ポプラ型プロポリスの生理活性物質の規格分析

ミツパ テ科 学24(2):61-66 HoneybeeScience(2003)

ポプ ラ型 プ ロポ リスの生理活性物質 の規格分析

M .Popova

,Ⅴ.

Bankova,D.Butovska

,Ⅴ.

Petkov,B.Damyanova,

A.G.

Sabatini

,G.

L

M arcazzan,S.Bogdanov

プロポ リス (蜂やに) は東 ヨーロッパでは伝 統的に民間医薬 と して利用 され, その有用 な生 理活性 によ って広 く知 られている (Marcucci, 1995;Burdock,1998).起源植物 とそれぞれ のプロポ リスの化学的組成 は,産地の植生 に高 く依存 し, このため産出 される地域 ごとに大 き く異 なっている(Bankovaeta1.,2000).これ までの多 くの研究 によって,温帯では ミツバチ はポプ ラ頬 (Populus属) の芽の疹出物を選択 的にプロポ リス原料 として集めることが明 らか にされている.これはヨーロッパ(Tamaseta1., 1979;Popravkoand Sokolov,1980;Nagy eta1.,1986;Greenawayeta1.,1987;Bankova and Kuleva,1989), 北米 (Garcia-Viguera eta1.,1993),ア ジア北部(Bankovaeta1.,1992; Chieta1.,1996), さらにはニュージーラン ド (Markham etal.,1995)などで確かめ られてい る. したが って温帯地域産 のプ ロポ リスの主要 成分 はポプラの芽 に特有 の フェノール化合物, すなわち, フラボノイ ドアグ リコン (非配糖体 型 フラボノイ ド),桂皮酸類 およびその エステ ルとなる(BankovaandKuleva,1989;Gree n-awayetal,1990;Garcia-Vlgueraeta1,,1992; Hegazieta1.,2000). そ して これ らの化合物 が,プロポ リスの主要 な薬理効果,抗細菌作用, 抗炎症作用,肝臓保護作用,抗酸化作用,免疫 調整作用などの主体 となる (Marcucci,1995; Burdock,1998;Banskotaeta1.,2001).

プロポ リス中の生理活性物質を明 らかにす る ことは, これ らの成分がプ ロポ リスの規格化や 品質管理 において不可欠 な ことで極めて重要で ある.1960年以降, プ ロポ リスの作用機作を 明 らか にす るために数 々の研究 が行 われて き た.1980年代後半 までは, こうした研究 は主 に ヨーロッパ を中心 に進 め られたため,扱われ たプロポ リスはいわゆるポプ ラ由来のプ ロポ リ スであった. ここでは, まず ｢ポプ ラ型 プロポ リス｣の活性 について概観 しておきたい.

ポプラ型プロポ リスの特徴

微生物 に対する活性 はプロポ リスの基本的な 特徴を示す活性であ り, そのため,研究史上 も 初期にこの研究が行われて きた.最初の研究成 果 はVillanuevaetal.(1964,1970)によるも ので,ポプ ラの芽 の疹出物 に含 まれる2種類の フラボノイ ドアグ リコン, ガ ランギ ンとどノセ ンブ リンを同定 し, これがプ ロポ リスに含 まれ 抗菌活性を示す ことを明 らかに した.その後の ヨーロッパ産プロポ リスの研究で も, これ らの 結果が再確認 され, さらにポプラに含 まれ る数 種の フェノール化合物, ピノバ ンクシン, ピノ バ ンクシン

3-

0-

酢酸,サクラネチ ン

,♪-

クマー ル酸ベ ンジル (Metznereta1.,1979),カフェ 酸 ベ ンジル, カフェ酸 フェネチル, カフェ酸 イ ソペ ンチル (Kujumgieveta1.,1993)も同様 の効果を示す ことが明 らかになって きた. ピノ セ ンブ リンとカフェ酸の混合物 は抗 カ ビ作用を 示す ことも確認 され (Metznereta1.,1979), また, カフェ酸や フェル ラ酸 のよ うなフェノー ル酸類 も抗菌活性を示す ことが明 らかになった (Ghisalberti,1978).さ らにその後の研究で, ポプ ラ型 プロポ リス,およびそれに含 まれる成 分 と してのカフェ酸, カフェ酸 フェネテルエス テル (CAPE),ケルセチ ンが,細菌の細胞膜の エネルギー変換 を脱共役 し, また細菌の連動性 を抑制す ることが発見 され,おそ らくこれ らの

