岡 山 医 誌 (1994) 106, 1159∼1170
神 経細胞 の取 り込 み作 用 に関す る形態学 的研 究
-光
学 顕 微 鏡 的 お よ び 電 子 顕 微 鏡 的 研
究-岡 山大学 医学 部 第一解 剖 学教 室(指 導:佐 々木順 造教 授)
木
村
康
裕
(平成6年9月8日
受稿)
Key words:取
り込 み作用,神 経 細胞, HRP,鉄,光
学 顕微 鏡,電 子顕微 鏡
緒 言 神 経 細 胞 は そ の 主 た る 機 能 で あ る情 報 伝 達 の 面 か ら現 在 ま で数 多 くの 研 究 が な さ れ て きて い る.し か し な が ら,神 経 細 胞 は 蛋 白合 成 等 の 代 謝 活 動 も盛 ん で,神 経 内分 泌 機 能 に 代 表 さ れ る よ う な 内 分 泌 機 能 等 も知 られ る よ う に な っ て き て新 た な神 経 細 胞 の 機 能 と して 注 目され て きた1). そ の た め,最 近 で は 神 経 細 胞 を神 経 伝 達 機 能 の み を有 す る神 聖 な 細 胞 とみ な す の で は な く,他 の 細 胞 と何 ら変 わ らな い種 々 の 機 能 を 有 す る細 胞 と し て と ら え て 研 究 対 象 とす る よ うに な っ て き て い る.そ して,電 子 顕 微 鏡 を 利 用 し形 態 学 的 検 索 を し て み る と,神 経 細 胞 と くに そ の 細 胞 体 内 で は,ゴ ル ジ装 置 や 粗 面 小 胞 体 等 の 豊 富 な 細 胞 内 小 器 官 が 認 め られ,機 能 的 に は 蛋 白合 成 が 盛 ん に 行 わ れ て い る.し か も,特 徴 的 に 長 い 神 経 突 起 を有 す る神 経 細 胞 で は そ の 突 起 の 中 を, 細 胞 体 と そ の 突 起 の 終 末 部 との 間 で の 物 質 の 盛 ん な 動 きが よ く知 られ て い る.す な わ ち細 胞 体 内 で 作 られ た 代 謝 産 物 が 神 経 突 起 の 中 を 流 れ て 行 く機 構 が 軸 索 流 と し て 注 目 さ れ て き た2). 電 子 顕 微 鏡 的 に 神 経 突 起 に は 神 経 細 管 や 神 経 細 糸 が 認 め られ,こ の 軸 索 流 を構 造 的 に 支 え て い る こ とが 証 明 さ れ,こ の 流 れ の 方 向 か ら順 行 性 と逆 行 性 の2つ の もの が 良 く知 ら れ て,そ の 機 構 も詳 細 に研 究 され 明 らか にされ て きてい る2,3). 一 方,神 経 解 剖 学 で は 神 経 投 射 線 維 連 絡 の 研 究 に,西 洋 ワ サ ビの ペ ロ キ シデー ス(Horseradish peroxidase, HRP)と い う酵 素 が こ の 逆 行 性 軸 索 流 に 乗 っ て 神 経 末 端 よ り神 経 細 胞 体 へ と流 れ て行 く現 象 を利 用 し たHRP神 経 投 射 検 索 法 が, KristenssonとOlsson4,5)さ ら に, LaVail6)に よ り導 入 され,神 経 投 射 の 研 究 が 飛 躍 的 に 進 歩 し た.こ の 原 理 は, HRPを 神 経 終 末 部 の 筋 肉 付 近 や 神 経 線 維 の 途 中 に 注 入 す る と,神 経 細 胞 に 取 り込 ま れ,軸 索 流 に 乗 っ て,逆 行 性 に そ の 神 経 細 胞 体 に 輸 送 さ れ る現 象 を う ま く利 用 して 起 始 細 胞 体 が 同定 さ れ る仕 組 み で あ る.し か し な が ら,こ の よ う な物 質 が ど の よ うに して 神 経 細 胞 に 取 り込 ま れ,い か に 軸 索 流 に 乗 っ て 流 れ る か, い か に 処 理 され るか,ど の よ うな 影 響 を受 け る の か に つ い て の 研 究 は 少 な い. 今 回,著 者 は こ の よ う に 神 経 細 胞 に と っ て あ ま り毒 性 を示 さ な い物 質 で あ るHRPと,ラ ジ カ ル を 発 性 し毒 性 の 極 め て 強 い と考 え られ る塩 化 第 二 鉄 の2種 類 の 物 質 を そ れ ぞ れ 神 経 系 組 織 に 投 与 し て,神 経 細 胞 内へ の 取 り込 み と そ の 運 命,ま た 神 経 細 胞 に 与 え る影 響 に つ い て,光 学 顕 微 鏡 的 お よ び 電 子 顕 微 鏡 的 に そ の 形 態 学 的 特 徴 に つ い て検 討 し た の で 報 告 す る. 材 料 と 方 法 I. HRP投 与 例 実 験 動 物 と して は ウ ィ ス タ ー 系 雄 ラ ッ ト10匹 を 用 い た.ま ずHRP(Type VI, Sigma)の 褐 色 の 粉 末 を生 理 食 塩 水 に 溶 か して50% HRP溶 液 を 作 成 した.こ のHRP溶 液 を 以 下 の 方 法 で ラ ッ ト坐 骨 神 経 に 注 入 し た.