パン酵母と穀類の新酵素 Propioin Synthase の高速液体クロマトグラフィー による研究

Kobe Shoin Women’s University Repository

Title

パン酵母と穀類の新酵素 Propioin Synthase の高速液体ク

ロマトグラフィーによる研究

Studies on a New Enzyme, Propioin Synthase, in

Bakers' Yeast, and Cereals using High-Performance

Liquid Chromatography

Author(s)

森本 茂美（Shigemi Morimoto）

Citation

生活科学論叢（Review of Living Science）

，

No.25：1-16

Issue Date

19９4

Resource Type

Bulletin Paper / 紀要論文

Resource Version

URL

Right

パ ン 酵 母 と 穀 類 の 新 酵 素PropioinSynthase

の 高 速 液 体 ク ロマ トグ ラ フ ィー に よ る研 究

森

本 茂

美

著 者 は こ れ ま で 文 献 に 現 れ て い な い 新 し い 酵 素 を パ ン 酵 母 か ら発 見 し、propioinsynthase(プ 1∼10)9 _,10)

ロ ピオ イ ン合 成 酵 素)と

なづ け 、 学 会 に も種 々 報 告 し、 パ ン酵 母 以 外 の穀 類 の う ち、corn

_,

9110)10)10)10)

wheat,に もpropioinsynthaseが 存 在 す る こ と を 確 認 し た が 、millet,bro㎜rice,buckwheatか

ら は 、 こ の 酵 素 の 活 性 を ガ ス ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー で 検 出 し得 な か っ た 。パ ン 酵 母 か ら得 た こ の 酵 素 の 精 製 は 甚 だ む つ か し い が 、 高 速 液 体 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー に よ っ て パ ン 酵 母 、corn,wheatお

よ びmaltに 存 在 す るpropioinsynthaseの 測 定 、 精 製 を 実 験 し 、polyacrylamidegel電 気 泳 動 に よ っ て 検 討 を 加 え た 。

実

験

方

法

1.パ ン 酵 母 のpropioinsynthaseの 調 整 法 パ ン 酵 母(オ リエ ン タ ル 酵 母 株 式 会 社 製)80 gにalumina80gと 緩 衝 液Y(0.05MNa2HPO4-0.1Mク エ ン 酸,pH6.8)160mlと を 加 え た も の を 、 食 塩 を 含 ん だicebathで 冷 し な が ら1時 間 超 音 波 破 砕(60KHz,200W,TOMYUD-201ト ミー 精 工 製)し 、 つ づ い て14,000rpm(ロ ー タ ー は 日 立 、RA-5で 、 以 下 遠 心 分 離 に は こ の ロ ー タ ー を 用 い る)、0℃ で15分 間 遠 心 分 離 後 そ の 上 澄 液 を と っ て 粗 酵 素 液 と す る 。つ ぎ に こ の 酵 素 液  ラ を精 製 す る が 、 そ の 方 法 は 別 報 と 同 様 で あ る 。 得 ら れ た 酵 素 液 は 一50℃ で 保 存 す る 。 以 下 種 々 の 酵 素 液 を 調 整 した が 何 れ も 同 様 に 保 存 す る 。 2.酵 素 活 性 測 定 法 緩 衝 液A(0.52mMMgSO、 、0.62mMthiaminepyrophosphate、0.26 mMFeSO4、2.6mMMnSO4、10mMMercaptoethano1を 含 ん だ0.16MNa2HPO4-0.031Mク エ ン 酸 、pH6.8)20∼400μ1、 酵 素 液10∼200μ1、propionaldehyde1∼20μ1即 ち2:1:0 _{.1の 比} 率 に 混 合 、37℃ の 定 温 で30分 振 盟 後 沸 騰 水 中 で 約30秒 加 熱 し て 酵 素 反 応 を とめ 、冷 水 で 冷 却 す る 。 こ れ に 内 部 標 準 物 質 の 溶 液(500μg/mlのethylmalonateを 含 有)6∼120μ1を 加 え 、 よ く混 合 しgas-liquidchromatography(以 下GLCと 略 す)を 用 い 、propioinsynthaseに よ っ て 生 成 し たpropioinを 定 量 す る 。 そ の 条 件 は 次 の よ う で あ る 。ColumnはHyprose、 温 度 は80℃ 、carrier gasは 窒 素 ガ ス 、attenuation3、rangelO、 注 入 量 は1∼5μ1、 流 速90ml/min、 又gaschromato・ graphは 日 立163型 、 水 素 炎 イ オ ン 化 検 出 器 を 用 い て 定 量 し た 。