作用 が抗菌性 の機作 にな って い る (Mirzoeva eta1.,1997).ポプ ラ型 プ ロポ リスに含 まれ る 多 くの微量 フラボノイ ド類 も,抗菌活性物質 で あ ることが確認 されている (Cowan,1999). プ ロポ リスのアル コール抽 出物 は局部麻酔性 を示すが, この作用 もや は りピノセ ンブ リンと 種 々のカ フェ酸類 の混合物 を主体 と して起 こる (Ghisalberti,1978). プ ロポ リスによる抗炎症 作用 はその ラジカル 消去作用 によるところが大 きい.天然 の フェノ ール化合物,特 にフラボノイ ドはラジカル消去 作用を持つ物質 と してよ く知 られている. ポプ ラ型 プ ロポ リスの個 々の成分 についての詳細 な 研究 によ り, プロポ リスの特筆的な効果であ る 抗炎症作用 に大 きく関与す るの はCAPE,ガ ラ ンギ ン, ケ ンフェロールおよびケ ンフェ リドの 活性 であ る(Kroleta1.,1996).フラボノイ ド ア グ リコ ンとCAPEは炎症過程 の い くつか の 反応 に影響 を与 え ることが報告 されている. ポ プ ラ型 プ ロ ポ リス と, そ の 含 有 成 分 で あ る CAPE, カフェ酸, および ケルセテ ンは,生体 内での ジモザ ン誘導型急性炎症 におけるプ ロス タグランジンとロイ コ トリエ ン生成 を抑制 し, リポキ シゲナーゼによるア ラキ ドン酸代謝経路 を抑制す る (MirzoevaandCalder,1996). プロポ リスの抗腫癌作用 には特 に強 い関心が 向 け られている. プ ロポ リス中に発見 されてい る抗腫 虜物 質 の うち有名 な もの はCAPEで, これ はポプ ラ型 プ ロポ リスにだ け,必ず とい っ ていいはど含 まれて いる. い くつかの実験 にお いて,CAPEは有意 な細胞 障害性 を種 々の腫癌 細胞系 に対 して示 し,抗腫癌活性 は注 目に値す るものであ った(Burdock,1998;Banskotaet

a

1.,2001).同様 の活性が,さ らにポプ ラ型 プ ロ ポ リスに含 まれ る2種 の成分,カフェ酸 ベ ンジ ル とカ フェ酸 シンナ ミルで も確認 された(Usia,

eta1.,2002;Banskotaeta1.,2002).最近,CAPE

は数種 の ヒ ト腫療細胞系 に対 して有効 な抗増殖 活性 を有す ることも確認 された. プ ロポ リス中 の成分 の抗腫虜効果 を考 えた場合, ポプ ラ型 プ ロポ リスに含 まれ るカフェ酸 エステル類 (フェ ネチル, ベ ンジル, ペ ンチル)が最 も強 い活性

を示す と見なされ る(Banskotaeta1.,2001).

CAPE自体 は抗腫療物質 と してだ けで はな く, 飼料 レベルの投与 において さえ活性 を示す ほど の化学防御効果 を示す物質群 の候補 と して期待 されて いる (Mahmoudeta1.,2000). また,CAPEとその類似化合物 は ヒ ト免疫不 全 ウイルス (ェイズウイルス)HIV-1のイ ンテ グラーゼ とい う酵素 に対 して阻害的な効果 を示 す(Burkeeta1.,1995,Articoeta1.,1998).こ れ に加 えてCAPEは ウサ ギの脊髄 虚血性再 潅 流障害 を予防 し, また ラ ッ トで も再潅流障害 を

防 ぐ(Ilhaneta1.,1997;Koltuksuzeta1.,1999).