ラ ッ トを ネ ン ブ タ ー ル で麻 酔 し,右 側 の 梨 状 筋 の 下 縁 で 坐 骨 神 経 を 露 出 し た.ピ ンセ ッ トで 坐 骨 神 経 の 神 経 周 膜 を で き る だ け イ ン タ ク トの 状 態 で 神 経 の み を 挫 滅 11591160 木 村 康 裕 させ,そ の 部 位 に ハ ミル トン の マ イ ク ロ シ リン ジ で50% HRP溶 液 を 注 入 した.こ れ は坐 骨 神 経 か らの 外 部 へ の 露 出 を 最 少 に し,神 経 へ の 取 り 込 み を有 効 に す る た め の 方 法 で あ る,一 方,他 の 左 側 の 坐 骨 神 経 に つ い て も 同 様 に 坐 骨 神 経 を 挫 滅 させ,マ イ ク ロ シ リ ン ジ でHRPの 代 わ り に 生 理 食 塩 水 を 注 入 し,コ ン トロ ー ル側 と し て 利 用 し た.そ して,注 入 のHRPの 取 り込 み と そ の 運 命 を観 察 す る た め, 3日, 1週 間 そ し て 2週 間 後 の 時 間 経 過 をお い て 観 察 し た. 組 織 化 学 的 染 色 法 こ れ らの 実 験 動 物 を前 述 の 経 過 で,そ れ ぞ れ ネ ン ブ ター ル で麻 酔 し実 験 に 供 し た.す ばや く 開 胸 し て 心 臓 を 露 出 し,カ テー テ ル を左 心 室 に 挿 入 し て,ポ ンプ を使 い ヘ パ リ ン化 し た0.9%の 生 理 食 塩 水 で 灌 流 し,血 液 を 洗 い 流 し た.そ の 後, 1%グ ル ター ル ア ル デ ヒ ドと1%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ドを0.1Mリ ン酸 緩 衝 液 に 溶 か した 溶 液 で 再 び 灌 流 固定 した.坐 骨 神 経 お よ び 脊 髄 を す ば や く取 り 出 し,同 じ固 定 液 に24時 間 浸 漬 し た.そ の 後, 30%シ ョ糖 リン 酸 緩 衝 液(pH 7.4) に 入 れ 保 存 し た.ク ラ イ オ ス タ ッ トを利 用 し て 厚 さ80∼120μmの 凍 結 切 片 を作 成 して,リ ン酸 緩 衝 液 に 浸 漬 し た.凍 結 切 片 を過 酸 化 水 素 水 と3, 3´-ジア ミ ノベ ン チ ジ ン(DAB)を 含 む ト リス 塩 酸 緩 衝 液(pH 7.6)に 入 れ, Graham and Karnovskyの 方 法7)に 準 じてHRPの 発 色 組 織 化 学 反 応 を行 っ た. 30分 間 反 応 させ,そ の 後 生 理 食 塩 水 で よ く洗 浄 した.光 学 顕 微 鏡 的 に は こ の 切 片 を 脱 水 して,エ ン テ ラ ン に て 封 入 して 観 察 した. 一 方 ,電 顕 的観 察 のた めに は,こ れ らの発色 組 織 化 学 的 染 色 を 施 した 切 片 を1%四 酸 化 オ ス ミウ ム に て 後 固 定 し,ア セ トン で脱 水 後,エ ポ ン 樹 脂 に 包 埋 し た.ウ ル トラ ミク ロ トー ム に よ り準 超 薄 切 片 を作 成 し, HRP陽 性 神 経 細 胞 や 神 経 線 維 部 位 を 同 定 し て,さ ら に そ の 部 位 の み の 超 薄 切 片 を作 成 し た 。HRPの 電 子 密 度 の 高 い 反 応 産 物 を観 察 しや す い よ うに電 子 染 色 を行 わ ず, 電 子 顕 微 鏡(JEM 100-CX)で 観 察 し確 認 し た 後,電 子 染 色 を行 い さ ら に 観 察 し た. II.塩 化 第 二 鉄 投 与 例 実 験 動 物 と してSD系 雄 ラ ッ ト(7-9W)10匹 を 用 い た.ネ ン ブ ター ル で ラ ッ トを麻 酔 し,脳 固 定 装 置 に ラ ッ トの 脳 を 固 定 し た.そ の 後,マ イ ク ロ ピペ ッ トを 利 用 し て,ブ レ グマ よ り1mm 後 方,側 方 に1mmさ らに 深 さ2mmの 位 置 の ラ ッ ト左 大 脳 皮 質 感 覚 運 動 野 に, 0.1M塩 化 第 二 鉄 溶 液5μlを5分 か け て 注 入 し た.そ の 後,投 与3 時 間, 3日 そ し て3週 間 後 の そ れ ぞ れ の 時 間 経 過 を追 っ て 実 験 に 供 した.そ れ ぞ れ の 時 間 経 過 で ラ ッ トを ネ ン ブ ター ル に て 麻 酔 し,左 心 室 よ り生 理 食 塩 水 で 灌 流 した.そ の 後, 4%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ドと0.4%グ ル ター ル ア ル デ ヒ ド混 合 固 定 液 に て さ ら に 灌 流 した.す ば や く脳 を取 り出 し,大 脳 皮 質 部 と海 馬 領 域 を 中 心 に 組 織 ブ ロ ッ ク を作 成 して, 4%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド 溶 液 の 後 固 定 液 に 浸 漬 し た.