3.高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー(High-performanceliquidchromatography以 下HPLCと 一1一

略 す)Columnは ゲ ル 炉 過 タ イ プ のShim・packDiol150(7.9mm×25cm)、Shirn-packDiol

300(7.9mm×50cm、 島 津 製)TSKgelG-3000SW(7.5mm×60cm、 東 ソ ー 製)、 疎 水 性 を 応 用 し た TSKgelPheny1-5PW(7.5m皿 ×7,5cm)、TSKgelEther・5PWお よ び 弱 陰 イ オ ン 交 換 基 を 応 用 し たShim・packPA・DEAE(8.Omm×10cm、 島 津 製)で あ る 。 こ の 装 置 はTOSOCCPSで 蛋 白 質 の 溶 出 は280nmに よ っ てabsorbanceを 測 定 す る

。TSKgelPheny-5PWとTSKgelEther-5PWcolumnの 溶 離 液 のA液 は ど ち ら も2Mの(NH4)2SO4を 含 ん だ0,1MNa2HPO4・0.1M NaH2PO4、pH7.0の 溶 液 、B液 は0.1MNa2HPO4-0.1MNaH2PO4、pH7.0の 溶 液 で 、 こ のA 液0%か らB液100%に な る ま で30分 、つ づ い てB液100%で10分 、column内 の 蛋 白 質 を す べ て 離 溶 さ せ る 直 線 匂 配(lineargradient)で あ る 。Shim-packPA-DEAEcolumnのA液 は20mM、 Tris-HCI、pH8.0、B液 はA液 中 に0.5MのNaClを 含 ん だ 溶 液 で 、A液 か らB液 へ の 直 線 濃 度

勾 配 で あ り 、そ の 条 件 はTSKgelPheny1・5PWcolumnの 場 合 と 同 じ で あ る 。活 性 を 有 す るpeak を分 取 後centricon・30(グ レ イ ス ジ ャ パ ン 製)に 溶 離 液 を 入 れ2,800rpm、0℃ で 遠 心 分 離 し て 濃 縮 し 、 こ れ を 用 い て 酵 素 反 応 を 行 いGLCに よ っ てpropioinを 定 量 す る 。

4,Cornのpropioinsynthaseの 調 整 法 新 鮮 な 生 のcorn160gに30gのaluminaと 、100 mlの 緩 衝 液Yと を 加 え た も の をicebath中 でhomogenizer(AM-8型Nissei製)に よ っ て 15,000rpm、10分 破 砕 、14,000rpm、10分 遠 心 分 離 後 上 澄 液 を と っ て 粗 酵 素 液 と す る 。 つ ぎ に こ

の

の 液 を 別 報 と 同 様 にprotaminesulfate処 理 を し30%飽 和 の(NH、)、SO、 を加 え 、icebath中 で 約15分 掩 拝 後 、14,000rpm、10分 遠 心 分 離 、 上 澄 液 に40%飽 和 に な る よ う に(NH4)、SO4を 追 加 、 同 条 件 で 遠 心 分 離 し て 沈 澱 を得 、 こ れ に 緩 衝 液Yを 加 え て と か し 、 酵 素 溶 液 とす る 。

5.Wheatのpropioinsynthaseの 調 整 法 生 のwheat50gに30gのaluminaと 緩 衡 液Y 100mlと を 加 え ・・mと 同 様 に 処 理 し て 粗 嚇 液 を 得 る.こ の 液 の 溶 量 の 士 の2%P・ ・t・min・ ・u1-fate溶 液 を 加 えcornと 同 じ 方 法 で 処 理 を し て 上 澄 液 を 得 る 。 こ の 上 澄 液 に20%飽 和 の

(NH4)2SO4を 加 え 同 様 に 遠 心 分 離 し て 上 澄 液 を と り、こ れ に30%飽 和 に な る よ う に(NH4)2SO、 を 追 加 、 同 様 に 遠 心 分 離 し て 得 ら れ た 沈 澱 に 緩 衝 液Yを 加 え て とか し 酵 素 液 と す る 。