成 分 分 析 の 必 要 性 ここまで述べて きたよ うな生理活性物質 の定 量 は, プ ロポ リスを医薬品 と して用 いる場合 に は極 めて重要 とな るる. しか し,高速液体 クロ マ トグラフイ (HPLC)や ガスクロマ トグラフ ィ(GC)を用 いたルーチ ン分析で,こうしたす べての生理活性物質 の定量 を行お うとす ると, 目的物質があま りに多種で, そのため個 々の物 質 の標準品をそろえ ることが事実上制限要因 と な り,非常 に困難 を要す る.一方 で, プ ロポ リ スおよびその含有成分の生理活性 に関す る文献 的なデー タを総合 してみ ると,例 えば特 に抗微 生物活性 に関 して は,個 々の物質 の活性 と して 評価す るのは不可能 であ り, また同時 にある特 定微生物 に対す る活性 しか調べ ることがで きな い. またプ ロポ リスか ら単離 した個 々の物質 の 抗菌活性 を調べ る場合 には,抽 出物全体 に較べ て強 い活性 は見 られないことも理解 が必要 であ る (Kujumgievetalリ1993;Bonvehieta1.,

1994).実際 に, プ ロポ リスは天然 に調合 され た状 態 で こそ多 くの薬 理 効 果 を示 か らで あ る (K叫umgieveta1.,1999). したが って,吸光度分析 のよ うに総 フラボノ イ ド量 や,総 フェノール化合物量 を定量す る方 が, ポプ ラ型 プ ロポ リスを 日常的 に管理す るに は手 っ取 り早 くて よ い といえ る. しか しなが ら,何 よ り最初 に,特定の試料 プ ロポ リスが ポ プ ラ型 であるか ど うかを調 べてか ら,一定 の吸 光度分析 の手川副こ入 らなければな らない.起源

植物 の異 な るプ ロポ リスの場合,標準 や検量 の 不適合か ら, こうした分析結果 の信用性が低下 して しま うか らである. ポプ ラ型 プ ロポ リスの 化学的組成 は, 1) 総 フラボ ンおよび フラボノ ール量, 2) 総 フラバ ノ ンおよびデ ヒ ドロフラ ボノール量, 3) 総 フェノール化合物量 とい っ た要素 によ って特徴づ け られている. 本稿で は, ポプ ラ型 プ ロポ リスの同定方法 と 吸光度測定 による規格分析法,HPLCによる主 要成分 の分析 につ いて述 べて いきたい. 規 格 分 析 方 法 の確 立 プ ロポ リスの調整 試料 として, ブルガ リア産 (B-2), イ タ リア 産 (I-2,Ⅰ-3), スイス産 1(S-3)の計 4点 を用 いて分析方 法 の確 立 を行 った. これ らの試 料 は,す で に ガ ス ク ロマ トグ ラフ ィー質 量 分 析 (GC-MS) で成分分析 をすでに行 った ものであ る (Bankovaeta1.,2002). 薄 層 クロマ トグラフ ィによるポプラ型判定 薄層 クロマ トグラフィ(TLC)は シ リカゲル 薄層板 (AlufolienKieselgelMerck F25L.)を 用 い,石油 エーテル/酢酸 エチル (7:3)を移動 相 と して展開 した. 各 スポ ッ トは紫外光 (366 nm)照射下 で可視化 し, さ らに 60%硫酸 エタ ノール溶液 を噴霧後, 100℃ に加熟 して発色 さ せた.用 いた標準物質 とその薄層上でのスポ ッ トの特徴 は表 1に示 した. 定量分析手順 総 フラボ ンおよび フラボノール量 は塩酸 アル ミナ複合体生成 を もとに した吸光度測定で行 っ た (BonvehiandCoil,1994;Popovaetal"

2003). 総 フラバ ノ ンお よびデ ヒ ドロフラボノ 表l TLCによるポプラ型判定に用いた標準物質 スポッ トの発色 標準物質 Rf値 紫外光 硫酸噴宗 照射下 +加熱 ビノス トロビン ビノセンブリン フェルラ酸ベンジル ガランギン クリシン カフェ酸フェネテル ケンフェロール 82 倍黄色 灰色 63 橿色 黄檀色 57 青 色 灰色 52 暗黄色 黄色 46 暗褐色 黄 色 31 青色 灰色 20 黄色 黄色 63 -ル量 はDAB9によ る比 色法 を標準物 質 に ビ ノセ ンブ リンを用 いることでプ ロポ リス用 に改 良 し, これを適用 した (Nagy and Grancai,

