細胞外ヌクレオチドを介した中枢神経系の細胞間情報連絡
小 泉 修 一
山梨大学医学部大学院医学工学総合研究部薬理学講座 要 旨：最近，グリア細胞が放出する化学物質“グリア伝達物質”という言葉をよく目にするよう になった。これには，グルタミン酸，D-セリン，ATP 等が含まれるが，この中で ATP はその特異 的センサー蛋白質 P2 受容体を介してグリア伝達において中心的な役割を果たす。特にアストロサ イトは刺激依存的及び非依存的に ATP を放出することにより，周辺のシナプス，ミクログリア及 び血管外腔の細胞群とコミュニケーションをとる。本稿では先ず，アストロサイト由来 ATP が生 理的条件下における中枢神経系の細胞間コミュニケーションで果たす役割について述べる。次いで， 病態時での警告シグナルとしての ATP 及び他のヌクレオチドについて，特にミクログリアとの関 連性で述べる。このように，細胞外ヌクレオチドはグリア細胞を介して脳機能の細部調節装置及び 安全装置として脳機能を巧妙に制御しているのである。 キーワード ATP，P2 受容体，アストロサイト，ミクログリア，グリア伝達物質 はじめに グリア細胞は，ごく最近までニューロンの物 理的支持，栄養因子放出や老廃物除去など，ニ ューロン活動を支える裏方として働いていると 考えられるに過ぎなかった。しかし，アストロ サイトが脳機能の根幹とも言うべきシナプス伝 達を実に積極的かつダイナミックに制御すると いう事実により1,2），グリア細胞は一躍，脳研 究の檜舞台に躍り出たと言える。アストロサイ トは，ニューロンに寄り添い，ほとんどのシナ プ ス を 取 り 巻 く よ う に 存 在 し ， さ ら に そ の endfeet で血管を包み込み，各種神経伝達物質 に即時的に応答し，しかも活動依存的に ATP 及び glutamate などのグリア伝達物質を放出す る“信号発信機能”を有する。これらの事実は， ニューロン―グリア細胞―血管間の積極的なコ ミュニケーションが情報処理・発信を形成して いることを推測させる。さらに，病態時に神経 細胞から漏出する ATP や他のヌクレオチドが， 周辺グリア細胞機能を制御し，その後の脳機能 回復・維持に中心的な役割を果たす。本稿では， ATP 等細胞外ヌクレオチド及びグリア細胞を 切り口として，中枢神経系の異種細胞間コミュ ニケーションに関する最新の知見を述べる。 I．アストロサイト間コミュニケーション アストロサイトは，星状神経膠細胞の名前が 示すように星形で，最も数の多いグリア細胞で ある。その役割は多岐にわたり，例えば，多く のサイトカイン及び成長因子受容体が発現して いることから，脳内の炎症・障害時に応答し機 能していることが，また種々のトランスポータ ーの発現とシナプス周囲を取り囲むような存在 形態から，神経伝達物質の除外・イオン恒常性 保持機能との関連が示唆されている。しかしさ らに注目すべき点は，アストロサイトはほとん 〒 409-3898 山梨県中央市下河東 1110 受付： 2007 年 11 月 2 日 受理： 2007 年 11 月 6 日総 説
どすべての神経伝達物質受容体を発現してお り3），各種神経伝達物質に即時的に応答するこ と，また種々のグリア伝達物質，例えば ATP4,5）， glutamate6,7），D-serine8）等を放出することであ る。アストロサイトは非興奮性細胞であり，各 種イオンチャネルを発現しているが活動電位を 発生しない。しかしアストロサイトは巨大なネ ットワークを形成し，細胞内及び細胞間に伝播 する“Ca2+wave”を介して互いにコミュニケ ー シ ョ ン を と る 。 こ れ は 細 胞 内 C a2 +濃 度 （［Ca2+］i）上昇が，時間・空間的にずれながら 波のように細胞内及び細胞間を伝わる現象であ る。細胞内 Ca2+イメージング技術の発達によ り，電気生理学的には静かであったグリア細胞 が，実はかなり忙しく活動していることが明ら かとなってきた。細胞内 Ca2+wave は主に inosi-tol 1,4,5-trisphosphate（InsP3）受容体を介する 小胞体からの自己再生的な Ca2+遊離により形 成される。一方細胞間 Ca2+ wave は，コネキシ ン 43 などのギャップ結合を介して Ca2+イオン やセカンドメッセンジャーが細胞間を移動する 説と9），ATP 及び glutamate など細胞外液性因 子が放出及び拡散することに起因する説があり 4），現在は後者の考え方が主流である。従って， アストロサイトで認められる活発な Ca2+ wave は，アストロサイト間でグリア伝達物質を介し た頻繁な情報のやりとりが行われていることを 意味する。 現在，このアストロサイト間コミュニケーシ ョンの主役は ATP であると考えられている4,5）。 ATP はエネルギーの通貨としてよく知られる 物質であるが，細胞外に放出されて細胞間情報 伝達物質として機能する。1993 年に最初の ATP 受容体（P2 受容体）の分子的実態が明ら かとされ，以来，形質膜 2 回貫通型イオンチ ャネル内蔵型の P2X 受容体（P2X1~7）及び細 胞膜 7 回貫通型で G タンパク共役型の P2Y 受 容体（P2Y1,2,4,6,11~14）がそれぞれ，7 及び 8 種類 確認され（図 1），それぞれの組織及び細胞分 布も明らかにされつつある。海馬初代培養アス トロサイトにおいて，ガラスピペットを用いて 単一の細胞を軽く刺激したところ，被刺激細胞 での［Ca2+］i 上昇に続き周囲のアストロサイト に伝播する Ca2+ wave が観察された（図 2A 上 段 ）。 P2 受 容 体 阻 害 剤 及 び ATP 分 解 酵 素 の apyrase（図 2A 下段）及び P2 受容体の遮断薬 図 1． P2 受容体ファミリーの分子構造 P2 受容体はイオンチャネル型 P2X 受容体，G タンパク共役型 P2Y 受容体に分類される。P2X 受 容体は細胞膜 2 回貫通型構造を有し，同種（ホモマー）又は異種（ヘテロマー）に会合して三量 体を形成する。P2Y 受容体は細胞膜 7 回貫通型構造を有する。