そ の 後, 15%シ ョ 糖 リン 酸 緩 衝 液 に 入 れ,ク ラ イ オ ス タ ッ トに て 凍 結 切 片 を 作 成 して,そ れ ぞ れ の 組 織 化 学 染 色 に 供 し た. 組 織 化 学 的 染 色 法 1) Perlsの 溶 液 に よ る従 来 の 鉄 染 色 法 凍 結 切 片 を 直 接 ゲ ラ チ ン コー トされ た ガ ラ ス に 載 せ,す ば や く冷 風 で 乾 燥 させ,以 下 の 液 に 浸 漬 して 鉄 反 応 させ た. Perlsの 溶 液(使 用 直 前 に 作 成 し た, 2%フ ェ ロ シ ア ン化 カ リ ウ ム と2 %塩 酸 との 等 量 混 合 液)に 入 れ,室 温 で40分 間 反 応 さ せ た.そ の後,蒸 留 水 で よ く洗 浄 し た 後, 1%中 性 赤 染 色 液 に て3分 間 核 染 色 を 施 し た. そ し て,ア ル コー ル で 脱 水 し,エ ン テ ラ ン に 封 入 して カ バ ー グ ラ ス を 載 せ 光 学 顕 微 鏡 的 に 観 察 し た. 2) Perls+DABの 高 感 度 鉄 染 色 法 従 来 の 方 法 に, 3, 3´-ジア ミ ノベ ン チ ジ ン反 応 を付 け 加 え る 染 色 法 で,従 来 の 方 法 よ り も極 め て 高 感 度 に 鉄 を検 出 す る こ とが 可 能 に な っ た. こ の 方 法 はPerls+DABの 高 感 度 鉄 染 色 法8)と 呼 ば れ る. ま ず,凍 結 切 片 の 載 せ て あ る ス ラ イ ドグ ラ ス を前 述 のPerlsの 溶 液 に 浸 漬 し,室 温 で30分 間 反 応 させ た.そ の 後,脱 イ オ ン 化 し た 蒸 留 水 で こ れ ら の 切 片 を よ く洗 浄 した.次 い で,切 片 を 15分 間0.5% DABと1%過 酸 化 水 素 を含 む リン 酸 緩 衝 液(pH 7.4)に 浸 漬 した.そ の 後,再 び 脱 イ オ ン化 した 蒸 留 水 で30分 程 度 よ く洗 浄 した.
神 経 細 胞の取 り込 み作 用 の形 態学 的研 究
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そ して,そ の 切 片 を ス ラ イ ドグ ラ ス の 上 に載 せ 乾 燥 させ た後, 2%中 性 赤 染 色 液 に て カ ウ ン タ ー 染 色 を し,エ ンテ ラ ンで透徹 して カバー グラ ス を 載 せ 光 学 顕 微 鏡 的 に 観 察 し た. 電 子 顕 微 鏡 的 検 索 に は,鉄 を投 与 さ れ た ラ ッ トを ネ ン ブ タ ー ル で 麻 酔 し,す ば や く開 胸 し て 左 心 室 よ りポ ン プ を利 用 して 生 理 食 塩 水 を灌 流 し て 血 液 を洗 い 流 し, 4%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド と0.4%グ ル ター ル ア ル デ ヒ ドの 混 合 固 定 液 に て さ ら に 灌 流 固 定 した.そ の 後,す ば や く脳 を 取 り出 し,海 馬 領 域 を 中心 に 組 織 ブ ロ ッ ク を作 成 した.こ れ ら の 組 織 ブ ロ ッ ク を4%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド液 で さ らに12時 間 固定 し た.次 い で, 1%四 酸 化 オ ス ミウ ム に て 後 固 定 し た.そ し て,ア セ トン で 脱 水 しエ ポ ン 樹 脂 に 包 埋 した. ウ ル トラ ミ ク ロ トー ム に よ り超 薄 切 片 を作 成 し て,電 子 顕 微 鏡(JEM 100-CX)で 観 察 した. 結 果 I. HRP投 与 例 1.光 学 顕 微 鏡 的 所 見 (A) HRPを 投 与 し た 坐 骨 神 経 褐 色 に 染 め 出 さ れ たHRP陽 性 神 経 線 維 が 波 打 つ よ うに 認 め られ,投 与 さ れ たHRPが 外 か ら神 経 突 起 内 に 取 り込 ま れ,さ ら に 神 経 突 起 内 を逆 行 性 に 輸 送 さ れ て い るの が よ くわ か る(図 1a).コ ン トロ ー ル 側 の 坐 骨 神 経 で は,そ の よ う に 褐 色 に 染 ま っ た神 経 線 維 は 認 め ら れ な か っ た.図1bは 坐 骨 神 経 の 中 枢 側 へ 行 っ た とこ ろ の 途 中 の 像 で あ る が,HRP投 与 部 位 か ら離 れ た 部 位 で も,神 経 突 起 の 中 に 褐 色 に 染 ま っ たHRP 陽 性 神 経 線 維 が 認 め られ,中 枢 側 へ と 流 れ て い る こ とが わ か る. (B)脊 髄 に お け る坐 骨 神 経 の 起 始 細 胞 坐 骨 神 経 の 起 始 細 胞 が 存 在 す る所 属 レベ ル で の 脊 髄 神 経 節 や 脊 髄 前 角 に は,多 数 のHRP陽 性 神 経 細 胞 が 認 め ら れ た.