6.Maltのpropioinsynthaseの 調 整 法Malt25gに25gのa1㎜ina、60mlの 緩 衝 液Yを 加 えcornと 同 様 に 処 理 し て 得 た 粗 酵 素 液 をcornと 同 様 にprotaminesulfate処 理 、20%、30% 飽 和(NH4)2SO4分 別 し て 得 た 試 料 を 酵 素 液 と し て 用 い る 。 ユコ 7.Polyacrylamidegel電 気 泳 動 こ の 泳 動 はLaemmli法 に 従 っ て 行 い 、濃 縮 ゲ ル は4.5% のpolyacrylamide濃 度 、分 離 ゲ ル は7.5%に 調 整 し 、所 定 の 泳 動 用 試 料 の 蛋 白 質 の 含 有 量 を 何 れ も1mg/ml(1μg/μ1)に 調 整 し 、 そ の5∼10μ1を と っ て 定 電 流 で 泳 動 せ し め 、 常 法 に よ っ て 染 色 、 脱 色 す る 。 対 照 と し て は 分 子 量90,000のtransferrinを と り泳 動 図 を 比 較 検 討 し た 。 試 料 12) の 蛋 白 質 はBradford法 で 定 量 し た 。 電 気 泳 動 装 置 は ラ ピ ダ ス ・2連 ミニ ス ラ ブ(AE-6450型 、 ア トー 製)で 、 泳 動 の 終 っ たpolyacrylamidegelはRAPIDRY-MINI(AE・3711型 ア トー 製)を 用

い てが 靴 上 に お い て 乾燥 し保 存す る。

実 験 結 果 及 び 考 察

1.パ ン 酵 母 のpropioin8¥ntha8eパ ン 酵 母 よ り得 ら れ た 粗 酵 素 液 と そ れ をprotamino 5ulf且te処 理Lた も の 、 つ づ い て40%、60%{NH咽)￡O噌 飽 和 分 別 し た も の 、 そ う し て 燐 酸 カ ル シ ウ ム ゲ ル 〈Ca3{PO4}詔 〉 で 処 理 した も の の4種 類 の 酵 潔 液 のEPLCのchromatogramを 第1図 50 40 昌o 30 10 O O 呈 10 甥 ロ呂 $ 出 o 琶" 10 0 10 00 12尊455学 R已t已ntiolltlmロ{min〕 Fi曙.LHigh1⊇ ￠rform旦11c{聖1iqロidohromatOlgramof tlleεn把,me5011」tioロobtain㊤dfromba恥 εr5, 跨a且 し

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に 示 す 。 こ の 図 の 〔1〕 の 粗 酵 素 液 中 に は 、 こ の 条 件 に お い て 、 少 な く と も9種 以 上 の 蛋 白 質 が 存 在 し て い る の が 分 か る が 、 〔2〕のprotaminesulfate処 理 に よ っ て ① 、 ② の 高 分 子 の 蛋 白 質 が 除 去 さ れ て い る が 、 そ の 他 の 蛋 白 質 の 含 有 量 に は 大 差 が な い こ とが 示 さ れ て い る 。 〔3〕 の40%、 っ つ い て60%飽 和 の(NH、)2SO4で 分 別 し た 試 料 で は 、 ③ のpropioinsynthaseのpeakに 相 当 す る 蛋 白 質 が 大 部 分 を し め 、 可 成 り精 製 さ れ て お り、⑥ の 蛋 白 質 は 多 量 に 除 か れ て い る が ま だ 少 量 残 っ て い る こ と が 認 め ら れ る 。 〔4〕 のCa,(PO4)2gelで 処 理 し た も の で は ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ のpeakに 相 当 す る 、propioinsynthaseよ り低 分 子 量 の 蛋 白 質 が こ のCa3(PO4)2gelに 吸 着 さ れ て 殆 ん ど 残 存 し な い が 、propioinsynthaseよ り大 き い 分 子 量 の ② の 除 去 は 困 難 で 又 ④ の 蛋 白 質 が 可 成 り大 量 残 在 して い る こ とが 認 め ら れ た 。 つ ぎ に 〔1〕 〔2〕 〔3〕 〔4〕 のpolyacrylamidegel電 気 泳 動 し た 結 果 を 第2図 に 示 す 。 h・ 艸 ・a … …h ・・・…C ・… ・・d(Propioinsynthase) ・… 廿e 〔5〕 〔1〕 〔2〕 〔3〕 〔4〕 Fig.2.Polyacrylamidegelelectrophoresisoftheenzyme solutionobtainedfrombakers'yeast. 〔1〕Crudeenzymesolution〔2〕Protaminesulfatetreatment 〔3〕Ammoni㎜sulfateppt(40,60%saturation) 〔4〕Ca3(PO4)2treatment 〔5〕Transferrhld…Propioinsynthase