は，このアストロサイト間 Ca2+wave 形成を著 しく抑制した。また，luciferin-luciferase 試薬 と VIM カメラを用いた撮像により，機械刺激 を与えたアストロサイトから ATP の放出及び 拡散が確認された（図 2B）。以上より，ATP 及 び P2 受容体がこのアストロサイト間 Ca2+wave 形成で中心的な役割を果たしていることが明ら かとなった。また，薬理学的な解析により，ア ストロサイトの Ca2+wave 形成に関わる P2 受容 体は Gq/11 共役型の P2Y1及び P2Y2受容体であ 図 2． 海馬アストロサイト機械刺激による Ca2+wave 播及び ATP 放出の可視化 A．海馬アストロサイトをガラスピペットで軽く刺激するとまず被刺激部位で［Ca2+］ i 上昇が観察され，周囲の細胞間へ同心円状に伝播する Ca2+wave が観察された（コ ントロール；上段）。ATP 分解酵素アピラーゼ（apyrase, 20 units/ml）の存在下では， この Ca2+波伝播は著しく抑制された（+ アピラーゼ；下段）。B. luciferin-luciferase 試 薬存在下，60 秒間に発生するフォトンを高感度カメラ（VIM カメラ）で画像化した。 海馬アストロサイトに機械刺激を与えると（位相差像参照；左端）被刺激部位でフ ォトンの増加が観察され，放出された ATP が周囲へ拡散する様子が観察された（目 盛り； 50µm）。
っ た 。 Glutamate も Ca2+ wave に 関 与 し 得 る 。 しかしアストロサイトの［Ca2+］i 上昇を惹起す る glutamate と ATP の最小有効濃度が約 50 倍 異なることを考慮すると，アストロサイトはこ のような感受性の差を利用して，グリア伝達物 質を使い分け，情報伝達を制御していると考え られる。また，Ca2+ wave がギャップ結合を介 して伝播する成分もあると考えられるが，ギャ ップ結合を形成するコネキシン 43 分子が ATP 放出能に強く影響すること10），さらにコネキシ ンが ATP 放出チャネルである可能性11）などか ら，コネキシン分子は意外にも ATP 放出能と も関係があるようである。 グリア伝達物質 ATP の情報を受け取ったア ストロサイトではどの様な機能変化が起きるの であろうか？初代培養アストロサイトに外から
ATP 刺激を加えると，P2Y1及び P2Y2受容体活
性化により，Gq/11タンパクとリンクした phos-pholipase C(PLC)/InsP3を介した細胞内 Ca2+貯 蔵部位からの Ca2+遊離が惹起され，結果とし て容量性 Ca2+流入をも引き起こし，持続的な 非常に大きな細胞内［Ca2+］i 上昇が観察され る12）。ATP はアストロサイトの増殖13），DNA 合成14），突起形成及び突起伸展など，増殖及び 形態変化を制御していると考えられている。こ れらの応答は P2Y 受容体を介し，ERK1/2MAP リン酸化酵素や Ca2+非依存的蛋白質リン酸化 酵素 C などの細胞内情報伝達系が関与してい る15）。さらに，篠崎らは P2Y 1受容体を介した
［Ca2+］i 上昇及び ERK1/2 系の活性化により，
アストロサイトが参加ストレスに対する抵抗性 を獲得することも明らかとしている16,17）。 II．グリア伝達物質 ATP によるシナプス伝達制 御 脳ではニューロンにも各種 P2 受容体の発現 が認められている。遺伝子レベル，蛋白レベル また機能解析等，解析方法の違いにより一部そ の分布様式に矛盾点も認められるが，海馬神経 細胞では前シナプスに P2X2/3，P2X3，P2Y1， P2Y2又は P2Y4受容体18），後シナプスに P2X2又 は P2X4及び P2X6受容体 mRNA19），顆粒細胞 層 に P2Y1受 容 体20）， ま た 介 在 ニ ュ ー ロ ン に P2Y1受容体21）の発現が観察されている。グリ ア伝達物質 ATP は海馬ニューロンの活動に影 響を与えるのだろうか？海馬神経―アストロサ イト共培養系では，培養後 1 週間後程度から神 経細胞において，glutamate のシナプス伝達に 起因する同期した自発的な Ca2+振動が観察さ れる22）。これをシナプス伝達の指標として ATP の作用を検討した。ATP 刺激を行うと，この 神経細胞の Ca2+振動が抑制されるが（図 3Ab）， これは神経終末の P2Y 受容体を介した gluta-mate 放出の抑制に起因すると考えられる22）。 