アブラナ科植物の自家不和合性遺伝子座におけるゲノム構造変異の解析

アブラナ科植物の自家不和合性遺伝子座におけるゲ

ノム構造変異の解析

著者

藤本 龍

号

857

発行年

2005

URL

http://hdl.handle.net/10097/16604

氏

名(本籍)

学 位 の 種 類

学 位 記 番 号

学位授与年 月目

学位授与 の要件

研 究 科 専 攻

学 位 論 文 題 目

ふ じ も と り ょ う

藤

本

龍

博

士(農

学)

農

博

第857号

平

成18年3月24日

学 位 規 則 第4条

第1項

該 当

農 学研 究科 応用 生命 科 学専 攻

(博 士課程)

ア ブ ラナ科 植 物 の 自家 不 和合 性 遺伝 子 座 にお け るゲ ノム

構造 変 異 の解析

論 文 審 査 委 員

(主

査)教

授

西

(副

査)教

授

鳥

教

授

山

剛

哉

行

欽

知

尾

山

谷

論

文

内

容

要

旨

緒言

被 子 植 物 の 多 くは 、 自家 受 精 を 防 ぎ近 交 弱勢 を 回避 す る 自家 不 和 合 性 とい

う機 構 を持 っ て い る。 ア ブ ラナ科 植 物 の 自家 不 和合 性 は ∫ 遺 伝 子 座 に よっ て

制 御 され て お り、∫ 遺 伝 子 座 に は柱 頭 側 の認 識 分 子 で あ るSRK(5receptor

】dnase)と花粉 側 の認 識 分 子 で あ るSP11(510cusprotein11)、

さ らにSRKの

レ

セ プ タ ー ドメイ ン と高 い相 同性 を示 すSLG(5Llocusglycoprotein)の

遺 伝 子 が

座 乗 して い る。 これ らの 遺 伝 子 間で は 組 換 えが 起 こ らず 、1っ

の 遺 伝 子 で あ

るか の よ うに遺 伝 す るた め 、5ハ

プ ロ タイ プ と呼 ば れ て い る。5ハ

プ ロタ イ

プ の数 は β74∬∫cα018rαc8α

で50、 且r4ραで約30同

定 され て い る。Eo1θ74cεα

や 丑r4ρ α の 多 くは 自家 不 和合 性 を示 す が 、 自家 和 合 性の 変 異 体 が 幾 つ か存

在 す る。且r4即 、B.01ε7σc紹の5RK、3P11の

塩 基 配 列 は種 内 の ∫ハ プ ロタ イ

プ 間 で 大 き く異 な る が 、異 な る種 の 間 で は 撚

、5P11の

相 同性 が 高 い 組 合

せ が複 数 見 出 され る。 これ ら種 間 の類 似5ハ

プ ロ タ イ プ(種 間 ペ ア)は 、 同 じ

認 識 特異 性 を有 す る こ とが示 され 、 これ らの組 合 せ は共 通 の5ハ

プ ロ タイ プ

か ら分 化 した もの で あ る と考 え られ た。3遺

伝 子 座 の ゲ ノム 構 造 は ∫ ハ プ ロ

タイ プ 間 で 非 常 に多 様 性 に 富み 、 この構 造 の多 様 性 が.3ハ プ ロタ イ プ 間 で の

組 換 え を抑 制 してい る と考 え られ て い る。 一 方 、5遺

伝 子 座 内 で 組 換 え が 生

じた 可能 性 が示 唆 され る3ハ

プ ロタ イ プ の組 合 せ がB.r4ρ αで1組

報 告 され

て い る。

本 研 究 で は 、∫ 遺伝 子 座 の ゲ ノ ム構 造 の比 較解 析 を種 間 と種 内 で 行 っ た。

種 間 の解 析 は 、種 間ペ ア を用 い 、種 分 化 後 の ∫遺伝 子座 の ゲ ノム 構 造 の変 異