第2図

のa,b,cのbandの

蛋 白質 の分 子 量 の大 き さ は 、 一 般 的 にaが 最 大 でb,cの

順 と考 え

られ る の で 第1図

の ① ② のpeakの

蛋 白 質 はa,b,cのband中

の2つ の に相 当 す る と考 え ら れ 、

精 製 す る こ とに よ って 比 活性 を高 く して 蛋 白質 濃 度 が 大 き くな っ たbandと

して はdbandが

認

モ 

め ら れ た 。別 報 で のpropioinsynt拍 駝 の 分 子 量:は100、OOOで あ り、t珀n8fErrinの _{分 子 量 は90 ,000} で あ る こ と よ 「,、こ のdb呂11dの 蛋 白 質 が 畔opioin5yntha50で あ る と 雛 定 さ れ た 。eのba醐 は 〔2〕 の 泳 動 図 で 可 成 り 襖 いbandと し て 認 め ら れ る が 〔5〕 の 泳 動 図 に ほ 殆 ど認 め ら れ な い の で 已のbandは 第1図 の ⑥ の 蛋 白 質 で あ る と推 測 さ れ る 。(N  H、)、SO,分 別 で 得 ら れ 尭 〔3〕 と さ ら にC呂3(POI)野gd処 理 し た 〔4〕 のTSKg￠lG-300⑪SWc。1㎜nに よ るHPLCのchr。mal。 ・ 嵩 口 亭 ロ 招 091奪1ε1亀 R巳t藍≡ntio11賦rim{r(min, Fjg・ 乱Hi皇h・P6rforman仁eIiq期i`ohromatogr日mof th巳 芒h躍ymo呂01utionobt且in{≡dfromb且k{r5' yεa5t.

Conditjo抑 富 〔blumn,1'5Kg償1{}・:珀O{培WFIowr邑t￠ _,1.㎞1/min I昧 忠tl。捌Olu鵬200耳1Ab蹴h』 噌,L2呂 {:葺訓 叩0曲d,踊m町1∫ 田1四T皐mPgr罰tur已,き ℃ 〔3〕Am"10ロiUlngulralεPPヒ`40.㎝%5at皿31i㎝1〕

14〕C置:`PO晶1置 嗜r舶巳m司帥t

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gramを 第3図 に 示 す 。 第1図(Shim・packDiol150column)の 〔3〕 と 第3図(TSKgel(}3000SWcolumn)の 〔3〕 の 同 じ試 料 を 用 い た も の を 比 較 し て ② 、 ③ 、 ④ 、 ⑥ 、 ⑦ 、 ⑧ 、 ⑨ のpeakは ど ち ら の 図 に も 存 在 す る が 第3図 で は さ ら に@、 ⑤ 、 ◎ 、 ④ 、 ⑥ の5種 が 検 出 さ れ 、 又 第1図 の 〔4)と 第3 図 の 〔4〕 と を 比 較 し て 両 方 と も40、60%飽 和 に よ る 分 別 後 さ ら にCa3(PO、)、 に よ っ て 処 理 し た 酵 素 液 で あ る が 分 離 能 で はDiol150よ りG-3000swの 方 が す ぐれ て い る こ と が 認 め ら れ た 。

第4図 はCa3(PO4)2処 理 さ れ た 試 料 〔4〕 か らpropioinsynthaseの 分 取 に 用 い たTKSgelG -3000SWcolumnに よ るHPLCのchromatogramで _{あ る 。 ⑪ のpeakに 相 当 す る 蛋 白質 が こ の}