この共培養系において，単一アストロサイトに 局所的な機械刺激を与えると，前述したように アストロサイト間に Ca2+ wave が伝播するが， これは被刺激細胞近傍の神経細胞の Ca2+振動， つまりシナプス伝達を抑制した。さらにこの Ca2+振動抑制作用は，ATP 分解酵素 apyrase 処 置により消失した（図 3B）。つまり，アストロ サイトから放出された ATP，グリア伝達物質 ATP は海馬の興奮性シナプス伝達をダイナミ ックに抑制するのである。他にもアストロサイ トはグリア伝達物質 ATP により GABA 作動性 ニューロンの後シナプスに存在する P2Y1受容 体を活性化して海馬の抑制性介在神経を興奮さ せ21,23），また後シナプスの P2X 7受容体に作用 して NMDA 受容体の形質膜への動員を促進す ることでシナプス伝達の効率を制御する24）等， 多岐に渡る制御様式を備えていることが報告さ れている。 アストロサイトは全く刺激を加えない状態で も，自発的な［Ca2+］i 変動を呈する。これは， ニューロンの活動を tetrodotoxin（TTX）で完 全に抑制した場合でも，またニューロンが存在 しないアストロサイトを精製した培養系でも確 認された。この自発的な［Ca2+］i 変動は，P2 受 容 体 拮 抗 薬 の suramin， PPADS， さ ら に apyrase によって抑制されることから ATP 及び P2 受容体依存的な応答であることがわかった。 よりin situ に近い海馬のスライス標本でも，ア
ストロサイトの自発的な［Ca2+］i 変動が認めら れ，これは TTX 非依存的であることが報告さ れている25）。つまり，アストロサイトはニュー ロン活動に依存しない自発的な ATP 放出能を も有し，これにより自身の［Ca2+］i 変化を引き 起 こ し て い る の で あ る 。 で は こ の 自 発 的 な ATP 放出は近傍のニューロンの活動に影響し ていないのだろうか？図 4 に示すように，海馬 のニューロン−グリア共培養細胞に apyrase を 添加してアストロサイトから放出される ATP を除去すると，シナプス伝達に起因するニュー ロンの Ca2+振動は，その頻度及び振幅ともに 増強された（図 4Aa，トレース 1 及び 2）。特に ニューロンの活動が小さい標本では，apyrase により爆発的なシナプス伝達の増大が認められ た（図 4Ab，トレース 5 及び 6）。このような 標本では，アストロサイトの自発的 Ca2+活動 が大きく（図 4Ab，トレース 7 及び 8），さら 図 3． 海馬アストロサイト由来 ATP による海馬ニューロンのシナプス伝達の抑制 A．海馬初代培養細胞の免疫染色像及び ATP 刺激（1µM）に対するニュ ーロン（トレース 1 及び 2）及びアストロサイト（トレース 3 及び 4）で の［Ca2+］i 変動の典型例を示した。b のトレース 1–4 は，a の細胞 1–4 に 対応している（1–2，MAP2 陽性神経細胞； 3-4，GFAP 陽性アストロサイ ト）。ATP を添加によりニューロンの Ca2+振動（シナプス伝達）は消失 したが，アストロサイトでは［Ca2+］i 上昇が認められた。B．単一のア ストロサイトに機械刺激を与えたときの近傍細胞での［Ca2+］i 変動を測 定した。A．位相差像，b．アストロサイト（1–2）及びニューロン（3–5） の位置関係を示した模式図。アストロサイト 1 に刺激を与えた際の，ア ストロサイト（細胞 1–2）及びニューロン（細胞 3–5）における［Ca2+］i 変動を示した。機械刺激によりアストロサイト間 Ca2+wave 伝播が，ニュ ーロンでは Ca2+振動の抑制が観察された。Apyrase（20 units/ml）は，こ のアストロサイト刺激によるニューロンの Ca2+振動抑制作用を消失さ せ，またアストロサイト間に伝播する Ca2+wave も抑制した。d. c のトレ ース下の各時間（i）–（v）における，アストロサイト及びニューロンの ［Ca2+］i 変動のイメージング。数字は Bb の番号に対応している。
にこれは apyrase により完全に消失する。従っ て，アストロサイトは自発的に細胞外 ATP 放 出を調節することにより，シナプス伝達を恒常 的にしかも強力に制御している可能性が明らか となった。このように，シナプス伝達はグリア 伝達物質 ATP により積極的かつダイナミック に制御されている。これまでのシナプス伝達の 基本であった，前シナプスから後シナプスへの 単純な神経伝達物質の授受だけでなく，周辺シ ナプス“アストロサイト”を含めた三者が形成 する“tripartite synapse”（三者間シナプス）で のコミュニケーションが，複雑な脳の情報処 理・発信機能の素過程である可能性が高い。ま た，アストロサイトがニューロン活動に依存し ない ATP 放出能を有していたことから，アス トロサイトは所謂シナプス伝達が行われるニュ ーロンの周辺環境を積極的に整備している役割 も有しているようである。これらの知見は，今 後のシナプス伝達研究はグリア細胞をも十分考 慮して進めていく必要性を提起するものである と考えている。 III．アストロサイト―毛細血管コミュニケーシ ョン アストロサイトは神経細胞に突起を伸ばして シナプスを包み込む一方，血管系にも endfeet と呼ばれる足を伸ばし血管壁外腔を覆ってい る。Zonta らは大脳皮質スライス標本を用いた 実験により，神経細胞の興奮により放出された glutamate がアストロサイトに伝わり，そこで
