（68Ni）検出器付ガスタロマトグラフ（日本電子JGC−20K塾）；内径3mmx長さ1mステ ンレスカラム；カラム充填剤，3％siliconeOV−lon80−100meshGaschromQ；N2ガス流盈，30ml／min，50ml／min， 60ml／min；カラム温度，160◇C，210OC，内部標準物質，dieldr・in，aldrin，P，P’−DDT 本方法による培地および細胞抽出物に添加したPAEの回収率は100士10％であった．
第28巻第60号（1977） フタル酸エステルのテトラヒメナ増殖抑制作用 Exponcntiallydividing7セIra砂7Tle71aCells 151
filtcrcdwithaglass6bcrpaper
（poresize，1／∠） l medium washedwithsaltsolution（pH65） cxtractcdwithCHCl8−MeOH（2：1，V／v） cxtractcd with 柁＿hexane CHC18−MeOHlayer cells aqueouslayelhexanelayer concentrated dissoIvcdin n−hcxanc conccnとratcd 〃Jこ■（Jく■J．（） COlumnchromatog工aphy FloIisil（60to80mcsh）5g（1×215cl−1） 1）15％cthcrin乃−hexane（60ml） 2）5％EtOHinn−hexane（60ml）l ether−hexane elutae
EtOH−hexane eluate concentIatedよJ∼〃αC〟0 gas−1iquidchromatography ECDMGLC 3％OV■lonGaschromQ（80to100mcsh） stainlessstecIcolumn（1mx31TllnildI） SCHEME Separation叩dqualュtitationofphthalica｛idcstcrsintheincubation mediし1111and乃血ゆ職制Cells 実 験 結 果 1．PAEの化学構造と原虫毒性 17種のPAEをらぴに0川7クル酸のテトラヒナ・メに対する細胞致死作用をTablelに示した．アルコール部の炭 素数1∼13個のホモジエステル塑のうちアルコール部炭素鎖1∼8個をもつPAEに毒性が認められ，炭素数4個の DBPをピークとする毒性パターンが示された．DPPとDIPP，DBPとDIBPにそれぞれ同程度の毒性がみられるこ とから，アルコール部の部分構造が直鎖状と分枝状の炭素鎖の間には著しい毒性差はをいと思われる．一・方，プチル 基をェトキシ基の先に導入したDBEPでは，炭素鎖が長いにもかかわらずDBPに匹敵する活性があり，またPAE の置換基の−・方をプチル基に固定したヘテロジエステル型のBBP，BPBGにも毒性が認められた半エステル型の BP，DBPの加水分解生成物であるPAおよびブタノールには全く毒性が認められなかった． 2．PAEのテトラヒメナ細胞への移行 テトラヒメナ培養液中のPAEの減少率をFig小1に示した．培地中の各PAEは細胞増殖（12時間，約104細胞／ml； 24時間，約5×104細胞／1111）に伴って減少しているu 化合物間の細胞透過性についてみると，アルコール部の炭素 数が増すにつれて培地濃度も減少しており，培地から細胞への移行がPAEの脂溶性に概ね依存するこ．とが示され た． 一・方，毒性が比較的強いDBP，DIBPおよびDBEP，アルコー・ル部炭素鎖が長く毒性が微弱であるBBP，BPBGお よびDEHPの6種の細胞内への移行をみると（Table2），DBP，DIBPおよびDBEPは24時間後でも培地と細胞内か らほぼ完全に回収されたが，BBP，BPBGおよびDEHPの24時間後の回収率はそれぞれ31％，4％および72％であ り，原虫による代謝分解が考えられた．また，細胞内のPAE濃度と毒性の間には相関は示されをかった． 3．DBPのテトラヒメナ増殖抑制作用 DBPのテトラヒメナ増殖抑制作用をFigh2，Fig”3およびFigl4に示した。増殖初期（12時間培養，103細胞／ml）芳沢 宅実，寺浦 優，諸岡 信一 香川大学農学部学術報告 Tablel．RelationshipbctweenstructuresofPAEandtheirtoxiciticstonormal1ydividing7セtra砂menacells 152 Growthinhibition at thcindicatedconccntration 1 10 25 50 100 200（〃g／ml） C8H4（COOR）2 CHき C乏H5 CさH7 CH（CH8）2 CH2CH＝CH2 CoH9 CH9CH（CH＄）2 C5Hll C9H40C4H9 C8Hll CH2CH（C2H5）C4H9 C9H19 （CH2）6CH（CH8）2 C18H27 C4H9，CH望C6H5 CdH9，CH2CO2C4H9 C4H9，H H，H ±士仲川付Ⅲ川村川士一一一一村里一一