図1cは 脊 髄 前 角 に 現 れ たHRP陽 性 神 経 細 胞 で あ る.坐 骨 神 経 を 形 成 して い る 大 型 の 運 動 神 経 細 胞 が 特 異 的 に 陽 性 に な っ て 現 れ て き て い る 。 一 方,反 対 側 の そ れ ら に は 決 し てHRP陽 性 神 経 細 胞 を認 め る こ とは な か っ た. さ ら に,こ れ ら のHRP陽 性 神 経 細 胞 を強 拡 大 で 観 察 す る と,核 の 周 囲 に 褐 色 の 顆 粒 状 の HRP陽 性 物 質 が 集 積 して い るの が 認 め られ た(図 1d). 2.電 子 顕 微 鏡 的 所 見 脊 髄 前 角 部 に お け る坐 骨 神 経 の 起 始 細 胞 に つ い て 詳 細 に 観 察 し た.脊 髄 前 角 に お い てHRP陽 性 細 胞 を 含 ん で い る エ ポ ン プ ロ ッ クか ら準 超 薄 切 片 を作 成 して,ト ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 を施 し 光 学 顕 微 鏡 で 観 察 し た の が 図2aで あ る.こ の 図 か ら もHRP陽 性 物 質 が核 の 周 囲 に 集 ま っ て い るの が よ くわ か る.坐 骨 神 経 に 投 与 さ れ 逆 行 性 に 流 れ て きたHRPは,電 子 顕 微 鏡 的 に は 電 子 密 度 の 高 い 物 質 と して 検 索 で き た.そ し て 電 子 顕 微 鏡 的 に も こ れ ら の 物 質 は核 の 周 辺 に 多 く 集 ま り,電 子 密 度 の 高 い ラ イ ソ ゾ ー ム と し て観 察 さ れ た(図2b).こ れ ら の もの を さ ら に 強 拡 大 で観 察 し た の が 図2cで あ る.ラ イ ソ ゾ ー ム に は 膜 状 の もの が 認 め られ た. HRPを 取 り込 ん だ こ れ ら の 神 経 細 胞 体 は 時 間 が 経 過 して も,核 の 融 解 や ピ ク ノー シ ス 等 の 細 胞 変 性 所 見 は 一 向 に 認 め ら れ な か っ た.そ して,こ れ らの 電 子 密 度 の 高 い物 質 は 細 胞 体 内 の ラ イ ソ ゾ ー ム に 吸 収 処 理 され,投 与 後2週 間 目 の 例 で は これ らの 物 質 は 消 失 して し ま う こ とが 電 顕 的 に確 認 さ れ た. II.塩 化 第 二 鉄 投 与 例 1.光 学 顕 微 鏡 的 所 見 投 与 部 位 の 大 脳 皮 質 を,投 与 後3時 間 と い う 極 く早 期 に つ い て 従 来 の 鉄 染 色 法 で検 索 して み る と,鉄 投 与 部 位 に の み 限 局 して 青 色 に鉄 が 染 め 出 され て き て い る.し か し,そ の 周 辺 部 の 大 脳 皮 質 に は 陽 性 反 応 は 認 め ら れ な い.(図3a). 一 方,高 感 度 鉄 染 色 法 で検 索 し た例 で は,鉄 投 与 部 位 は も ち ろん の こ と褐 色 に 強 力 に 染 ま り, そ れ 以 外 に も投 与 部 位 の 周 辺 部 の 大 脳 皮 質,脳 梁 さ ら に は 海 馬 領 域 へ もハ レー 状 に 陽 性 反 応 が 認 め られ,鉄 染 色 の 感 度 が 増 して い る の が よ く わ か る(図3b). さ ら に 強 拡 大 で 詳 細 に 観 察 した の が,図4で あ る.図4aは 従 来 の鉄 染 色 法 を施 し た 大 脳 皮 質 運 動 野 の もの で あ る.鉄 投 与 部 位 は,青 色 に 強 陽 性 に 染 色 さ れ,そ の 周 辺 部 位 に は 多 くの 神 経 細 胞 が 認 め ら れ る が,鉄 陽 性 の 部 位 や 鉄 染 色 陽 性 の 神 経 細 胞 は 認 め ら れ な い.図4bは 高 感1162 木 村 康 裕 図1 HRP投 与例 の光 学 顕 微鏡 的所 見 1a 坐 骨 神 経 のHRP投 与 部 位 の光 学 顕 微 鏡 像(×140),褐 色 のHRP陽 性 神 経 線 維 が 波 打 つ よ うに 認 め られ, HRPが 取 り込 まれ て い る. 1b 坐 骨 神 経 の 中枢 側 の 途 中 の部 位 の 光 学 顕微 鏡 像(×250), HRP投 与 部位 か ら離 れ た部位 で も,褐 色 に 染 まっ たHRP陽 性 神 経 線 維 が 認 め られ る. 1c HRP投 与 側 の脊 髄 横 断 切 片 の光 学 顕 微 鏡 像(×120),脊 髄 前 角 部 にHRP陽 性 の大 型 神 経細 胞 が 多 く認 め られ る. 1d HRP陽 性 前 角 細 胞 の 強拡 大 光 学 顕微 鏡像(×350), HRP陽 性 細 胞 を強拡 大 で観 察 し てみ る と, 核 の 周 りに褐 色 の 顆 粒 状 のHRP陽 性 物 質 が 集 積 して い るの が認 め られ る.