［Ca2+］i 依存性に arachidonate 及びその代謝物
の産生・放出を引き起こし，血管を弛緩させる
ことを報告した26）。これは，アストロサイトが，
血管のトーヌスを調整していることを示した最
図 4． ATP 分解酵素 apyrase によるシナプス伝達増強作用
A．Apyrase（20 units/ml）を添加すると，ニューロンの［Ca2+］i 振動 （シナプス伝達）は増強された（a ；細胞 1，2）。このとき，アストロサ イトの自発的な［Ca2+］i 変動は逆に抑制された（a ；細胞 3, 4）。特にシ ナプス伝達が活発でないニューロンでは，apyrase によりバースト状の ［Ca2+］i 振動が惹起された（b ；細胞 5, 6）。アストロサイトの［Ca2+］i 変 動は A と同様抑制された。B. Ab（i）–（ii）に相当する時間の［Ca2+］in の疑似カラー像。番号は A のトレース番号に一致している。
初の重要な論文である。この後，アストロサイ トの［Ca2+］i 上昇により産生された P–450 代謝 物，20–hydroxy–（5Z, 8Z, 11Z, 14Z）-eicosate-traenoic acid（20-HETE）が脳血管を収縮させ ること26-28），また二光子励起顕微鏡を用いた in vivo イメージング手法によりアストロサイトの
［Ca2+］i 上昇が cycloocxygenase-1 （COX-1）代
謝物の産生を介して血管を弛緩させること28） が明らかとなった。これら報告では，血管の制 御様式が弛緩であったり収縮であったりと相反 するものであり，またその制御メカニズムにつ いても未解決な部分が多いが，脳血管の収縮・ 弛緩，さらに局所脳血流の制御にアストロサイ トが直接関与していることを示す，重要な知見 であると言える。しかし，これらの制御にグリ ア伝達物質 ATP が関与するとは示されていな い。ごく最近，ATP 及び UTP が網膜及び小脳 の血管周皮細胞（pericyte）に作用し，周皮細 胞を主縮させることにより毛細血管の血流を制 御する，という非常に興味深い報告がなされ た29）。これまで，毛細血管は血管平滑筋を有し ていないため，収縮・弛緩には関与せず，単に 上流の動脈や細動脈（arteriole）の血流量変化 が毛細血管のそれに反映されると考えられてき た。しかし，毛細血管外腔には周皮細胞がパッ チ 状 に 存 在 し て お り ， こ の 周 皮 細 胞 は α -smooth muscle や myosin 等収縮性の蛋白を発
現している30,31）。さらに，血管内皮細胞と周皮 細胞の間には厚い基底膜層が存在するが，血管 周皮細胞とアストロサイト間の基底膜層は非常 に薄いか欠落している状態であり，アストロサ イトと血管周皮細胞間で，化学物質によるコミ ュニケーションが取りやすい状態にある32）。最 近我々は，血管周皮細胞が種々の P2 受容体を 発現しており，中でも最も多く発現している P2Y2受容体が刺激されると，周皮細胞の収縮 応答が引き起こされることを明らかとした33）。 この収縮応答は phospholipase C 及びストア内 Ca2+依存的であり，P2Y 2受容体刺激後の細胞内 シグナルカスケードと良く一致していた。さら に，アストロサイト―血管周皮細胞共培養系を 用いた実験系では，アストロサイトの刺激によ り惹起された Ca2+ wave は，ATP 依存的に血管 周皮細胞に伝播し，その収縮応答を引き起こし た。従って，Peppiatt ら29）の報告と照らし合わ せ る と ， ア ス ト ロ サ イ ト が グ リ ア 伝 達 物 質 ATP を放出することにより，endfeet の極めて 近 傍 に 位 置 す る 血 管 周 皮 細 胞 が こ の 情 報 を P2Y2受容体により受容し，収縮応答を呈し， これによって毛細血管の収縮を引き起こすこと が示唆される。局所脳血流量は，細動脈レベル だけでなく，最も細い毛細血管のレベルでも極 めて巧妙かつ繊細に制御されており，この制御 にアストロサイト及びグリア伝達物質 ATP が重 要な役割を果たしている可能性が示唆された。 これまで，アストロサイトが ATP を放出す ることによりシナプス伝達及び毛細血管の収 縮・弛緩応答を制御する可能性を示してきた。 さらに，神経細胞自身も ATP を放出しアスト ロサイトを刺激し得ること12），また血管周皮細 胞が機械刺激に応じて ATP を放出し，これが アストロサイト endfeet に局在する P2Y2及び P2Y4受容体34）を介してアストロサイトに伝播 することを示した33）。つまり，神経細胞―アス トロサイト―毛細血管（血管）は，それぞれが 双方向性にコミュニケーションをとること，こ のコミュニケーションに細胞外 ATP が重要な 役割を果たしている可能性が示唆された。また， 毛細血管と神経細胞のインターフェースとし て，アストロサイトが重要な役割を果たしてい るとも言える（図 5）。 グリア細胞は変身し易い細胞であるため，こ れまで多くの in vitro の実験系で得られた結果 が，実際の脳内のグリア細胞機能をどれだけ正 確に反映しているのか？という問題が常につき まとった。前述したように，二光子励起顕微鏡 を用いた in vivo イメージングにより，アスト ロサイトによる血流量調節機構の存在が明らか に な り28）， ま た in vivo で ア ス ト ロ サ イ ト の Ca2+wave の 存 在 も 確 か め ら れ35）， 自 発 的 な ATP 放出現象も報告された36）。さらに，同様の 手法を用いた研究で，麻酔下のマウスのヒゲを