冨還藍還DNP器BBP㌘
∬一一一一士一一W一一一一一一一一一 一一一仙 士＋士“土一l一l一一一l一 一一±士土榊榊一土一t一一一一一一一 一土＋仲井附榊士小一︼一一t ＋圭一l j＝and＋indicatethatsomeprotozoandicdafter24hrand3hr，reSPCCtivelyL：［and榊indicate thatallprotozoandicdafter24hrand3hr，rCSpCCtivclyn％DecreaseofPAEfrommedium
50 100 OMP DEP DPP DIPP DALP D8P D旧P DAMP D8EP DEHP DNP BBP BPBG Figい1Penetrationofvariousphthalicacidesters（PAE）into7壱tra砂TTWna cells．PAE（1FLg／ml）was added to PYD medium（2％proteose− PeptOneSワpPlementedwithO”5％yeastextractandO・8％dextrose）andremalnlngPAEinthe medium was determined bygas−1iquid
chromatographyafter12hr（［コ）and24hr（■）一第28巻第60ぢ（1977） フタル酸エステルのテトラヒメナ増姐抑制作用 153 Tablc2．PcrmcabilityofPAEintonormallydividing7blYa砂′ne，laCC11s PAEreCOVered（％） Medium PAE 9 4▲ ︵ヨ 2 4 1 0 9 9 7 3 ∩︶ 7 1 8 3 7 0 8 0 7 ■・1 8 7 0U 8 4 2 4 5 3 2 3 1 2 6 5 8 2 7 5 5 6 3 1 3 2 1 1▲ 2 ︻．〇 5 0 1 2 0 5 2 1 7 1 7 6 6 9 6 1 6 DBP DIBP DBEP DEHP BPBG BBP
PAE（1FLg／ml）wasaddcdtothcPYDmcdiumandremainingPAEinbothmcdiumandcellswas
detcrmincdaftcr12hrand24hr．EachfigurcICPreSCntSthcavcragcof3separatccxpcrimcnts
および増殖期（24時間培養，10d細胞／ml）にD王‡Pを作用すると，いずれも同程度に抑制効果を示した．100〝g／mlで 増殖を完全に抑制し，低地度（25〃g／ml。50′唱／ml）でば一億時間抑制を示しその後，いずれも漸時回復した（Fig2） またDBP作用後，細胞を洗浄↓，その後の細胞増殖の回復をみると，作用時間が短かいほど回復が早いことが示さ れた（Fig．3）さらに完全合成培地にDBPを100帽／mlを添加すると約6時間増殖を抑制し，その後漸時回復した （Fig4）− （a） （b） 0 5 0 0 ︵一∈＼sニむ0︶ Lのq∈≡ニの0 1023 9 ほ 24
3 12 24 36 Incubation time（hr） Fig．2．E仔tctofdi−n−butylphthalatc（DBP）onthegrowthofnormallydividing 7blra砂mena cclls‖ DBPwasaddcdtothePYD mediumafter12hr（a）or24hr（b）ofthc stationary culture at arrowlSymboIs‥10FLg／ml（△）， 25／Lg／ml（t）），50／Lg／ml（●），100FLg／ml（□）andconuol（○）
154 芳沢 宅実，寺浦 優，諸岡 信一・ 香川大学農学部学術報告 ニ∈＼S二器︶ Lのq∈コuニの0 0 0 ︵雇＼sニ＄︶ ﹂むq∈コリニむ0 0 6 24 45 Incubation time（hr） Figl3lE批ct of short−timc exposurc of DBP
OllnOrmally dividing Turahymena cells Thcccllswas cxposcdto30FLg／mlofDBP fbrlOmin（a）and30min（b）The rc− maillillg工）BPwasrcmovcdrlomthcmcdia by washing twicc with thc salt solution， and thcn thccc11s wercincubatcdinPYD mcdia・SymboIs：○，COntrOl（not cx− Ⅰ）OSCd）；●，CXPOSCd to30／唱／mlofD】うP Withoutwashing 24 】2 Lncubation time（hr） Fig4Efrtctofdi−nrbutylphthalatc（DBP）on