Fig.4.High・performanceliquidchromatogramof theenzymesolution〔4〕obtainedfrom bakers'yeast. Conditions:Column,TSKgelG-3000SWFIowrate,1.Oml/min Injectionvolume,150μ1Absorbance,1.28 Chartspeed,10mm!minT㎝perature,5℃ Elutingsolution,0.1MNa2HPO4・0.1MNaH2PO4,pH6.8,contalning O.IMNa2SO4, 酵 素 の 活 性 を 持 っ て い る が 、 こ のpeakの ④ の 領 域 を 分 取 後 、 そ の 溶 離 酵 素 液 約2.2mlを centricon・30に 入 れ て 、2,800rpm、0℃ で 濃 縮 、TSKgelPhenyl・5PWcolumnを 用 い 、linear gradientに よ っ てHPLCに か け た 結 果 を 第5図 に 示 す 。

第4図 に お い て 分 取 さ れ た 〔A〕 区 分 に は 尚 矢 印 の 、 少 な く と も12種 以 上 の 蛋 白 質 が 含 ま れ て い る こ と を 第5図 が 示 し て い る 。 そ の う ちpropioinsynthase活 性 を 持 っ て い るpeakはreten-tiontime28.3分 の ⑫ のpeakで そ の 領 域 ③ を分 取 す る 。 分 取 さ れ た 約3mlの 溶 離 液 を 同 様 に

Fig.5.High-performanceliquidchromatogramofthe enzymesolution(fraction④inFig4)obtained frombakers'yeast. Conditions:Column,TSKgelPhenyl・5PW Injectionvolume,80μ1 Chartspeed,10mm/min Eluしingsolution,A… …Bcontaining2M(NH4》2SO4 B・・・…0.IMNa2HPOぺ0.1MNaH2PO4pH7,0 Lineargradient,AtoB Flowrate,1.Oml/min Absorbance,0.04 Temperatu祀,5℃ centricon-30で 濃 縮 、弱 陰 イ オ ン 交 換 を 行 うPA・DEAEcolumnを 用 いHPLCに よ っ て 第6図 を 得 る 。

第6図 のretentiontime12.1分 に あ ら わ れ る 大 き いpeak⑭ がpropioinsynthaseの 活 性 を 有 し て い る が 、 こ の 段 階 に お い て も 可 成 り の 種 類 の 不 純 の 蛋 白 質 が 存 在 し て い た 。

次 に 粗 酵 素 液 のTSKgelEther・5PWcolumnに よ るHPLCのchromatogramが 第7図 で あ る が 、矢 印 の12のpeakが 認 め ら れ 、 そ の う ち ⑮ のpeakの 蛋 白 質 がpropioinsynthase活 性 を も っ て い た 。つ ぎ に 第4、5図 に お け る ④ ③ 区 分 の 常 法 に お け るcentricon-30に よ る 濃 縮 液 の 蛋 白 質 を 泳 動 用 の 試 料 に 調 整 後 、 そ れ ぞ れ10μ1を と りpolyacrylamidege1電 気 泳 動 を行 っ た 結 果 を 第

8図 に 示 す 。

第8図 の 〔6〕(④ 分 画)に お い て 尚f、9、h、i、 」の5種 の 蛋 白質 が 認 め ら れ 、 そ の う ち hのbandが 第4図 の ⑪ のpropioinsynthaseで 、 第2図 のdのbandに 相 当 す る 。又 第4図 の ⑩ の 蛋 白 質 は 分 子 量 か ら考 え てgのbandに 相 当 す る と 推 測 さ れ る 。 第8図 の 〔7〕 に お い て はg、 hの2種 の 蛋 白 質 が 認 め ら れ 、hのbandが 第5図 の ⑫ のpropioinsynthaseで あ り9のbandの

蛋 白 質 は 第5図 の ⑬ の 蛋 白質 で あ る と考 え ら れ る 。 そ れ 故 に 第4図 のTSKgelG・3000SWco1・

Fig.6.High・performanceliquidchromatogram oftheenzymesolution(fraction⑬in Fig5)obtainedfrombakers'yeast. C㎝ditions:Column,Sh血 一packPA-DEAEFlowrate,1』m1/min Injectionvolome,100μ 且Absorbance,0.32 Chartspeed,2,5mm!minTemperature,5℃ Elutingsolution,A… …20mMTris-HCI,pH8.O B… …AcontainingO.5MNaCl Lineargradient,AtoB umnに よ る⑩ の 蛋 白 質 は 第5図 のTSKgelPhenyl-5PWに よ る ⑬ の 蛋 白 質 で あ る と推 定 さ れ る 。