神経 細 胞の 取 り込み 作用 の形 態学 的研 究
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図2 HRP投 与 例 の 電子 顕 微 鏡 的所 見 N:核 2a HRP陽 性 前 角 細 胞 の エ ポ ンプ ロ ッ クか らの 準超 薄 切 片 の光 学 顕微 鏡 像(ト ル イ ジ ン ブル ー 染 色) (×1000), HRP陽 性 物 質 が核 の周 囲 に 集 ま って い る. 2b HRP陽 性 前 角 細胞 の電 子 顕微 鏡 像(×6400), HRP陽 性 物 質 は 電子 密 度 の 高 い ラ イ ソゾー ム と して 観 察 され る. 2c HRP陽 性 前 角 細 胞 の 強拡 大 電 子 顕微 鏡 像(×28000),ラ イ ソ ゾー ムに は,膜状 の もの が認 め られ る.1164 木 村 康 裕 図3 塩 化 第 二鉄 投 与 例 の 弱 拡大 光 学 顕 微 鏡 的所 見 C:大 脳 皮 質 H:海 馬 3a 通常 の鉄 染 色 法 に よ る光 学 顕微 鏡 像(×19),鉄 投 与 部位 に 限局 して,青 色 に鉄 が 染 め 出 され て き て い る.そ の 周 辺部 の大 脳 皮 質 に は,陽 性 反 応 は認 め られ な い. 3b 高感 度 鉄 染 色 法 に よ る光 学 顕微 鏡 像(×19),鉄 投 与 部位 は もち ろん の こ と褐 色 に強 力 に染 ま り, そ れ 以外 に も投 与部 位 周 辺 部 の大 脳 皮 質,脳 梁 さ ら に は海 馬領 域 へ もハ レー状 に陽 性 反 応が 認 め ら れ,鉄 染 色 の 感 度 が増 して い るのが よ くわ か る.
度鉄 染色 法 で観察 した もの であ る.鉄 投 与部位
は褐 色 に強 く染 色 され てい る.さ らに その周 辺
部の 大脳 皮質 に は,ド ッ ト状 の褐 色 の反 応物 質
が認 め られ,ま た褐 色の 反応 物質 を取 り込 んだ
神 経 細胞 も多 く観 察 され た.海 馬領域 に つ いて
高感 度鉄 染色 法 で観察 したの が,図4cで
あ る.
脳 梁部 は 強 く染 色 され,そ の 腹側 部 には褐 色 の
ドッ ト状 の鉄 反応 陽性 物質 が 観察 され た.ま た,
多 くの 錐体 細 胞層 を構 成 す る神経 細 胞が 特異 的
に鉄反 応 陽性 物質 を取 り込 ん でい た.こ れ らの
錐体 細 胞 はや や細 く変 形 し,変 性 を思 わせ る所
見 を呈 して いた.
神 経細 胞 の取 り込 み作用 の 形態 学的研 究
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図4 塩 化 第 二鉄 投 与 例 の 強拡 大 光 学 顕微 鏡 的 所 見 C:大 脳 皮質 P:海 馬領 域 の錐 体 細 胞 層 4a 大脳 皮 質 の 投 与部 位 周 辺 部 の光 学 顕微 鏡 像(×100)(従 来 の鉄 染 色 法 に よ る),鉄 投与 部 位 は 強 陽 性 に染 ま り,そ の 周辺 部 位 に は 多 くの 神 経細 胞が 観 察 され るが,鉄 染 色陽 性 所 見 は認 め られ な い. 4b 大 脳 皮 質 の 投 与部 位 周 辺部 の光 学 顕微 鏡 像(×160)(高 感度 鉄 染 色 法 に よ る),鉄 投 与 部 位 は褐 色 に強 く染 まっ て い る.そ の 周 辺部 には ドッ ト状 の 褐 色 の反 応 物 質が 認 め られ,そ れ を取 り込 ん だ神 経 細 胞 も多 く観 察 され る. 4c 海 馬 領 域 で の高 感 度 鉄染 色 法 に よ る光 学 顕 微 鏡像(×100),脳 梁 部 は 強 く染 色 され,そ の 腹側 部 に は 褐 色 の ドッ ト状 の鉄 反応 陽 性物 質 が 観察 され,錐 体 細 胞 層に は鉄 反 応 陽性 物 質 を取 り込 んだ神 経 細 胞 が 多 く認 られ る.1166 木 村 康 裕 図5 塩 化 第 二鉄 投 与 例 の 海 馬領 域 錐 体 細 胞 層 で の電 子 顕微 鏡 的所 見 N:核 5a 正常 ラ ッ トの 錐体 細 胞の 電 子 顕微 鏡 像(×11000),明 る く丸 い形 の 細 胞 で,核 は円 形 で 明 る く,細 胞体 内 に は細 胞 内小 器 官 が よ く発達 して,活 発 な代 謝機 能 を行 って い るこ とが想 像 され る. 5b 鉄 投 与 ラ ッ トの錐 体 細 胞 の 電 子 顕微 鏡 像(×12000),核 は凝 集 して,細 胞体 内 は構 造 物 が 一様 に な って しま っ てお り,細 胞 内小 器 官 の 発達 は認 め られ ない, 5c 正 常 ラ ッ ト錐 体 細 胞 層 で の神 経 膠 細 胞 の電 子顕 微 鏡 像(×11000),細 胞 内 に は特 徴 的 に グ リオフ ィ ラ メ ン トが 豊 富 に 認 め られ る. 5d 鉄 投 与 ラ ッ トの錐 体 細 胞 層 での 神 経 膠 細 胞 の電 子 顕 微 鏡 像(×11000),神 経 膠 細 胞 自体 が や や 肥 大 し,グ リオ フ ィ ラ メ ン ト以外 に 多 くの ラ イ ソゾー ムが 認 め られ る.