thcgrowthofnormallydividingT
CCllsin thc synthcticlnCdiulTl．DBP was
addcd to thc mcdium aftcr12hr of thc
Statiol】al‘yculturcSymboIs：10FLg／ml（△）， 25〃釘1nl（①），う0／唱／ml（◎），100／瑠／ml （口）andcolltlOl（○） 考 察 PAEの化学構造一活性相関については，鶏胚ならびにL一触胞におけるPAEの分子盈と轟性の逆相関性（10）・（11），ま たラットに対する催奇形性とPAEの親水性との相関（6）等が報告されている．本研究では，DBP（アルコール部炭素 数4個）をピークとする毒性バク・−・ンが得られた．これはPAEの細胞毒性がその分子乳 脂溶性などによって一儀 的に決定されるものではないことを示している，Sugawara（17）もbrineshrimp卵に対するPAEの毒性に関して， 著者らとよく一・致する結果を得ている． PAEのテトラヒメナ細胞への移行を培地中の濃度減少からみると，PAEのアルコー・）レ部炭素鎖の長さ，つまり脂 溶性の増す方向に相関を示し，毒性との相関はみられなかったn＋−−・方，細胞内のPAE濃度については，DBP，DIBP およびDBEPは培地で減少した盈が細胞内へ移行するのに対し，BBP，BPBGおよびDEHPでは培地中で減少する にもかかわらず，細胞内濃度は極めて低いことが示された．このことば化学構造の速いにより細胞透過性に差がある ことを示唆すると共に，細胞による代謝分解の結果，細胞内のPAE濃度が減少するものと思われるlまた細胞内薬 物濃度により前述の構造一括性相関を説明しえないことを示しており，炭素鎖3∼4佃をアルコー・ル部分構造とする PAEが細胞を透過してから特別の挙動または作用を示すことが示唆される． DBPを作用した細胞を洗浄すると，その後細胞増殖が回復することからDBPによる増殖抑制作用はcytostaticな 作用型と思われる・Fig”2にみられる増殖の回復現象についてほ，回復した細胞のDBP感受性が低下しており，原 虫細胞に薬剤抵抗性が現われたものと思われる（未発表）．また原虫のPAE感受性は培地条件により著しく左右さ
第28巻第60号（1977） フグル酸エステルのテトラヒメナ増殖抑制作用 155 れ，FigAに示すごとく，完全合成培地に比べてPYD培地ではDBPの作用は約4倍強く現われており，PYD培地 成分がDPBと直接相互作用するか，あるいは細胞の薬剤感受性に影響していると思われる． 参 考 文 献 （9）太田秀夫，恩田祐行，児玉博和，山田直樹：日術 語，29，519（1974） （10）CALLEY，D一，，AuTIAN，］．，GuESS，W．L一：Jmarm ぶc哀．，55，158（1966） （11）NEMArrOLLAm，J．，GuESS，W．L．，AuTIAN，J：ibid， 56，1446（1967） （12）KASUYA，Mい：βα〃，広元最rり乃，Co乃fα∽Tb扇coJ， 12，167（1974） （13）芳沢宅実，諸岡信一・：会得誌，15，261（1974）． （14）渡辺良風 斉藤 実：続生物物理学講座4，“生 物学的技術Ⅰ”，p．154，吉岡書店（1968）． （15）DEWE、Y，Ⅴ．C．，PARKS，RE，JT一，KIDDER，G‖W∴ AγCゐいβわcβm．，29，281（1950） （16）SuGAWARA，N∴ 7も￡よcoJ4抄JPゐα門乃αCOJ．，30， 87（1974） （1976年9月30日 受理） （1）AuTIAN，．ト j肋血∽．ガeα励 旅呼βC￡よひeゞ，3，
3（1973） （2）MAYER，F．L．．Jun．，STALlING，D，L，．JoHN50N， JいL．：∧bfαγβ，238，411（1972） （3）STAILING，D．L．，HoGAN，JW，．JoHNSON，JいL∴ 麒相加元．斑融飢物砂地ぬ，3，159（1973） （4）WILLIAM，R小Fり KLAMER，B，N［KORA，R…W一： THOゝlPSON，C．R：BIL［［PLITビJ汀 DIZLq：1∫ゞ仇、 28，278（1974） （5）JAEGER，R．丁け，RtJBIN，R．J：鹿去e柁Ce，170，460 （1970） （6）SINGⅣ，AR‖，LAWRENCE，W−HりAuTIAN，J′ノ：J 朗αγ∽α．βcよ，，61，51（1972） （7）BowER，RK，HABERMAN，S‖，MINTON，PD．：J 劫α′∽αC0よ風砕乃βデリ171，314（1970） （8）山田明男：金種誌，15，147（1974）