刺激すると，知覚神経が投射するバレル皮質で 神経細胞の電位変化が認められ，これの情報が タイムラグを経てアストロサイトに［Ca2+］i 上昇として伝わることが報告された37）。すなわ ち，感覚器から入力された上行性の神経シグナ ルが脳内の投射部位に到達すると，シナプス伝 達による神経活動と共役してアストロサイトが 興奮することが in vivo で確かめられたのであ る。また，アストロサイト特異的にドミナント ネガティブ型 SNARE 蛋白を発現させた遺伝子 改変動物の脳では，アストロサイトからの自発 的な ATP 放出の欠如（代謝産物の adenosine 量が減るため）に起因するシナプス伝達の亢進 が観察される38）。このように，アストロサイト は確かに脳内で神経細胞及び血管系とコミュニ ケ ー シ ョ ン を 取 っ て お り ， グ リ ア 伝 達 物 質 ATP がやはり重要な役割を果たしていると言 える。 IV．傷害神経細胞―ミクログリア連関 最後に少し視点を変えて，神経細胞からグリ ア細胞へのヌクレオチドを介した情報連絡につ いて述べたい。中枢神経系でも，ATP による シナプス伝達の報告はあるが，その頻度は多い とは言えない21,39）。しかし，傷害を受けた神経 細胞は，大量の ATP 及び他のヌクレオチド細 胞外に放出・漏出させ，周辺細胞にその情報を 伝える。真っ先に応答するのは，中枢神経系の 免疫担当細胞としてパトロールしているミクロ グ リ ア で あ る 。 ミ ク ロ グ リ ア に は ， P 2 X4， P2X7，P2Y6及び P2Y12受容体が発現しているこ とが既に報告されており，種々の重要な生理機 能と係わっている。例えば 2003 年に津田らが 報告したように，P2X4受容体は神経因性疼痛 モデル動物の脊髄ミクログリア特異的に発現が 亢進し，触刺激を痛みと感じてしまうメカニカ ルアロディニアを引き起こす40）。また前述した ように P2Y12受容体はケモタキシスセンサーと して働き，傷害部位へミクログリアを誘引す る36,41,42）。ごく最近我々は，ミクログリアの各 種ヌクレオチドに対する応答性を検討し，ミク ログリアが UDP（uridine 5’–diphosphate）に 非常に高い応答性を示すこと，UDP の特異的 受容体タンパク質 P2Y6受容体が，ミクログリ アに非常に強く発現していることを見出し，そ の機能を詳細に解析した43）。P2Y 6受容体は P2 受容体であるが，ATP 及び ADP といったアデ ニンヌクレオチドを認識せず，ピリミジンヌク レオチドである UTP の代謝産物『UDP』によ り活性化される。UTP を代謝する細胞外酵素 ecto-nucleotidase（NTPDase）は脳内に豊富に 存在している。P2Y6受容体の発現は，脾臓， 胎盤，肺，小腸及び脳で多い。ミクログリアの P2Y12受 容 体 は ケ モ タ キ シ ス を 誘 導 し た が ， P2Y6受容体活性化はミクログリアのケモタキ シスには影響しなかった。しかし，驚くことに UDP 刺激わずか 15 分後には，ミクログリアの 形態の劇的な変化，つまり突起の伸展（図 6a （b）矢印），ファゴゾーム様の胞構造が多くの 細胞体部位で観察された（図 6a（b）矢頭）。 P2Y6 受容体はミクログリアの貪食（phagocyto-sis）能と関連しているのだろうか？ UDP で刺激すると，ミクログリアは近傍の 蛍光ザイモザンビーズに触手を伸ばし，即座に こ れ を 貪 食 し た （ 図 7 ）。 こ の 貪 食 応 答 は ， P2Y6受容体の薬理学的な抑制，及びアンチセ ンスオリゴヌクレオチドによる P2Y6受容体ノ ックダウンによりほぼ消失することから，P2Y6 受容体依存的であることが確認できた。また， 図 5． ATP を介した神経細胞，アストロサイト 及び毛細血管系の模式図 （本文中の説明参照）
UDP 濃度（5-1,000µ M）依存的であった。P2Y6
受容体は脳内の『掃除屋』Brain’s garbage men
のスイッチなのである。このような UDP/P2Y6
受容体依存的なミクログリアの貪食作用が in
vitro の artefact ではないことを明らかにするた
め，in vivo モデルを用いて P2Y6受容体依存的
な貪食作用を検討し，カイニン酸（KA）痙攣 モデルの海馬 CA1 及び CA3 領域の神経細胞が 消失し，その周りに非常に活性化したミクログ リアが劇的に増大すること，いくつかのミクロ グリアでは神経細胞を貪食していることを確認 した。さらに，このとき，増大したミクログリ ア特異的に，P2Y6mRNA シグナルが観察され ること，細胞外 UDP 濃度が亢進していること， そしてミクログリアの貪食作用が UDP/P2Y6受 容体依存的であること，を明らかとした。以上， 傷害神経細胞から UDP（UTP）が漏出するこ と，ミクログリアは UDP をそのセンサー P2Y6 受容体で感知して，即座に貪食を開始し，傷害 細胞及びその断片を脳内から排除することを明 らかとした。前述したように，神経細胞が損傷 すると，その周辺部位に活性化したミクログリ アの集積が認められるが，これは，神経細胞が 傷害されると細胞内に存在する高濃度（5 mM） ATP が漏出し，これが化学誘引物質として働 き，ミクログリアの P2Y12受容体を介して化学 走性を誘発すること41）に起因している。損傷 細胞周辺に集合したミクログリアは両刃の剣で あり，神経細胞を『修復』することも『貪食』 することもする。もはや修復不可能であると判 図 6． P2Y6受容体刺激後に惹起されるミクログリアの形態変化