1996;Popovaeta1.,2003).総 フェノール化 合 物 量 は,Folin-Ciocalteu法 (Waterman and Mole, 1994,Woisky and Salatino, 1998)を用 い,標準物質 と して ピノセ ンブ リン / ガ ランギ ン(2:1)混合物 を用 いた.分析方法 とそれ ぞれ の検証 試験 につ いて はPopovaet a1.,(2003)に詳細 を掲載 の予定である. プ ロポ リス抽出液 抽 出に先立 って,冷や したプ ロポ リスを粉砕 し,70%エタノールを用 いて 2段階 の抽 出液を 得 た. まず30mLのエ タノールに 1gのプロ ポ リスを溶解 し, これ を室温 に24時間放 置 し た. これを櫨過 して,同 じ手順で2度 目の抽 出 液を得 た.3回 目抽 出を行 い, これを 5%塩化 第二鉄 と反応 させ,反応 のないことで2回 目ま での抽 出が完全であることを確認 した.抽 出液 は臆紙で臆過 し, 2回分 を合わせ, メスフラス コを用 いて100mLに希 釈 した. この抽 出液 は, このまま総 フラバ ノ ンおよびデ ヒ ドロフラ ボノール量 の定量用 に用 いた. 抽 出液3mLを 50mLのメスフラス コに移 し, メ タノールで希釈 した. これ は総 フェノー ル化合物量 および総 フラボ ンおよび フラボノー ル量 の定量 に用 いた. 高速液体 クロマ トグラフ ィによる分析 高速液体 クロマ トグラフィ (HPLC)分析で は,移動相 と して溶離液A:水/酢酸 (95:5v/ v)および溶離液 B:メタノールを用 い,プ ロポ リス成分 の分離 を行 った.送液量 は毎分 1mL で,溶離液 A 75%:B25%か ら始 めて,10分 後 にB 40%,20分後 に B 50%,45分後 に B 70%, 60分後 に B 100%となるよ うに グラジ ュ ン ト設定 した. フェノール化合物 については 紫外部 吸光 度検 出器 で290nm の吸光度 を測 定 した. プ ロポ リス中の成分 は標準物質 との溶 出時間 によ って仮 同定 し,添加試験 (スパ イク) によ って確認 した. フェノール化合物 (カフェ 醍

,

♪一クマール酸, フェル ラ酸, ク リシン, ガ ランギ ン, ケ ンフェロール, ピノセ ンブ リン,

ピノス トロ ビン, カ フェ酸 フェネテル, カ フ ェ 酸 イ ソペ ンテル, カ フェ酸 ベ ンジル) は濃度 と ピー ク面積 との散 布 図上 で,検 量線 が直線 にな る範 囲 を求 め,検量 用 の濃度 が この範 囲 にな る よ うに して定量 を行 った. プ ロポ リスの試料 液 はメ タノールで希 釈 して,最 終 濃度 が乾燥 プ ロ ポ リス換算 で

1

.

0mg/mL

とな るよ うに した. す べて の分 析 は3反 復 と した.

結果および考察

試 料 プ ロポ リス につ いて の ポプ ラ型 判定 は, 分 類 指標 とな る特 定 の物 質 の有 無 に よ って行 っ た. これ はポプ ラ類 の芽 の疹 出物 に関 して現 在 知 られ て い る化 学 組 成

(

Nagy e

ta1

.

,1

986;

Gr

e

e

nawaye

ta1

.

,1

990;

Bankovae

ta1

.

,

2000)

を もとに, フ ラボ ノイ ドア グ リコ ンと して は, ピノセ ンブ リン, ピノス トロ ビン, ク リシ ン, ガ ラ ンギ ン, ケ ンフ ェロールを, エステル類 と して は, フェル ラ酸 ベ ンジル, カ フェ酸 フェネ テルを指 標物 質 と して選 ん だ. これ らの物 質 を 含 む標準 混合試 液 とプ ロポ リスの アル コール溶 液 を薄層 ク ロマ トグ ラフ ィで比較 した (図 1). 今 回用 いた

4

試料 の うち

3

試料

(

B-

2,I

-

2

お よ びS-3)が,Rf値 ,紫外 光下 お よび発色後 の ス iIr,-.'吋 Jg 2 3 4 5 ,._1 廿 ,A 尭 r 紳 1 . L 鮎 一 F は ･I -i .･ ･ ･ ' ･･ ｣ 6 7 ･ l ノ 準 ー 標 S 3 t･b L･.願 離 必 爵 轡 康 勝 -･ 打 鍵 H 図

1TLC

による試料 プロポ リスの比較 1:ピノス トロビン,2:フェルラ酸ベ ン ジル,3:ピノセ ンプ リン,4:ガランキ ン,5:クリシン,6:カフェ酸 フユネテ ル,7:ケンフェロール ポ ッ ト色 か ら見 て, す べて の指 標物 質 を含 んで お り, ポプ ラを起 源植物 と して い る ことが明か で あ った. これ らの試料 が ポプ ラ起 源 で あ る こ と は す で にGC-MSで も 確 認 済 み で あ っ た

(

Ba

n kovae

ta1

.