2.Cornのpropioinsynthase新 鮮 な 生 のcornよ り得 ら れ た 粗 酵 素 液 お よ び 、protamine sulfate処 理 、30、40%(NH4)2SO4飽 和 分 別 し た 酵 素 液 のHPLCの 結 果 が 第9、10図 に 示 さ れ て

い る 。

第9図 のShim-packDiol150columnで は 矢 印 の9種 、 第10図 〔9〕 のShim-packDiol300

co1㎜nで は 矢 印 の17種 のpeakカ ぜcornの 粗 酵 素 液 に 認 め ら れ 、 分 離 能 はDiol300が す くれ て レ・ た 。 こ れ ら のpeakの う ち 第10図 の 〔8〕 のretetiontimeが11.3分 の 大 き いpeak⑰ がpropioin synthase活 性 を 持 っ て お り 、 〔9〕は 粗 酵 素 液 で そ の ⑰ の 小 さ いpeakが こ の 酵 素 で あ り 、粗 酵 素 液 をprotaminesulfate処 理 、30%、40%(NH4)2SO4飽 和 分 別 に よ っ て 著 し く精 製 さ れ て い る

こ と が 分 か っ た が 、 ま だ 可 成 の 不 純 物 が 含 ま れ て い た 。 つ ぎ に 粗 酵 素 液 をprotaminesulfate処 _{理 、 つ づ い て30、40%(NH4)2SO4分 別 し 、 泳 動 用 に} 調 整 し た 酵 素 液5μ1のpolyacrylamidege1電 気 泳 動 の 結 果 が 第11図 _{〔10〕で あ り、k、1、m} の3種 のbandが 認 め ら れnは 泳 動 用 に 用 い ら れ たbromophenolblueの 色 素 で 最 先 端 を 表 わ し て い る 。 こ の う ち1の 相 当 濃 いbandがpropioinsynthaseで 第10図 の 〔8〕 の ⑰ のpeakの 蛋 白 質 で あ る 。 第11図 の 〔5〕は 対 照 の 蛋 白 質tranferrinで _{、 そ の 分 子 量 は90 ,000で あ る か らcornの} propioinsynthaseは 相 当 高 分 子 の も の と 思 わ れ 、 お そ ら く糖 を そ の 分 子 中 に 含 ん で い る も の と

推 測 さ れ る 。kのbandも 可 成 り濃 いbandで あ る が 第10図 の 〔8〕 の ⑯ のpeakの 蛋 白 質 で あ る と 推 測 さ れ る 。

卜 ・尋 ・・・…f ...…9 1'"凸'h(Propioinsynthase) ..』.i 1. L '」+引"」 〔5〕 〔6〕 〔7〕 Fig.8.Polyacrylamidegelelectrophoresisof theenzymesolutionobtainedfrom bakers'yeast. 〔5〕Tranferrin,〔6〕 ④fractioninFig.4 (TSKgelG・3000SW),〔7〕 ⑧fractioninFig.5 (TSKgelPheny1・5PW) 拐 ロ ⇔ 自 曲 O 巳 O O

5

Retentiontime(min)

Fig。9.High-performanceliquidchromatogram thecrudeenzymesolutionobtained fromfreshcorn. Conditions:Column,Shim-packDiol150Flowrate,2.Oml!min InjecUonvolume,10μ1Absorbance,0.16 Chartspeed,10mm/millTemperature,5℃ Eluti㎎solution,10mMphosphatepH6.4,containingO.2MNa2SO4。

亡hrO皿 臼to宮r且mofth畦 from血 一{≡≡}h{:!orn. Flowra控,ユ.諺m1/1τ1in Ab5m隔ban{:駐,O.且6 T心 剛 ≡冊 「atu「曜,5囑℃ Fi9,IO.Hil基h-per王ormano芒liquid en島ymε5dutionobtainεd

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射 8 駐 缶 100 5噂 ` ■ O 】F胃ig.12.High・pe「formancoliquidchrom且t曲 屈[「amof 牝hε 亡rudeεn匪ylne呂01utionoモ}監ainedfrom wh芒 硅t.