UDP（100µ M）刺激前（a 左）及び 15 分後（a 右）のミクログリア の位相差顕微鏡像。刺激により，ミクログリアは突起を伸ばし（矢 印），ファゴゾーム様の穴構造（矢頭）を呈する。また，ファゴサイ トキャップ状の構造（b 赤色）に蛍光ビーズ（直径 1 µm）が接着す る様子が観察される。 図 7． UDP/P2Y6受容体システムを介したミクログリアの貪食作用 貪食作用のタイムラプスイメージング。UDP（100 µM）刺激（矢印）により，ミク ログリアは直ちに蛍光ビーズを捉えて貪食を行う。
断した場合に，傷害された神経細胞やその残片 を貪食によって脳内から除去し，脳内環境を整 える。しかし，これまでミクログリアが神経細 胞のダメージの程度をどの様に見分け，またど の様なシグナルで貪食を開始するのかがよくわ
かっていなかった。『To eat or Not to eat』は，
まさしく問題であったわけであるが，今回我々 は，損傷部位から漏出する（放出される）UDP がその貪食を促すシグナルであり，またミクロ グリア P2Y6受容体がそのセンサーであること を明らかとした。ATP も UDP も神経細胞の傷 害を周辺細胞に知らせる重要な分子として働 き，共にミクログリアのダイナミックな動きを 制御している。しかし ATP は P2Y12受容体を介 して化学走性を制御するが貪食能には全く影響 せず，逆に UDP は P2Y6受容体を介して貪食能 を亢進させるが化学走性には関与していない （図 8）。このように，ミクログリアは，細胞外 ヌクレオチド ATP 及び UDP をそれぞれ厳密に 見分け，それぞれの分子に応じた独立した応答， つまり遊走性から貪食性にモーダルシフトを行 うことにより，病態時の脳機能を極めて巧妙に 制御していることが明らかとなった。 おわりに アストロサイトがグリア伝達物質 ATP によ り，シナプス伝達や局所脳血流量を制御してい ることを示した。しかし，これらの制御にグリ ア細胞が関与する生理的意義，さらに何故グリ ア細胞が関与する必然性があるのかという疑問 には答えられていない。今後の新しい研究成果 を待ちたい。一つのキーワードは病態であると 考える。病態時の脳ではアストロサイト等グリ ア細胞の形態及び機能が激変する。外傷性脳障 害やてんかん重積症などの脳障害を患った脳で は，アストロサイトの著しい肥大化及び増殖が 認められ44），また逆に，うつ病や統合失調症な どの気分障害が起きた患者の大脳皮質ではアス トロサイトの細胞数の減少が数多く報告されて いる45-47）。またアルツハイマー病の原因物質と 考えられている β アミロイド に暴露されたア ストロサイトは Ca2+ wave 伝播が異常に増強さ れ ， ま た そ の 増 強 過 程 に は グ リ ア 伝 達 物 質 ATP が関与している48）。静なる巨人アストロサ イトは，病態時にこそその真価を発揮するのか もしれない。また，病態時には神経細胞から細 胞外ヌクレオチド ATP 及び UDP を介した情報 がミクログリアに伝達され，その走化性及び貪 食性が制御されることを示した。中枢神経系の 3 種の重要な構成要素，神経―グリア―血管は， 相互にコミュニケーションをとることにより， 脳機能を巧妙に制御し，種々の脳内環境の変化 に対応しているようである。このコミュニケー ションに，ATP 等細胞外ヌクレオチド及びそ のセンサータンパク質 P2 受容体が中心的な役 割を果たしているのである。 参考文献
1） Araque A, Parpura V, Sanzgiri RP & Haydon PG: Glutamate-dependent astrocyte modulation of synaptic transmission between cultured hippocam-pal neurons. Eur J Neurosci, 10: 2129–2142, 1998. 2） Araque A, Sanzgiri RP, Parpura V & Haydon PG:
Calcium elevation in astrocytes causes an NMDA receptor-dependent increase in the frequency of miniature synaptic currents in cultured hip-pocampal neurons. J Neurosci, 18: 6822–6829, 1998.
3） Porter JT & McCarthy KD: Astrocytic neurotrans-mitter receptors in situ and in vivo. Prog Neuro-biol, 51: 439–455, 1997.