につ い て解 析 した。 種 内 の 解析 は 、組 換 えが 生 じた 可 能 性 が 示 唆 され て い る

組 合 せ を用 い 、∫ 遺 伝 子 座 の塩 基配 列 を詳 細 に比 較 した 。 ま た 、 自家 和 合 性

品種YellowSarson、

自家 和 合 性 系統0-205、F、

品種CR-Seiga54の

自殖 分 離

集 団 よ り生 じた 和合 性 変 異 体 の 自家 和 合 性 の原 因 を明 らか に す る た め、∫ 遺

伝 子座 の ゲ ノ ム構造 の解 析 を行 った。

第1章

β7α

∬加 の5遺

伝 子 座 のゲ ノム 構 造 解析

第1節5遺

伝 子 座 の 種 間 の ゲ ノ ム 構 造 比 較

Ro1εrαcε α とEr4ρ

α の5遺

伝 子 座 の ゲ ノ ム 構 造 の 比 較 を 行

う た め 、3組

の

種 間 ペ ア(Bz5-46沼05-OZβz5-47田05-12,βr5-60/Bo5-15)の

∫ 遺 伝 子 座 の ク ロ ー

ニ ン グ 及 び 塩 基 配 列 の 決 定 をBo5-07、

βr5-46、 β03-12、Br5。47

_{、β03-15、 βzぷ60}

の そ れ ぞ れ32kb、79kb、83kb、54kb、56kb、86kbに

つ い て 行 っ た 。 そ れ

ぞ れ の 組 合 せ に お い て 、訳 κ、∫P11の

遺 伝 子 構 造 は 比 較 的 保 存 さ れ て い る が 、

ど の 組 合 せ に お い て も 丑01εrαcεα の ∫ 遺 伝 子 座 の 方 が 且r4ρ α の5遺

伝 子 座

よ り広 範 囲 に 及 ぶ こ と を 明 ら か に し た(Fig.1-1,1-2,1-3)。Ro1θ7αc印

の5遺

伝 子 座 に 多 く の レ ト ロ ト ラ ン ス ポ ゾ ン が 存 在 し 、 ∫ 遺 伝 子 座 に 座 乗 し て い る

レ ト ロ ト ラ ン ス ポ ゾ ン を ∬F(旦locusretoro垂ransposonfamily)と

名 付 け た 。 合

計 で7つ

の ∫蹄(Bo∬FO勉

、Bo∬F124、,80∬F12わ

、 βo∬F12c、

βo∬F12冨

、

Bo∬F15α

、Bz∬F60の

が 見 出 さ れ 、β05ZF12cはNon-m(longteminalrepeat)

型 の レ ト ロ トラ ン ス ポ ゾ ン で 、 他 の6つ

はL:rR型

の8塑

理3グ

ル ー プ に 分 類

さ れ た(Fig.1-4)。

ま た 、 各sTFのLrR間

と 種 間 ペ ア の 遺 伝 子(撚

と3P11,

の イ ン ト ロ ン の 塩 基 置 換 率 の 比 較 か ら 、 こ れ ら の ∬Fの

挿 入 は 種 分 化 以 降 で

あ る こ と を 明 ら か に し た 。

以 上 の 結 果 か ら 、Eo1εrαc印

の5遺

伝 子 座 の 方 が 丑r4ρ α の3遺

伝 子 座 よ

り も 広 範 囲 に 及 ぶ 原 因 は 、種 々 の レ ト ロ ト ラ ン ス ポ ゾ ン が 種 分 化 後 且01εrαc印

の5遺

伝 子 座 に 挿 入 さ れ た た め で あ る と 考 え た 。

第2節

種 内の5遺 伝子座 のゲ ノム構 造 の比較

5遺

伝 子 座 は 、5ハ

プ ロ タ イ プ 間 の 構 造 の 多 様 性 か ら 、 遺 伝 子 座 内 で の 組

換 え が 抑 制 され て い る と 考 え ら れ て い る 。 し か し 、 一 方 で βτ5・08と

βr5-46.

