Pharmacogenomic and biomolecular investigation of target nucleic acids metabolizing enzymes for development of new anticicrobial drugs

Title

Pharmacogenomic and biomolecular investigation of target

nucleic acids metabolizing enzymes for development of new

anticicrobial drugs( 内容の要旨(Summary) )

Author(s)

Mahmoud Kandeeel El-Sayed

Report No.(Doctoral

Degree)

博士(工学) 甲第375号

Issue Date

2009-09-09

Type

博士論文

Version

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/33536

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氏名(本籍) 学 位 の _{種 類} 学位授与番号 学位授与 日 付 専 攻 学位論文題目 学位論文審査委員 MalmoudKandeelElrSayed(エジプト) 博 士(工学) 甲第 375 号 平成 21年 9 月 9 _日 物質工学専攻 Pharnacogenomic

and biomolecularinvestigation oftarget nucleic acids

metabolizingenzymeSfordevelopmentofnewanti皿icrobialdrugS (新規な微生物感染症治療薬開発のための標的となる核酸代謝酵素の分子薬 理ゲノム学的探索) (主査)西 川 一 八 (副査)木 内 一 書 北 出 幸 夫

論文内容の要旨

The _{genes encodingfbrgyanyhte.thymidyhteand nuck!OSi血diphosphatekinases魚■Om} P血smodium

βk:i>oTVmWereObtainedbyPCR,eXpreSSedin助dzerEcfziocDtiandtherecombinantenzymeSWereinvestigated

aspossibknewchemotherapeutictargets.Weun由rtookcbning,eXpreSSion.puri危cation.characterization.and

mutationofPA7SmOdiumJbk:ipaTVmguanyhtekinase(PhsmoDBIDPFI1420w).Amino-aCidsequencealignment

reveabdimportant di晩rences especiallyin K42-VSl.Y73-A77,and FlOO-LllO.whichinclu血residues importantfbrkinaseacdvityiandathelix3,Whichisimportantfbr血mainmovements.Thecatalytice代ciency

fbrdGMPwas22-fbkIbwerthanthatforGMRwbosevaIueisthebwestamongknownguanyhtekinases.dGMP

WaSEbundtoacompetitiveinhibitorfbrGMPwithKi=0.148mMandamixed-tyPeinhibitorwithregardtoATP

withmeasuredKi=0.4mM.Thesped伝cityconsbnt【‰ノ≠｡〕ofthefburexaminedmutantsvariedfbrnatural

Substrate GMP/dGMRindica血gtheinvoIvement of di飴rent mechanismsin substrate recogni也on and Subsequent bop一血main movement.These results showthat Phsmodiumbk:fi)aTVm guanybte kinaseis StruCturallyandbiochemicallydistinctfromotherguanyhtekinasesandcouklbeapossibktargetindrug

血vebpmenL

Thymidyhtekinaseisahomodimerexhibi血gmaximalkinaseactivib(OVerawi血pHrangeof7-9andis

Characterized by marked stability:Comparedwiththe human enzyme.the recombinant P血smodium

Jhk:ii?aTVm TMP kinase _showed a broa血r _{spectrum Of substrate speci丘citylThe} en勾rme nOt Only

phosphoryhtesdTMPanddUMPbutcanalsotok柑tethebulkierpurinesdGM苫GMPanddIMRInitialvebcibr StudiesshowedthattheKLvaluesforTMPamidGMPare22and30pM.respectivelylThebmovernumber

kc｡mWaSbundtobe3.4s.1,aⅥ血eindicatingthehighercatalyticefRciencyofthephsmodiumenzyme.

Fromthe _{present study} we _{suggestthatthe血sign ofappropriateinhibitors especial1y purine} based

COmpOundscouklhaveasekctiveinhibitorye鮎ctontheparasiteenzyme.Inor血rtoprobethe鮎xibilib,Of PfTMKinaccommo血血gligandsofvarioussizes.we血vebpedsixmutantenzymeSandsubjectedtheseto thermodynamic,inhit)itoryandcatalydcevalua仕on.氾naseac厄vitywasmarkedlya鮎ctedbyintroducinga hrgerlysineresidueinsteadofAlll.ThebckofthehydroxylgroupafterinducingmutationofYlO7Fa鮎cted enzymeaCtivi切andhadamoresevereimpactondGMPkinaseactivi伊PrI.MKcanbeinhibitedbyboth purineandpyrimidinenuckosi血s.r3isingthepossibili甘OfdⅣebpinghigh1ysekctivedrugS･Thermodynamic analysisreveakdthatenthaIpicfbrcesgovembothpurineandpyrimidinenuckosi血monophosphatebinding. amithebindinga餌nityofbothsubstrateswashighlycomparabk.TheheatproducedduetodGMPbindingis bwerthanthatathibutabktoTMRTbisindicatesthataddibonalinteractionsoccurwithTMRwhichmaybe bstwithhrgerdGMf!ThrgetingPrI.MKnotonlya鮎ctsthymidinenuckod血synthesisbutmayalsoa触ct purinenucboti血s,andthustheenzymerePreSentSanathctiveandmicrobialtarget. Thegeneencodingfbrnuckosi血diphosphat占kinase丘･OmPhsmodEumJh坤qTVmWaSObtainedbyPCR andexpressedin血dIe融iacotiiThdkingkinasesisstrenuouswo止duetomanyhnctionalandtechnical 虎魚cits･ThckingoEPfNDKwascarriedoutbyconventionalenzymeaSSaySCOmbinedbyisothermalti1ra也on Cabrime叩ITCwasaneLficienthckingmethodwithrapi4acmrateandcon月血nttargetconfirmation.In a血ition.itprovi血ssubstratea伍ni甘andfu11thermodymamicpro丘kinoneexperiment･Magnesiumionswere ･9･