4） Guthrie PB, Knappenberger J, Segal M, Bennett MV, Charles AC et al.: ATP released from astro-図 8． ミクログリアの遊走性から貪食性へのモ
ーダルシフト （本文中の説明参照）
cytes mediates glial calcium waves. J Neurosci, 19: 520–528, 1999.
5） Coco S, Calegari F, Pravettoni E, Pozzi D, Taverna E et al.: Storage and release of ATP from astrocytes in culture.J Biol Chem, 278: 1354–1362, 2003. 6） Bezzi P, Carmignoto G, Pasti L, Vesce S, Rossi D
et al.: Prostaglandins stimulate calcium-depen-dent glutamate release in astrocytes. Nature, 391: 281–285, 1998.
7） Parpura V, Basarsky TA, Liu F, Jeftinija K, Jeftini-ja S et al.: Glutamate-mediated astrocyte-neuron signalling. Nature, 369: 744–747, 1994.
8） Mothet JP, Pollegioni L, Ouanounou G, Mar-tineau M, Fossier P et al.: Glutamate receptor ac-tivation triggers a calcium-dependent and SNARE protein-dependent release of the glio-transmitter D-serine. Proc Natl Acad Sci U S A, 102: 5606–5611, 2005.
9） Giaume C & McCarthy KD: Control of gap-junc-tional communication in astrocytic networks. Trends Neurosci, 19: 319–325, 1996.
10） Cotrina ML, Lin JH, Alves-Rodrigues A, Liu S, Li J et al.: Connexins regulate calcium signaling by controlling ATP release. Proc Natl Acad Sci U S A, 95: 15735–15740., 1998.
11） Stout CE, Costantin JL, Naus CC & Charles AC: Intercellular calcium signaling in astrocytes via ATP release through connexin hemichannels. J Biol Chem, 277: 10482–10488, 2002.
12） Koizumi S, Saito Y, Nakazawa K, Nakajima K, Sawada JI et al.: Spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling mediated by P2Y receptors in cul-tured rat hippocampal astrocytes. Life Sci, 72: 431–442, 2002.
13） Franke H, Krugel U & Illes P: P2 receptor-medi-ated proliferative effects on astrocytes in vivo. Glia, 28: 190–200, 1999.
14） Abbracchio MP, Saffrey MJ, Hopker V & Burn-stock G: Modulation of astroglial cell prolifera-tion by analogues of adenosine and ATP in pri-mary cultures of rat striatum. Neuroscience, 59: 67–76, 1994.
15） Neary JT, Kang Y, Bu Y, Yu E, Akong K et al.: Mito-genic signaling by ATP/P2Y purinergic receptors in astrocytes: involvement of a calcium-indepen-dent protein kinase C, extracellular signal-regulat-ed protein kinase pathway distinct from the phos-phatidylinositol-specific phospholipase C/calcium pathway. J Neurosci, 19: 4211–420, 1999.
16） Shinozaki Y, Koizumi S, Ishida S, Sawada J, Ohno Y et al.: Cytoprotection against oxidative stress-in-duced damage of astrocytes by extracellular ATP via P2Y1 receptors. Glia, 49: 288–300, 2005. 17） Shinozaki Y, Koizumi S, Ohno Y, Nagao T &
Inoue K: Extracellular ATP counteracts the ERK1/2-mediated death-promoting signaling cascades in astrocytes. Glia, 54: 606–618, 2006. 18） Rodrigues RJ, Almeida T, Richardson PJ, Oliveira
CR & Cunha RA: Dual presynaptic control by ATP of glutamate release via facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 receptors in the rat hippocampus. J Neurosci, 25: 6286–6295, 2005.
19） Rubio ME & Soto F: Distinct Localization of P2X receptors at excitatory postsynaptic specializa-tions. J Neurosci, 21: 641–653, 2001.
20） Moore D, Chambers J, Waldvogel H, Faull R & Emson P: Regional and cellular distribution of the P2Y(1) purinergic receptor in the human brain: striking neuronal localisation. J Comp Neurol, 421: 374–384, 2000.
21） Bowser DN & Khakh BS: ATP excites interneu-rons and astrocytes to increase synaptic inhibi-tion in neuronal networks. J Neurosci, 24: 8606–8620, 2004.
22） Koizumi S & Inoue K: Inhibition by ATP of calci-um oscillations in rat cultured hippocampal neu-rones. Br J Pharmacol, 122: 51–58, 1997. 23） Kawamura M, Gachet C, Inoue K & Kato F: Direct
excitation of inhibitory interneurons by extracel-lular ATP mediated by P2Y1 receptors in the hip-pocampal slice. J Neurosci, 24: 10835–10845, 2004.
24） Gordon GR, Baimoukhametova DV, Hewitt SA, Rajapaksha WR, Fisher TE et al.: Norepinephrine triggers release of glial ATP to increase postsy-naptic efficacy. Nat Neurosci, 8: 1078–1086, 2005.
25） Nett WJ, Oloff SH & McCarthy KD: Hippocam-pal astrocytes in situ exhibit calcium oscillations that occur independent of neuronal activity. J Neurophysiol, 87: 528–537, 2002.