の ハ プ ロ タ イ プ 問 で5遺

伝 子 座 内 で の 組 換 え が 生 じ た 可 能 性 が 挙 げ られ て い

る 。 そ の 可 能 性 を 検 証 す る た め に 、2つ

の5ハ

プ ロ タ イ プ の5遺

伝 子 座 の ク

ロ ー ニ ン グ と 塩 基 配 列 の 決 定 を 行 っ た 。Bz5-08に

お い て51kbの

領 域 を ク ロ

ー ニ ン グ し

_{、塩 基 配 列 を 決 定 し 、既 に 決 定 さ れ て い る β75・46の5遺}

_{伝 子 座(第}

1章

・第1節)と

比 較 し た 。5ハ

プ ロ タ イ プ 間 で 多 様 性 が 高 い ∫ 遺 伝 子 座 内 に

お い て100%に

近 い 相 同 領 域 が2箇

所 見 ら れ た(Fig.1-5)。

こ の こ と か ら 、 こ

れ ら2つ

の ハ プ ロ タ イ プ 間 で は 、2つ

の 相 同 領 域 の 両 端 で 計4回

の 組 換 え 、

も し く は2っ

め 相 同 領 域 で2回

のgeneconversionが

生 じ た 可 能 性 が 考 え ら れ

た 。5遺

伝 子 座 で は 組 換 え が 抑 制 さ れ て い る と 考 え ら れ る こ と と 、gene

conversionの

方 が イ ベ ン トの 回 数 が 少 な く て す む こ と か ら 、geneconversio丑

が 生 じ た 可 能 性 が 高 い と 考 え た 。 ま た 、Br5-08、B7&46と

そ れ ら の 種 間 ペ ア

で あ るBo5-32と

β05-7の4ハ

プ ロ タ イ プ 間 で 、geneconversionが

生 じ た 領 域

内 に 存 在 す る 舐Kの

カ イ ネ ー ス ド メ イ ン の 塩 基 配 列 を 比 較 す る と 、 種 間 ぺ

ア で の 相 同 性 よ り も βr5-08と

βr3-46の

組 合 せ の 相 同 性 が 高 か っ た 。 こ の こ

と か ら 、geneconversionは

種 分 化 後 に 生 じ た 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。

第2章

自家 和 合 性 変 異 体 の 和 合 性 変 異 の解 析

第1節Bz叩

α、YbllowSalsonの

自家 和合 性 変 異 の解 析

『Ybll

owSarsonの

自 家 和 合 性 の 変 異 が3遺

伝 子 座 に 連 鎖 す る こ と が 示 さ れ て

い た の で 、5遺

伝 子 座 の ク ロ ー ニ ン グ を 行 い 、 訳 κ、5P11を

含 む 合 計78kb

の 領 域 の 塩 基 配 列 を 決 定 し た(Fig.2-1)。

さ ら に 、 同 じ ∫ ハ プ ロ タ イ プ で 自

家 不 和 合 性 を 示 す ∫ ハ プ ロ タ イ プ で あ る β75-54を

見 出 し 、 そ の 種 間 ペ ア で

あ るBo∫ 一28も 明 ら か に し た 。 得 ら れ た 塩 基 配 列 か らYbllowSarsonの5RKと

5P11に

フ レ ー ム シ フ ト変 異 や ナ ン セ ン ス 変 異 は 見 ら れ ず 、 完 全 長 の 推 定 ア

ミ ノ 酸 配 刻 が 予 測 で き た 。YdlowSarsonのSRK、SP11の

推 定 ア ミ ノ 酸 配 列

と βr∫一54、 β05-28の

ア ミ ノ 酸 配 列 を 比 較 し た 結 果 、YbllowSarsonのSRKと

SP11に

は 機 能 に 大 き な 影 響 を 与 え る と 考 え ら れ る ア ミ ノ 酸 置 換 は 見 ら れ な

か っ た 。YellowSarso皿

の5RK、5P11の

発 現 解 析 を ノ ー ザ ン プ ロ ッ ト分 析 で

行 っ た と こ ろ 、 ど ち ら も 発 現 が 見 ら れ な か っ た(Fig.2-2)。

そ こ で 、 両 遺 伝

子 の ゲ ノ ム 構 造 を 調 べ た 。 ∫RKの

ゲ ノ ム 構 造 を 『YbllowSarson、Br∫

一54,Bo5-28

で 比 較 し た 結 果 、プ ロ モ ー タ ー 領 域 、終 止 コ ド ン よ り 下 流 領 域 はYellowSarson

とB7∫ 一54で 高 い 相 同 性 が 見 ら れ た が 、 『YbUowSarsonに

の み ∫Rκ の 第1イ

ン

ト ロ ン に4,982bpの

レ ト ロ ト ラ ン ス ポ ゾ ン の 挿 入 が 見 ら れ た(Fig.2-3)。

こ

の こ と か ら 、YdlowSarosnの

㎜(の