fbundtobeessen血1fbrNDPkinaseactivib,;howeveTltheabsenceofMg+2didnotcompktelyinterftrewiththe bindingofnuck,0ti血s･Thesubstraterecognitionwasfoundto血pendonenthalicfbrceswith1itdeenthalpic con廿ibu厄ons.Howeverlintheabsenceofmagnesiumionsthenuckoti血sactivelybindtotheenzymedrivenby thehydrophobicfbrces.TheenzymeShowedspeci丘cacdvitythatwaswi申intheaverageofknownenzymeS; howevenitwa5atkasttwofbushigherthanthatofhuman.

論文審査結果の要旨

マラリアは､エイズ､結核とともに､WHO(国際保健機構)が提唱するところの､人類が克服すべき三 大感染症の1つであり､ハマダラ蚊を媒介してヒトに感染する人類最大の寄生原虫感染症である｡マラリ アは熱帯･亜熱帯を中心に世界約100カ国で流行し､年間発症数3∼5億人､年間死亡者数150∼270万人 と推定される｡近年､薬剤耐性マラリアの出現や地球環境の変化による流行域の拡大など､悪化の一途を たどっており､深刻な社会問題となっている｡かかる背景から新たな作用機序を有する抗マラリア薬の早 急な開発が強く望まれている｡

申請者は､抗マラリア薬開発の新規標的タンパク質として熱帯熱マラリア原虫(ヱ血匝且r氾由の､グア

ニル酸キナーゼ(GMP出血ase)､チミジル酸キナーゼ(TM貯り邑na紀)､及びヌクレオシドニリン酸キナー ゼ(nucleosidedipho8Phatekinase)に着目している｡本研究では､これら熱帯熱マラリア原虫酵素のク ローニング及びタンパク発現･精製を行い､これら酵素の性状に関して詳細な検討を加えることで､抗マ ラリア薬開発の標的酵素としての活用可能性について検討している｡ まず､熱帯熱マラリア原虫(ヱ危血わ訂udグアニル酸キナーゼ(GMPkhase)に関する研究では､アミ ノ酸配列E42-V51､Y73-A77､及びFlOO-LllO領域がドメインの動きに重要な役割を果たしていることを 明らかにしている｡また､GMPを基質とした場合の触媒効果と比較して､dGMPを基質とした場合のそ れは22分の1に減少することを明らかにし､この値が既知のGMP』血aseの中で最も低い値であると述べ ている｡これらの知見を基に､熱帯熱マラリア原虫グアニル酸キナーゼは構造的にも生化学的にも他のグ アニル酸キナーゼとは異なるので､抗マラリア薬開発の標的酵素となり得ることを明らかにしている｡ 一方､チミジル酸キナーゼ(仰山血ase)は､ビリミジン代謝経路においてATPをリン酸源としてW をTDPにリン酸化する酵素であり､DNAおよびRNA合成において重要な役割を担っている｡そのため､ TM旺=邑na8eを阻害すると､正常な核酸合成が行われなくなり､結果的に細胞の増殖が抑制される｡従って､ TMげリdnaseは新規抗マラリア薬分子設計の標的酵素となり得ると考えられる｡本研究の変異実験により､ Alllに立体障害の大きなリジン残基を導入すると､キナーゼ活性に大き-な影響を及ぼすことが明らかにさ れた｡さらに､水酸基が欠損したYlO7F変異体では､酵素活性に重大な影響が見られるなど､熱帯熱マラ リア原虫TMP出血aseの様々な特異性を明らかにしている｡また､同酵素の分子モデリングを行い､その 結果からヒトW』皿aSe(励TMP出血ase)と熱帯熱マラリア原虫Wbnase(j¥TMPbna紀)には､ 活性部位近傍に空間的な相違があり､基質特異性が異なることを明らかにしている｡即ち､mP出血ase が､抗マラリア薬開発の標的酵素になる可能性を明らかにしている｡ 最後に､ヌクレオシドニリン酸キナーゼ(nucleosidediphosphatekinase)での研究では､等温滴定型 カロリメータ(isothe皿altitrationcalorinetry:ITC)を用いることで､基質のアフィニティーを一つの 実験で明らかに出来ることを証明している｡その中で､ヌクレオシドニリン酸キナーゼの活性化にはマグ ネシウムイオンが必要ではあるが､無くても完全に酵素活性がなくなる訳ではないなどを明らかにしてい る｡ 以上に述べたように､本論文では熱帯熱マラリア原虫酵素の特異性に着目し､幾つかのマラリア原虫酵 素が選択的阻害剤開発のための標的酵素となり得ることを明らかにしており､本論文の有用性は極めて高 い｡従って､審査の結果､この論文を学位論文に値するものと判定した｡

最終試験結果の要旨

この論文の主要部分は､審査付き論文として英文で公表済みの4編の論文である｡この論文が学位論文 として完成された内容を有することを確認した｡ 公聴会において､学位論文の内容を中心として､またこれに関する事項､即ち抗マラリア薬開発の意義 と現状､抗マラリア薬開発を目的とする熱帯熱マラリア原虫酵素の発現･精製･性状､標的酵素としての 可能性ならびに今後の展開や本研究の将来性などに関して試問を行った｡論文申請者から､十分な内容を 持つ適切な回答が得られたので､最終試験にも合格であると判定した｡