,2002)

.

ポプ ラ型 とは異 な る 判 定 とな った試 料I-3は, イ タ リアの シ シ リ-島 で得 られ た もので あ り, 薄 層上 の ス ポ ッ トパ ター ンは明 らか に異 な って お り,GC-MSに よ る分 析 で ジテル ペ ン化 合物 が主要 成分 で あ る こ とが確 認 されて いた

(

Bankovae

tal

リ2002)

.

TLC

に よ る判 定 結 果 に基 づ いて, ポ プ ラ型 の試 料 につ いて は フ ラボ ノイ ドとフェノール化 合 物 の定 量 分 析 を, 吸 光 度 測 定 と

HPLC

を用 いて行 った.

HPLC

によ る定量結 果 は主 な成分 につ いて表2に,典 型 的 な ク ロマ トグ ラムを図

2

に示 した. また表

3

に は吸光度分 析 と

HPLC

の分 析 結 果 の比 較 を, 図

3

に は

HPLC

と同 じ 試料 の

U

V 吸収 スペ ク トル を示 した.

HPLC

の 分 析 で は

1

2

成分 とい う限 られ た成 分 につ いて の定量 で あ ったが, これ らは主 要 成分 で あ り, 両分 析方 法 の結 果 は相互 に信頼 で きる もの とな

蓑2 HPL

C

による試料プロポ リスの定量分析結果 主要成分 B-2 I-2 I-3 S13 007 007 二 0 04 001 0 0 01 フェルラ酸 ♪-クマール酸 ケ ンフェロール カ フェ酸 ベ ンジル カ フェ酸 フェネチル カフェ酸イソペンチル ビノセ ンブ リン ビノス トロビン ガランギ ン 0.01 0.10 - 0.03 0 0.01 0 0.01 0.03 - 012 0.001 0 0 01 0.01 0.26 - 0.35 0 003 0 02 020 034 - 0 08 005 014 001 019 019 - 0 41 005 002 0 01 0.41 0.20 0.14 0.48 0.18 0.03

0

.001 0.02 0.48 0.50 0.19 0.43 0.03 0.03 0.02 0.02 0.02 0.18 - 0.40

0

.

005 001 0.07 054 045 - 0.45 015 008 026 061 050 006 0 26 009 005 001 0

上

段:

3反復の平均,下段 :標準偏差

単

位

は

pg /10

p

g

65

0

10 20 30 ∠】0 50 60 70 保持時間 (分) 図2 HPLCによる分析例 (試料S-3) 1･カフェ酸,2,♪-クマール酸,3:フェルラ酸,4: ケ ンフェロ-ル,5'ピノバ ンクシン310-酢酸 暮,6: カフェ駿ベ ンジル, 7:ピノセ ンブリン, 8:カフェ 散 フェネチル,9:カフェ酸イソペ ンチル,10:クリ シン, ll:ガランギン,12.ビノス トロビン *標準試料が入手できないため定量は行わなかった って いて, それ ぞれ充分 に一 致 して い るといえ る.HPLC に よ る定 量 に お い て は,多 くの 場 合 , フ ラボ ンとフ ラバ ノ ンで吸光 度分 析 よ り も 低 い値 が得 られ, これ は12成 分 以外 の同頬 の 微 量 成 分 がHPLCの分 析 結 果 で は加 算 され な いためで あ ると考 え られ る.総 フ ェノール化合 物 量 で も予想 よ り若 干 低 い値 にな る こ とが あ っ た. これ は試料 の差 によ って,標 準物 質 と した ピノセ ンブ リン/ ガ ラ ンギ ン(2:1)が 同等 の指 標 性 を示 さ な い た め で あ る と思 わ れ る. しか し,実 際 の フェ ノール化 合 物総 量 よ り も低 い値 とはいえ,通常 の分 析 にお いて は充分 に実 用可 能 な範 囲 で あ る. これ以上 の精度 を求 め ると し た ら非常 に複雑 で時間 のか か る定量 分 析 の手 順 と,多大 な機 材 コス トが必要 とされて しま う. 試 料Ⅰ-2は ポプ ラ型 で はなか ったが,上 記 の 手 順 によ って分析 を行 い, これ によ って,他 の 起 源植物 の プ ロポ リスで は品質 の信 頼性 が低下 す る ことを示 した. ポプ ラ型 プ ロポ リスに含 ま れ る成 分 の含 有量 は予想通 り非常 に少 なか った. 蓑 3 試料プロポ リス中の生理活性物質群 試料 方法 F+F F+D Ph B12 UV i.42 HPLC 1.15 I-2 UV 1.58 HPLC 1.24 Ⅰ-3 UV 4.1 HPLC 06 S-3 UV 1.15 HPLC 107 054 263 0.63 265 0.58 2.45 0.68 2.84 1.8 4.0 1.9 3.9 0.49 2.42 0.49 2.71 単位 はmg/g F+F:フラボンおよびフラボノール F+D:フラバノンおよびデ ヒ ドロフラボノール Ph:総 フェノール化合物 200 250 波長(nm) 300 350 図3 試料 S-3の UV スペク トル 典型的なポプラ型パ ター ンである. GC-MSに よ る分 析 で, 抗 菌 作 用 を示 す ラ ブ ダ ンお よび ク レロダ ン骨格 を持 っ ジテル ペ ン酸 類 の存在 は明か で あ った (Bankovaeta1.,1996, Velikovaeta1.,2000)の で, この試 料 も生 理 活 性 は持 っ が, その主体 が成 分 的 に は フェノー ル化 合物 で はな く, したが って その定量 の ため に は別 の何 らか の手 法 を用 い る必要 が あ る. 以上 の結 果 は,起 源植物 か らの プ ロポ リス判 定 が 有 効 で あ る こ と を 支 持 す る もの で あ る (BankovaandMarcucci,2000).また起 源植 物 を知 る ことが今 日的 な プ ロポ リスの規 格化 や 品質 管理 にお いて決定 的 な重要 性 を持 つ ことを 示 して い る といえ るだ ろ う. (著者の住所は下記参照 翻訳 中村純) 主 な引用文献

Bankova,V.,S.L DeCastroandM.C.Marcucci. 2000.Apidologie31:3-15.

Bankova, V" A.Dyulgerov, S. Popov, L Evstatieva, L Kuleva, 0. Pureb and Z ZamJansan.1992.Apidologie23:79-85. Bankova,V andL.Kuleva.1989.Anlm Sc12:,

Bankova,Ⅴ.,M.Popova,S.Bogdanov,A.G. Sabatinl.2002.Z.Naturforsch.57C:530-533 Bankova,V.and M.C.Marcucci.2000.Bee

World81:182-188.

Bankova,Ⅴ,M C Marcucci. S. Simova, N. Nikolova,A.KuJumgiev and S Popov.1996. Z.NaturforSh.51C:277-280.

Banskota,A.,T.Nagaoka,L Y.Sumioka,Y.

Tezuka, S. Awale, K. MidorikaWa, K. Matsushige and S. Kadota. 2002. J. EthnopharmaCOl.80:67-73.

Banskota,A.H,,Y.Tezuka,andS.Kadota.2001. Phytother.Res.15:56ト571,

Bonvehi,J.S.andF.Ⅴ.Coll.1994.Z.Naturfol`SCh. 49C:712-718.

Burdock,GA.1998 Food Chem.Toxicol.36: 347-363.

Gal-Cia-Viguera,C.,F.Ferreres,andF.A.Tomas -Barberan.1993.Z.NaturforSCh.48C:731-735. Garcla-Viguera,CHW.Greenaway,F,R Whately.

1992 Z Naturforsch.47C:634-637. Ghisalberti,E.L.1978 BeeWorld60:59-84 Greenaway,Wリ T.Scaysbrook T.and F,R.

Whately.1990.BeeWorld71:107-118. Hegazi,A.and F.K.Abd EIHady.2000 Z.

Naturforsch.56C二82-88.

Krol,W ,S.Scheller,Z Czuba,T.Matsuno,G. Zydowicz,J.Shani and M Mos. 1996.