発 現 が 見 ら れ な い 原 因 は レ ト ロ トラ ン

ス ポ ゾ ン が 挿 入 さ れ た た め で あ る と 考 え た 。5P11の

ゲ ノ ム 構 造 に つ い て 同

様 に 比 較 す る と 、 「

跣110wSarson、

βr5-54、Bo5-28の

間 で プ ロ モ ー タ ー 領 域 、

エ キ ソ ン 、 イ ン ト ロ ン 、3'UTRと

も に 高 い 相 同 性 が 見 ら れ た 。 し か し 、Ybllow

Sarsonに

の み プ ロ モ ー タ ー 領 域 に89bpの

欠 失 が 見 ら れ た(Fig.2-4)。Ybllow

Sarsonの

∫P11プ

ロ モ ー タ ーGUSを

オ74鋸gρ 廊

云

加 伽 朋

に 導 入 し た と こ ろ 、

得 ら れ た 形 質 転 換 体 で σ03の

発 現 が 見 られ な か っ た が 、 β03P11-28の

プ ロ モ

ー タ ーGUSで

は ん

伽1伽4の

蔚 でGUSの

発 現 が 見 ら れ た こ と か ら

、Yellow

Sarsonの5P11の

プ ロ モ ー タ ー 領 域 は 活 性 を 失 っ て い る こ と を 明 ら か に し た 。

以 上 の 結 果 か ら 、 突 然 変 異 に よ っ て 訳Kと

εP11の

正 常 な 転 写 が 起 こ ら な

い こ と がYう110wSarsonの

自 家 和 合 性 の 原 因 で あ る こ と を 明 ら か に し た 。

第2節RoZεrαcθ

αvaLα1わoわ励7α の 自 家 和 合 性 変 異 の 解 析

且01ε7αcε4の

自 家 和 合 性 系 統0-205は

、 自 家 不 和 合 性 の β03-08と

のF2を

用 い た 連 鎖 解 析 か ら 、 自 家 和 合 性 が5遺

伝 子 座 と 連 鎖 し て い る こ と が 分 か っ

た 。0-205の

∬(}は

βo飢 σ一28と99.3%と

高 い 相 同 性 を 示 し た こ と か ら 、Bo5-28

の 自 家 和 合 性 変 異 体 で あ る と 考 え た 。Bo照28の

第1エ

キ ソ ン 、『第2エ

キ

ソ ン と βo∫P11-28の

全 長 を プ ロ ー ブ に 、0.205の

ゲ ノ ムDNAを

用 い て サ ザ

ン プ ロ ッ ト分 析 を 行 っ た 結 果 、0-205は

訳 κ の 第1、2エ

キ ソ ン と3P11を

欠

失 し て い る こ と が 明 ら か と な り 、 こ の 欠 失 が0-205の

自 家 和 合 性 の 原 因 で あ

る と 考 え た(Fig.2-5)。0-205、

β0328、

βz∬4(Bo5・28の

種 間 ペ ア)の ∬ σ の

非 同 義 置 換 率 の 比 較 か ら 、0-205と

βo∫一28の 分 化 は 、B.7￠pα

とB.01θ アαcθ

α

の 種 分 化 後 で あ る と推 定 し た 。

第3節

ハ クサイ系統 にお け る 自家和合性 変異 の解明

ハ ク サ イ のF、 品 種CR-Seiga54(Bア5-46沼75-54)の

自 殖 分 離 集 団 に お い て 、

βr∫一46ホ モ 、Br5-54ホ

モ の 自 家 不 和 合 性 を 調 査 し た 結 果 、 βr5-54ホ

モ 個 体 中

に5つ

の 自 家 和 合 性 個 体 が 得 ら れ た 。B7∬4の

自 家 和 合 性 個 体 と 自 家 不 和 合

性 個 体 と の 相 互 交 配 の 結 果 か ら 、 自 家 和 合 性 の 要 因 が 柱 頭 側 に あ る こ と が 分

か っ た 。 さ ら に 自 家 和 合 性 個 体 と 自 家 不 和 合 性 の βr5-46と

を 交 配 し、F2を

作 成 し て 連 鎖 解 析 を 行 な っ た 結 果 、 こ の 自 家 和 合 性 が ∫ 遺 伝 子 座 と 連 鎖 し て

い る こ と が 分 か っ た 。 こ の こ と か ら 、 こ の 和 合 性 個 体 の ∫ ハ プ ロ タ イ プ を

Br5-54プ

と し た 。 柱 頭 側 に 自 家 和 合 性 の 原 因 が あ る こ と か ら 、5RKの

発 現 に

つ い て 調 べ た 。RPPCRで

∫RKのmRNAの

発 現 を 調 べ た 結 果 、Br5-5ガ

で 発

現 が 確 認 さ れ た(Fig.2-6A)。RealtimePCRでB7∫

一54rとBr5-54の

訳KのmRNA

の 量 を 比 較 し た 結 果 、 有 意 な 差 は 見 ら れ な か っ た(Fig.2-6B)。

ウ ェ ス タ ン ブ

ロ ッ ト分 析 を 行 っ た 結 果 、 β虐5ガ