神 経 細胞 の取 り込 み作 用 の形 態学 的研 究
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2.電 子 顕 微 鏡 的 所 見 海 馬 領 域 に 存 在 す る神 経 細 胞 と神 経 膠 細 胞 の 2種 類 の 細 胞 に つ い て,錐 体 細 胞 層 を 中 心 に 観 察 した.図5aは 正 常 の 錐 体 細 胞 で あ る が,明 る く丸 い 形 の 細 胞 で,核 は 円 形 で 細 胞 体 内 に は 多 くの 細 胞 内小 器 官 が よ く発 達 し て,活 発 な 代 謝 機 能 を行 っ て い る こ とが 想 像 され る.神 経 細 胞 以 外 に も神 経 膠 細 胞 が 存 在 して お り,や や 小 型 の 細 胞 で 細 胞 体 内 に は グ リア特 有 の 線 維(グ リ オ フ ィ ラ メ ン ト)が 豊 富 に 認 め ら れ,核 は 明 る い(図5c).鉄 投 与 例 で,錐 体 細 胞 を観 察 す る と,ほ とん ど変 性 の 見 ら れ な い 神 経 細 胞 も あ る が,多 くの 神 経 細 胞 の 核 は 融 解,ピ ク ノー シ ス を呈 し て,明 ら か で な く,そ の 細 胞 体 内 は 構 造 物 が 一 様 に な っ て し ま っ て お り,細 胞 内 小 器 官 の 発 達 は 認 め ら れ な い.ま た,電 子 密 度 の 高 い物 質 が 多数 認 め られ,細 胞 体 内 に 取 り込 ま れ た鉄 が 細 胞 体 内 で は こ の よ う な形 を呈 し て い る と思 わ れ た(図5b). 鉄 投 与 例 の 神 経 膠 細 胞 は,そ の 数 が 反 応 性 に 増 加 し て お り,神 経 膠 細 胞 自体 もや や 肥 大 し, グ リオ フ ィ ラ メ ン ト以 外 に 多 くの ラ イ ソ ゾ ー ム が 認 め ら れ た(図5d). 考 察 神 経 細 胞 は 前 述 の よ うに,種 々 の 機 能 を有 す る細 胞 で あ り,決 して 情 報 の 伝 達 と い う1つ の 機 能 の み を有 す る もの で は な い.神 経 細 胞 体 で 神 経 伝 達 物 質 な ど種 々 の 物 質 を合 成 して 神 経 終 末 へ 順 行 性 に 輸 送 す るの み な らず,外 部 か ら も 種 々 の 物 質 を 取 り込 み,細 胞 体 へ 逆 行 性 に輸 送 し,し か も そ こ で 処 理 す る とい う一 般 的 な能 力 を も兼 ね 備 え た 細 胞 で あ る こ とが 明 ら か に な っ た. HRPを 坐 骨 神 経 に 投 与 した 理 由 は, ① 坐 骨 神 経 は 簡 単 に 露 出 で き,容 易 にHRPを 投 与 す る こ とが 可 能 で あ る, ② 大 変 長 い経 路 を経 て, 決 ま っ た脊 髄 レベ ル の脊 髄 神 経 節 や 脊 髄 前 角 部 に起 始 細 胞 が 存 在 す る, ③ 左 右 交 叉 す る こ とが な い 等 で,実 験 経 路 と し て極 め て 適 切 で あ る と 考 え られ た.坐 骨 神 経 にHRPを 投 与 して12時 間 後 に, HRPで ラ ベ ル さ れ た 神 経 細 胞 が,坐 骨 神 経 に所 属 す る 脊 髄 神 経 節 や 脊 髄 前 角 部 に 認 め ら れ,坐 骨 神 経 の 軸 索 内 を か な りの ス ピー ドで HRPが 逆 行 性 に 輸 送 され る こ とが 明 らか に な っ た2). 電 子 顕 微 鏡 的 に は, HRPを 含 む ラ イ ソ ゾ ー ム が 核 の 周 辺 に 集 合 し て 行 き,取 り込 ま れ たHRP が2週 間 で ラ イ ソ ゾー ム で 吸 収 処 理 さ れ て,完 全 に 消 失 し て し ま っ て い た.こ の 際,ラ イ ソ ゾ ー ム に は 特 徴 的 に ク リス タ や 膜 状 の 構 造 物 が よ く観 察 さ れ た.こ れ は 坐 骨 神 経 にHRPを 投 与 す る 時 の 神 経 周 膜 や 神 経 内 膜 の 破 壊 産 物 に よ る もの で あ る か も知 れ な い.