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第12図 のShim-packDiol300columnに よ る 矢 印 のpeakは 少 な く と も13種 の 蛋 白 質 の 存 在 を 示 し 、 第13図 のTSKgelG-3000SWcolumnに よ っ て は 、 矢 印 のpeak16が _{認 め ら れ 、 これ ら} のpeakの う ち 第13図 の ⑳ のpeakはpropioinsynthase活 性 を も つ 蛋 白 質 を 含 有 し て お り_、第12 図 の ⑱ のpeakに 相 当 し 、 又 第13図 の ⑳ のpeakは 第12図 の ⑲ のpeakに 相 当 す る と考 え ら れ る 。 そ れ 故 に 粗 酵 素 液 をprotaminesulfate処 理 、20、30%(NH、)2SO、 分 別 す る こ と に よ っ て ⑲ の 蛋 白 質 が 多 量 除 去 さ れ て い る こ と が 認 め ら れ る 。 つ ぎ にwheatの 粗 酵 素 液 をprotaminesulfate 処 理 後40%飽 和 分 別 再 び30%飽 和 分 別 し た 泳 動 用 酵 素 液5μ1を と り、polyacrylamidegel電 気 泳 動 し た 結 果 を 第14図 に 示 す 。 .、一…o(Propioi【1synthase) … …P

樋

… …q 〔5〕 〔11〕 Fig。14.Polyacrylamidegelelectrophoresisofthe enzymesolutionobtainedfromwheat, 〔5〕Transferrin,〔11〕Ammoniumsulfate (40,30%saturation) 第13図 に お け るpropioinsynthaseのpeakは ⑳ で あ りTSKgelG・3000SWcolumnのHPLC に よ っ て 表 わ れ る 蛋 白 質 の 中 で は 最 も 分 子 量 の 大 き い も の と 考 え て 第14図 〔11〕 のoのbandが propioinsynthaseで あ る と 推 測 さ れ 、p,qの2つ のbandが 認 め ら れ た 。 4。Maltのpropioinsynthase-・Maltか ら 得 ら れ た 粗 酵 素 液 と 、 そ れ をprotaminesulfate 処 理 後 、20、30%飽 和 で(NH4)2SO、 分 別 し て 得 ら れ た 酵 素 溶 液 のHPLCに よ る 分 析 結 果 を 第15 _、 16図 に 示 す 。 第15図 に お い て 、 矢 印 のpeakは11あ り 、maltは 少 な く と も11種 以 上 の 蛋 白 質 が 含 ま れ て い る と い う こ と が こ のcolumnに よ っ て 検 出 さ れ た 。 こ の 第16図 のTSKgelG-3000SWcolumnに お

け るretentiontime9.8分 に お け る 大 き いpeak㊧ の 蛋 白 質 がpropiolnsynthaseの 活 【生 が 認 め ら

れ た の で 第15図 のShim-packDiol300columnで のretentiontime10.3分 の 大 き い ⑫ のpeak

器 呂 駐 起 1●o 窃 ロ 950昭 出 ■ O O F㎏,1嘔.Hl帥 一P己rfo㎜anco巳iquid￠hromlaヒo暮ramof th已en謳y111egolutionobtainedfrm皿 肛1且lt. Oo"ditb醐C。h皿 叫T$KgEIO・ 且自鵬WFIow催 自、1.Oml/min

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の 蛋 白 質 がpropioinsynthaseで あ る と考 え ら れ る 。 第16図 の 試 料 を 電 気 泳 動 用 試 料 に 調 整 後 、 そ の10μ1を と りpolyacrylamidegel電 気 泳 動 を 行 っ た 結 果 が 第17図 に 示 さ れ て い る 。 呂 翁

鰐

....・・r(Propioinsynヒhase) 、.・…3 ・L _{・・刊 ・・ 巳} 1・辱騨,u ・…HV 1'''"¶'w F・ ・…x … …y 蜘 〔5〕 〔12〕 Fig.17.Polyacrylamidegelelectrophoresisof enzymesolutionobtainedfrommalt, 〔5〕Transferrin,〔12〕Ammoniumsulfate (20,30%saturation) 第17図 のBandと し て はr、s、t、u、v、w、x、yの8つ が 認 め ら れ る が 第15、16図 に み ら れ る よ う に 、 こ の 酵 素 はmalt中 の 蛋 白 質 と し て は 、 こ のHPICの 条 件 下 で は 、 最 も 大 き い 分 子 量 を も っ て い る 事 が 示 さ れ て い る か ら 、 第17図 に お い て はrのbandで は な い か と 推 測 さ れ た 。