∫

. Ethnopharmacol.55:19-25.

Kujumgiev,A.,Ⅴ.Bankova,A.IgnatovaandS. Popov.1993.Pharmazie48:785-786.

KujumgleV,A.,I.Tsvetkova,Y.Serkedjieva.,V. Bankova,R.Christov and S.Popov.1999.J. Ethnopharmacol.643:235-240.

Marcucci,M.C.1995.Apidologle26:83-99. Markham,K.RリK.A.Mitchell,A.L WilklnS,∫

A.DaldyandY.Lu.1996.Phytochemistry4. 205-211.

Metzner,H,H.BekemeieI-,M.Paintz and E. Schneidewind.1979.Pharmazie34:97-102. Nagy,EHV.Papay,G LitkelandZ.Dinya.1986.

Stud.Org.Chem.Amsterdam.23:223-232. Nagy,M.and D.Grancai.1996.Pharmazle51:

100-101.

Usia, T., A.H. Banskota, Y.Tezuka, K. Midor'ikawa,K.Matsushige and S.Kadota. 2002 ∫.Nat.Prod.65:673-676.

Vellkova,M ,V Bankova,I.Tsvetkova,A. Kujumgiev, and M. C.Marcucci. 2000. Fitoterapia71:693-696.

Vlllanueva,Ⅴ.R.,M.Barbier,M.GonnetandP.Lavie. 1970.Ann.Inst.Pasteur,ParlS118:84-87.

Villanueva,V.R.,D.Bogdanovsky,M.Barbier,

M.Gonnetand and P.Lavle.1964.Ann,Inst.

Pasteur,Paris106:292-302.

Woisky,R.G.andA.SalatlnO.1998.JApic.Res. 37:99-105.

MILENA PopovA】,VASSYA I∋ANIくOVAl,DANIELA BUTOVSKAl, vALENTIN PETKOVl, BoRYANA DAMYANOVAl, ANNA GLORIA SABATINI2, GIAN

LuIGI MARCAZZAN2 and STEFAN BoGDANOV3.

Poplartype propolis and analysts Ofits bi o-logically active components,Honeybee Science

(2003)24(2):61-66.1)InstltuteOfOrganicChe m-istrywithCentl`eOfPhytochemlStry,Bulgarian AcademyofSclenCeS,Acad G.Bonchevstr.B1 9,1113So売a,Bulgarla, 2)NationalInstituteof

Beekeeping,80ViadlSaliceto,40128Bologna,

Italy, 3) swiss Bee Researcll Centre, FAM

Liebefeld, Schwarzenburgstr. 161, CH-3003 Bern,Switzerland.

Manystudieshaveshownthatinthetemper -atezonebeesalmostexclusivelycollectpropolis from thebudexudateofpoplartrees.Themain componentsofpropolisinthesereg10nSarethe typical "poplar bud'' Phenolics: flavonoid aglycones, cinnamlC acids and their esters, knowntOberesponslbleforessentialpharmac 0-10gicalactivitiesofbeeglue:antimicrobial,anti -inRammatory, hepatoprotective, antioxldative,

immunomodulatlng,etC.Obv10uSly,the quan-tiRcat10n Ofthesesubstancesisofcruciali m-portancefortheuseofpropollSpreparatlOnSln mediclne.Tocharacterizethequalityofpoplar propolis,wedevelopedasimpleTLC procedul`e forproving identity ofpoplarorigin,followed by rapid spectrophotometric quantincation of theImportantcompoundgroups(totalnavones and flavonols by the AIC13 method, total f

lavanones and dihydroflavonols by the 2,

4-dinitrophenylhydrazine method.and totalphe -nolicsbytheFolin-Ciocalteumethod)usi ngaP-ProprlateStandards.Identity testisofcrucial Importance,becauseforpropolisofotherplallt origln the analytical procedures described would be irrelevant,due to unsuitablest and-ardsand calibration.Foursamples(from BU卜 garia, Switzerland and Italy) have been

analyzed by theproceduresdescribed and the resultscon月rmedbyHPLCanalysュsOfthemain lndユVldualcomponents.Theresultssupportthe "source plant" approach to propolis analysis anddemonstratethattlleknowledgeofpropolis plantsourcesISOfdecislVeimportanceinup-t o-datepropolisstandardization and quality c on-trol.