従 来,神 経 伝 達 物 質 に 放 射 線 性 物 質 で ラ ベ ル し た も の や 神 経 伝 達 物 質 と構 造 的 に よ く似 た 物 質 を 投 与 す る と容 易 に 神 経 終 末 か ら こ れ らの 物 質 が 取 り込 ま れ る こ と が 知 られ て い た. HRP以 外 に もEvans blueの よ う な 蛍 光 色 素 や コバ ル トな どの 重 金 属 を 注 入 して,神 経 細 胞 内 に 取 り込 ませ て 神 経 投 射 経 路 を検 索 す る 方 法 も あ る9,10). しか し,こ れ らの 方 法 の 中 で 最 も取 り込 み 作 用 の 効 率 の 良 い の がHRPで あ る. HRPに 関 し て は 低 分 子 量 の 糖 蛋 白 とい う こ と が 一 番 取 り込 み を有 利 に して い る理 由 で は な い か と思 わ れ る. しか も光 学 顕 微 鏡 の み で しか 検 索 で き な い蛍 光 色 素 に 比 較 して,HRPは 光 学 顕 微 鏡 の み な らず そ の 陽 性 細 胞 の 超 微 細 構 造 を電 子 顕 微 鏡 的 に 検 索 可 能 で あ り,極 め て 有 効 な 物 質 で あ る.ま た, HRPを 取 り込 ん だ 神 経 細 胞 に は核 の 融 解 や ピ ク ノー シ ス 等,変 性 を思 わ せ る所 見 が な く全 く影 響 を受 け て い な い こ と も 明 ら か と な っ た.こ の こ とは,従 来 の 神 経 細 胞 の 活 動 す な わ ち,伝 達 物 質 を盛 ん に 合 成 す る 能 力 を残 し て 研 究 で き る 点 で,伝 達 物 質 の 同 定 と投 射 経 路 の 同 定 とが ダ ブ ル 染 色 法 で も可 能 と な り極 め て 有 能 な 研 究 方 法 とな る条 件 を満 た す も の と思 わ れ た10). 一 方,鉄 は 強 力 な ラ ジ カ ル 発 生 物 質 で,生 化 学 的 に 鉄 イ オ ン を 脳 内 に 投 与 す る こ と で,フ リ ー ラ ジ カ ル が 発 生 して.OHな ど の 活 性 酸 素 種(Reactive Oxygen Species; ROS)が 活 発 に 産 生 さ れ る事 が 証 明 さ れ て い る11).そ して 脳 内 出 血 に 伴 い 赤 血 球 よ り遊 離 し た ヘ モ グ ロ ビ ンや そ の 中 に 存 在 す る鉄 イ オ ン の 神 経 細 胞 傷 害 へ の 可 能 性 お よ び そ の 関 与 様 式 に 関 し て,脳 浮 腫 や 外 傷 て ん か ん の 成 因 の 機 序 の 解 明 か ら注 目 さ れ て い る12).血球 か ら遊 離 し た 鉄 イ オ ン(Fe2+あ る い
1168 木 村 康 裕 はFe3+)は 組 織 内 に 存 在 す る過 酸 化 水 素 と反 応 してROSが 発 生 す る と考 え ら れ て い る.さ ら に,こ れ ら のROSは 脳 内 の 神 経 細 胞 に 極 め て 多 く存 在 し,容 易 に 酸 化 され 易 い 不 飽 和 脂 肪 酸 を 過 酸 化 す る こ とで,細 胞 膜 傷 害 の 直 接 原 因 と な る.そ の 結 果,神 経 細 胞 の 機 能 傷 害 を起 こ し, て ん か ん 焦 点 形 成 へ と導 く と考 え ら れ て い る. 実 際,ラ ッ トや マ ウ スの 大 脳 皮 質 に 鉄 イ オ ン を 少 量 投 与 す る こ と で,極 め て 早 期 か ら電 気 的 放 電 が 生 じ,て ん か ん モ デ ル の 実 験 動 物 が 形 成 さ れ る こ とが よ く知 ら れ て い る11-14).そ の た め 毒 性 を 示 す 鉄 イ オ ン に 関 して は,そ の 直 接 的 影 響 の た め に神 経 細 胞 が 変 性 す る も の と考 え られ 易 い が,本 実 験 よ り鉄 が ま ず 神 経 細 胞 に 取 り込 ま れ て,神 経 細 胞 体 が 変 性 す る 可 能 性 も考 え ら れ た.本 研 究 に お い て は,毒 性 の 強 い 鉄 イ オ ン で も神 経 細 胞 が 取 り込 む こ とが 明 ら か に な っ た. 神 経 細 胞 は 有 利 な 物 質 の み を選 択 的 に 取 り込 む の で は な く,鉄 を 取 り込 ん だ 神 経 細 胞 は 強 く傷 害 を 受 け る こ と が 電 顕 的 に 明 らか に さ れ た が, 一 部 の 神 経 細 胞 で は,充 分 に 神 経 細 胞 の 活 動 を 維 持 し て い る が,鉄 を取 り込 ん だ こ とで,異 常 放 電 す る 能 力 を持 っ て い る も の の 可 能 性 が 考 え られ た. て ん か ん 焦 点 の神 経 細 胞 の 形 態 学 的 特 徴 に つ い て は よ くわ か っ て い な い の が 現 状 で あ る.