と 臨5-54の

ど ち ら に もSRKタ

ン パ ク 質 が

検 出 さ れ た(Fig.2-6C)。

よ っ てB75-5・ げ の ∬LKは

正 常 に 発 現 し て い る と 考 え

た 。5RKの

遺 伝 子 構 造 を 調 べ た と こ ろ 、Br5-54プ

とBr∫.54と

で 塩 基 配 列 が 異

な り 、 自 家 和 合 性 個 体 の 皿Kの

一 部 は 飢 σ と100%の

相 同 性 を 示 し た こ と か

ら 、 ∬Gの

一 部 分 が 訳Kと

の 間 でgeneconversionを

起 こ し た こ と が 明 ら か

に な っ た(Fig.2-7)。

以 上 の 結 果 か ら 、自 家 和 合 性 ∫ ハ プ ロ タ イ プ βz5・54プの 和 合 性 の 原 因 は 、

鉱G

か ら 釈Kへ

のgeneconversionに

よ りSRKの

認 識 特 異 性 が 失 わ れ た こ と に よ

る こ と が 明 ら か に な っ た 。

結語

βr復

∬加

の ∫ 遺伝 子 座 のゲ ノム構 造 につ いて 、3組

の種 間 ペ ア を用 いて 比

較 した 結 果 、B.01εrαcε4の ∫遺 伝 子 座 の方 が 且r4ρ α の3遺

伝 子 座 よ りも広

範 囲 に及 び 、そ れ は種 分 化 後 且o妙

〃c印 の5遺

伝 子 座 に レ トロ トラ ンス ポ ゾ

ン が 挿 入 され たた め で あ る と考 え た 。 レ トロ トラ ンス ポ ゾ ン とゲ ノム サ イ ズ

と の 関係 につ いて は未 だ 明 らか に は な っ て いな い が 、Ro1ε7αc印

とEr叩4

の ゲ ノム サ イ ズ は大 き く変 わ らな い こ とか ら、Ro1ε7αc印

の5遺

伝 子 座 に は

特 異 的 に レ トロ トラ ンス ポ ゾ ン が挿 入 され た と考 え られ る 。∫ 遺 伝 子 座 で は

組 換 えが 起 こ りに くい と考 え られ てお り、 同様 に組 換 え が 起 こ りに くい と さ

れ て い るセ ン トロメ ア に は レ トロ トラ ンス ポ ゾ ンが 多 く蓄 積 して い る こ とが

分 か って い る。 また 、B7α∬たα の3遺

伝 子 座 は ∫ ハ プ ロタ イ プ 間 で 多 様 性 に

富 む こ とが 知 られ て い る が 、βア3-8とBr∫ 一46の5遺

伝 子 座 で は、2つ

の領 域

にお い て 高 い相 同性 が 見 られ た 。 この こ とか ら、 こ の組 合 せ にお い て 、∫ 遺

伝 子 座 内で2つ

の領域 でgeneconversionが

種分 化 以 降 に 生 じた 可 能 性 が示 唆

され た 。1)70∫(励

吻 で は組 換 えが 抑 制 され て い る領 域 で 対 立 遺 伝 子 間 で のgene

conversionが

生 じた こ とが 示 され て い る。 組 換 え の 抑 制 と レ トロ トラ ンス ポ

ゾ ン の挿 入やgeneconversionの

関連 性 を示 唆 す る知 見 が 得 られ た 。

3つ

の 自家 和合性 系 統 の和 合 性 変 異 に つ い て解 析 した 結 果 、3者

と もに 自

家 和 合 性 の原 因 は3遺

伝 子 座 と連 鎖 して い た 。β7&5ガ

の 自家 和 合 性 の原 因

は 皿Gか

ら5RKへ

のgeneconversionに

よっ てSRKの

認 識 特 異 性 が 失 われ た

た め で あ る こ とが 明 らか に な っ た 。 こ の よ うな 同 一 ハ プ ロタ イ プ 内 にお け る

、

∬ σ と ∫RKの 間 で のgeneconversionの

明 確 な証 拠 は本 研 究 で初 め て明 らか

に な っ た。YellowSarson、

βr5-54、 βo∫

一28の 訳K、51P11の

遺 伝 子 構 造 の 比較

か ら、YbllowSarsonに

見 られ る変 異 は 種 分 化 後 に 生 じた 変 異 で あ り、0-205

の 変 異 も βz5-54、Bo5-28の

∬Gと

の 比 較 か ら種 分 化 後 に 生 じた変 異 で あ る

と推 定 され た。βr5・54プ

のgeneconversionも

、用 い た 材 料 が 自家 不 和合 性 系

統 を親 とす るF1品 種 で あ る こ とを考 慮 す る と、最 近 の 変 異 で あ る と考 え られ

る。

以 上 の 研 究 か ら 、5遺

伝 子 座 に は レ トロ トラ ン ス ポ ゾ ン の 挿 入 やgene