26） Zonta M, Angulo MC, Gobbo S, Rosengarten B, Hossmann KA et al.: Neuron-to-astrocyte signal-ing is central to the dynamic control of brain mi-crocirculation. Nat Neurosci, 6: 43–50, 2003. 27） Mulligan SJ & MacVicar BA: Calcium transients
in astrocyte endfeet cause cerebrovascular constrictions. Nature, 431: 195–199, 2004. 28） Takano T, Tian GF, Peng W, Lou N, Libionka W
et al.: Astrocyte-mediated control of cerebral blood flow. Nat Neurosci, 9: 260–267, 2006. 29） Peppiatt CM, Howarth C, Mobbs P & Attwell D:
Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature, 443: 700–704, 2006. 30） Le Beux YJ & Willemot J: Actin- and myosin-like
filaments in rat brain pericytes. Anat Rec, 190: 811–826, 1978.
31） Bandopadhyay R, Orte C, Lawrenson JG, Reid AR, De Silva S et al.: Contractile proteins in peri-cytes at the blood-brain and blood-retinal barri-ers. J Neurocytol, 30: 35–44, 2001.
32） Nag S. Morphology and molecular properties of cellu-lar components of normal cerebral vessels, 3–36 (Human Press, Totowa, 2003).
33） Koizumi S, Fujishita K, Sueishi K, Takata F & Katao-ka Y: Astrocyte-to-pericyte interaction mediated by P2 receptors; regulation of microcirculation in the CNS. J Pharmacol Sci (Suppl.), 100: 26p, 2006. 34） Simard M, Arcuino G, Takano T, Liu QS &
Ned-ergaard M: Signaling at the gliovascular inter-face. J Neurosci, 23: 9254–9262, 2003.
35） Hirase H, Qian L, Bartho P & Buzsaki G: Calci-um dynamics of cortical astrocytic networks in vivo. PLoS Biol, 2: E96, 2004.
36） Davalos D, Grutzendler J, Yang G, Kim JV, Zuo Y et al.: ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci, 8: 752–758, 2005.
37） Wang X, Lou N, Xu Q, Tian GF, Peng WG et al.: Astrocytic Ca2+signaling evoked by sensory stim-ulation in vivo. Nat Neurosci, 9: 816–823, 2006. 38） Pascual O, Casper KB, Kubera C, Zhang J,
Revil-la-Sanchez R et al.: Astrocytic purinergic signal-ing coordinates synaptic networks. Science, 310: 113–116, 2005.
39） Edwards FA, Gibb AJ & Colquhoun D: ATP re-ceptor-mediated synaptic currents in the central nervous system. Nature, 359: 144–147, 1992. 40） Tsuda M, Shigemoto-Mogami Y, Koizumi S,
Mi-zokoshi A, Kohsaka S et al.: P2X4 receptors in-duced in spinal microglia gate tactile allodynia after nerve injury. Nature, 424: 778–783, 2003.
41） Honda S, Sasaki Y, Ohsawa K, Imai Y, Nakamura Y et al.: Extracellular ATP or ADP induce chemo-taxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors. J Neurosci, 21: 1975–1982, 2001. 42） Haynes SE, Hollopeter G, Yang G, Kurpius D,
Dailey ME et al.: The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nat Neurosci, 9: 1512–1519, 2006.
43） Koizumi S, Shigemoto-Mogami Y, Nasu-Tada K, Shinozaki Y, Ohsawa K et al.: UDP acting at P2Y6 receptors is a mediator of microglial phagocyto-sis. Nature, doi: 10. 1038:2007.
44） Eng LF, Ghirnikar RS & Lee YL: Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). Neurochem Res, 25: 1439–1451, 2000. 45） Ongur D, Drevets WC & Price JL: Glial reduction
in the subgenual prefrontal cortex in mood dis-orders.Proc Natl Acad Sci U S A, 95: 13290-13295, 1998.
46） Rajkowska G, Miguel-Hidalgo JJ, Makkos Z, Meltzer H, Overholser J et al.: Layer-specific re-ductions in GFAP-reactive astroglia in the dorso-lateral prefrontal cortex in schizophrenia. Schiz-ophr Res, 57: 127–138, 2002.
47） Webster MJ, O’Grady J, Kleinman JE & Weickert CS: Glial fibrillary acidic protein mRNA levels in the cingulate cortex of individuals with depres-sion, bipolar disorder and schizophrenia. Neuro-science, 133: 453–461, 2005.
48） Haughey NJ & Mattson MP: Alzheimer’s amyloid beta-peptide enhances ATP/gap junction-medi-ated calcium-wave propagation in astrocytes. Neuromolecular Med, 3: 173–180, 2003.
Cell-to-Cell Communication Mediated by Extracellular Nucleotides in the CNS
Schuichi KOIZUMI
Department of Pharmacology, Interdisciplinary Graduate School of Medicine and Engineering, University of Yamanashi
Abstract: Recently, we often see or hear “gliotransmitter”, a coined word corresponding to “neurotransmitter” in neurons. Gliotransmitter involves glutamate, D-serine and ATP etc., among which ATP has a central role for glio-transmission via activation of various P2 receptors in glial and adjacent cells in the CNS. Especially, astrocytes release ATP in response to various stimuli or even spontaneously, and communicate with neurons at synapses, microglial cells and vascular walls at capillaries. We firstly describe astrocyte-derived gliotransmitter ATP as a mediator of cell-to-cell communication in a physiological condition, and will also mention ATP and other nucleotides as warning molecules that signal the crisis state to adjacent cells especially microglia in a pathophysiological condition. As such, extracellu-lar nucleotide in the CNS appears to function as a fine-tuning and a safety device respectively, and regulate various brain functions.