鉄 を 取 り込 ん で は い る が,そ の 神 経 細 胞 の 核 の 癒 合 や ピ ク ノー シ ス 等 の 変 性 を 疑 わせ る所 見 が な く,充 分 に 神 経 細 胞 と し て 機 能 す る もの が 異 常 放 電 をす る こ と で,て ん か ん 焦 点 を形 成 す る 可 能 性 も あ る と考 え ら れ た. 結 論 神 経 細 胞 に と っ て あ ま り毒 性 を 示 さ な い 物 質 で あ るHorseradish peroxidase(HRP)と, ラ ジ カ ル を発 生 し毒 性 の 極 め て 強 い と考 え ら れ る塩 化 第 二 鉄 の2種 類 の 物 質 を そ れ ぞ れ 神 経 組 織 内 に 投 与 し て,神 経 細 胞 内 へ の 取 り込 み とそ の 運 命,ま た 神 経 細 胞 に 与 え る影 響 等 に つ い て 光 学 顕 微 鏡 的 お よ び 電 子 顕 微 鏡 的 に,そ の 形 態 学 的 特 徴 に つ い て検 討 し て 次 の 結 果 を得 た. 坐 骨 神 経 で は, HRPが 神 経 突 起 内 に 取 り込 ま れ て,軸 索 流 に 乗 っ て 逆 行 性 に 輸 送 され て い る の が 観 察 さ れ た.坐 骨 神 経 が 入 る脊 髄 レベ ル の 脊 髄 神 経 節 細 胞 や 脊 髄 前 角 細 胞 に は,多 数 の HRP陽 性 神 経 細 胞 が 認 め ら れ た.こ れ らHRP 陽 性 神 経 細 胞 を 電 顕 的 に 検 索 す る と,電 子 密 度 の 高 い 物 質 が 核 の 周 辺 に 多 く集 ま り,電 子 密 度 の 高 い ラ イ ソ ゾー ム と して も観 察 で き た.経 過 を お い て 観 察 した が,神 経 細 胞 の 変 性 所 見 は 認 め られ な か っ た.そ し て,こ れ ら の 電 子 密 度 の 高 い 物 質 は 細 胞 体 内 の ラ イ ソ ゾ ー ム に 吸 収 処 理 さ れ, HRP投 与 後2週 間 目 に は 消 失 して し ま う こ とが 確 認 され た. 一 方,鉄 投 与 例 で は 光 顕 的 に 投 与 後3時 間 と い う極 く早 期 に従 来 の 鉄 染 色 法 で 検 索 して み る と,投 与 し た 部 位 に の み 限 局 して 認 め られ た. しか し な が ら高 感 度 鉄 染 色 法 を行 っ た 例 で は, 鉄 投 与 部 位 は もち ろ ん の こ と,投 与 部 位 の 周 辺 部 で も鉄 陽 性 の 所 見 を示 し,鉄 陽 性 神 経 細 胞 が 認 め ら れ た.鉄 投 与 部 位 か ら少 し離 れ た 海 馬 領 域 の 錐 体 細 胞 層 を電 顕 的 に 観 察 す る と,神 経 細 胞 は 極 端 な 変 性 像 を 呈 して き た.神 経 膠 細 胞 に つ い て は,そ の数 が 反 応 性 に 増 加 して お り,そ の 細 胞 体 内 に は 電 子 密 度 の 高 い 物 質 が 多 数 認 め ら れ た.こ の よ う な 変 性 を示 す 神 経 細 胞 と神 経 膠 細 胞 が,特 に 海 馬 領 域 に 多 く認 め ら れ た. 取 り込 ま れ たHRPは 神 経 細 胞 に 対 して は 毒 性 を示 さず,ラ イ ソ ゾ ー ム に よ っ て処 理 さ れ た. そ の 理 由 に はHRP自 体 が 糖 蛋 白 で あ る た め 取 り込 み 易 く,処 理 され 易 い こ とが 考 え ら れ た. 一 方,鉄 は 強 力 な ラ ジ カ ル 産 生 物 質 で,そ の 直 接 的 影 響 の た め に 神 経 細 胞 が 変 性 す る も の と考 え られ 易 い が,本 実 験 よ り鉄 が ま ず 神 経 細 胞 に 取 り込 ま れ た 後,神 経 細 胞 を 変 性 させ る 可 能 性 も考 え ら れ た.ま た,鉄 を 含 む こ と で 神 経 細 胞 が 異 常 放 電 を し て,て ん か ん の 焦 点 形 成 に 関 与 して い る の で は な い か と も考 え られ た. 稿 を終 え るに 当 た り,長 年 ご指 導 い た だ い た故 大 塚長 康教 授,ま た実 験指 導,原 稿 の ご校 閲 を い ただ い た佐 々 木順 造 教 授,水 川公 直 元 講 師,苅 田成 人技 官 ほ か解 剖 学教 室 第一 講 座 の 諸 兄姉 に深 甚 な感 謝 の 意 を表 し ます.
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文
献
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