要

約

パ ン 酵 母 細 胞 内 に 存 在 し て い る 蛋 白 質 と し て はShim・packDio1150columnに よ るHPLCに よ っ て 少 な く と も9種 以 上 存 在 し 、 そ の 粗 酵 素 液 をprotaminesulfate処 理 、40、60%の

(NH4)2SO4飽 和 に よ る 分 別 、Ca3(PO4)2処 理 、TSKgelG・3000SWco1㎜n、TSKgelPhenyL

5PW、 お よ びShim・packPA・DEAEcolumnに よ っ て 純 化 さ れ る 。Cornの 蛋 白 質 はShim・ packDio1300columnに よ っ て 少 な く と も17種 以 上 存 在 し て い る こ と が 認 め ら れ た 。Comの 粗 酵 素 液 をprotaminesulfate処 理 、30、40%飽 和 、(NH、)2SO4分 別 す る こ と に よ っ て こ の 酵 素 の 極 め て 濃 いbandがpolyacrylamidege1電 気 泳 動 の 図 に 認 め ら れ 、 こ のstepで の 酵 素 液 は 可 成 り精 製 さ れ て い る こ と が 示 さ れ た 。Wheatの 蛋 白 質 はHPLCでShim-packDiol300columnに よ っ て 少 な く と も13種 以 上 の 蛋 白 質 が 存 在 し て い る こ と が 認 め ら れ 、wheatか ら得 ら れ た 粗 酵 素 液 をprotaminesulfate処 理 、20、30%飽 和 、(NH4)2SO4分 別 す る こ と に よ っ て 可 成 り精 製 さ れ 、 一15一

そ のpolyacrylamidege1電 気 泳 動 の 図 に お い てpropioinsynthaseの 示 すbandが 推 定 さ れ た 。 Maltの 蛋 白 質 はHPICでShimpackDiol300columnに よ っ て 少 な く と も11種 以 上 あ る こ と が 検 出 さ れ 、maltか ら得 ら れ た 粗 酵 素 液 のprotaminesulfate処 理 、20、30%飽 和(NH4)2SO4分 別 し た 酵 素 液 のpolyacrylamidege1電 気 泳 動 図 に お い てpropioinsynthaseのbandが 推 定 さ れ た 。

こ の 研 究 に 協 力 し て い た だ い た 島 田 圭 子 嬢 、 十 河 美 容 嬢 に 深 謝 し ま す 。

文

献

1)Morimoto,S.:みF87物 肱 乃`肋o乙50,850(1972).

2)Morimoto,S.,Azuma,K.,Oshima,T.Sakamoto,M.:∫F87耀 鉱7セoゐ πoム,66,7(1988).

3)森 本 茂 美:松 蔭 女 子 学 院 大 学 、 短 期 大 学 生 活 科 学 論 叢,3,21(1970), 4)森 本 茂 美:松 蔭 女 子 学 院 大 学 、 短 期 大 学 生 活 科 学 論 叢,4,29(1971). 5)森 本 茂 美:松 蔭 女 子 学 院 大 学 、 短 期 大 学 生 活 科 学 論 叢,5,1(1972). 6)森 本 茂 美 、 財 田 寿 子 、 森 本 美 穂 子 、 藤 原 与 志 子:松 蔭 女 子 学 院 大 学 、 短 期 大 学 生 活 科 学 論 叢,11, 1(1979), 7)森 本 茂 美 、 森 本 美 穂 子 、 藤 原 与 志 子 二松 蔭 女 子 学 院 大 学 、 短 期 大 学 生 活 科 学 論 叢,12,1(1979). 8)森 本 茂 美 、 藤 原 与 志 子:松 蔭 女 子 学 院 大 学 、 短 期 大 学 生 活 科 学 論 叢,13,1(1980). 9)Morimoto,S,:Rθ 漉 卿qプLゴ 伽gS6碗c6、21,1(1989). 10)Morimoto.,S,:ANewEnzyme,PropioinSynthase,and勘6勿so勧 ピ魏 ηρ帥 伽s,p.1∼140,Shoin Women'sUniversityScientificResearchSocietyandShoinWomen'sCollageScientific ResearchSociety,Kobe(1992). 11)Laemmli,U.K,:翫 勧 名2,227680(1970). 12)Bradford,M,:!1盟 凪 、研o伽 肱,72,248(1976). (ReceivedJanuary5,1994)