conversionと い った構 造 変 異 が 種 分 化 後 も生 じて お り、そ の 中 に は 、飢 κ、5P11

に 変 異 が 生 じ自家 和合 性 に な っ た もの が 存 在 す る こ とが 明 らか とな っ た。

(A) β武5・46 SP11

照

蕪

BoS-07 一 一 ψ' 96・7鉾! resionA の     、 、93.9易 鞠 鴨 噛 隔r陶r595護5% サ の re.onB隔 隔 (Bl SP11 23.1kb- 9.4kb-6.6kb 4.4kb一 23kb 2.Okb 0746 嚇 A-1

Bo5卿7ご

SRK

■

舶

踊

腎

■

轟

贈 A-2 A-3 0746 (A)

鮒21ピ

一

嚥 ≧・

ai ai Fig町e.1-1.Comp肛isonof出egenome stn1{加eofthe510cusbetwee皿 βz5L46 andBoS-07. (A)PhysicalmapsoftheSlocusofBrS-46andβ05-07.Black:boxes血dicatetlle SPITandSRKgenes.Awhitebox indicatestheBb∬FO7召leg三 〇n.Gray boxesrepresenttheregionshavinghigh similazitybetweenBrS-46andBoS-07. Nucleotideidentityisshownabovethe boxasapercentage,Bdd血1esshow此 regionsusedasprobesofSouthern-blot aaalysis. (B)Southern-blotanalysisofgenomicDNA sofBoS-07andBrS46usingthe probesofA-1,A-2A-3,andB-1.Avowsi ndicatethebandsizeestimatedbythe sequences.DNAsizemazkersare indicatedontheleftinkilobases(kb).     レ ヱヱ ぬ む む   ム  

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置========ゴ=芒=≒

■

、

㎞

Figure1。2.Compaゴsonofthegeno皿estmctureofthe∫10cusbe重weenBr∫ 一47a且dβ05・12. (A)Physicalmapsofdle∫10cu協ofβ75-47andBo5」12.]Blackboxesilldicatethe甜 「2,∬6,5Zσ,

飢L2,∫P11,andε 囮(genes.「 附teboxeshldicateBo51FIZ24,Bo∫ZF72傷Bo∫ 工F12ら β05ZFZ24

andル 配)R一 砒 ε か α贋 ρ030π.Glayboxesshowtheregionshav血g1蹟ghs㎞ 皿aritybetwee豆Bハ3・47

andβ05-12.The1画ghshnj】aゴty了e鋲onswe■e蝕u皿beled丘onllto13,andthelengthsofthese regionsinβ75-47andnucleotideidentitiesweleasfb皿ows,1.349bp,85.0%;2.875bp,88.6%;3. 249bp,84.4%;4.350bp,96.3%;5.829bp,92。8%;6.479bp,91.7%;7.250bp,98.4%;8.599 bp,91.1%;9,924bp,94.1%;10.306bp,89.1%:11.288bp,94.5%;12.281bp,87.7%;13.439 bp,91.1%. α3)Genomestructuleof凹10fβ75L47compaledwith血3tofβ05・12.Black:boxesale重he exonsofεP11,andtheothelboxesalelegionsin重he血tlon.TheintronofεPllofβ75-47was

.Grayboxes(甜 η1h∬ 一1,一2,一4)arehighdivided量ntofbulregions,5PIli1旺一1,一2,。3,and-4 s㎞ 丑afitylegionsbetweenβr5-47andβ05-12.Nucleoddeidend匠esaleshownabovetheboxes・

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業藁

_{∴繕.一 旗 蒙讐 一 …}

Figule1-3.Comparisonofthegenomestruc血eofthe510c題sbetweenB雌60and80ぷ15. Physicalmapsofthe510cusofβ 澱5・60andβ05・15.Blackboxesi皿dicatethe鉱4,5Zσ,5P11, and5RKgenes.W1藍Ieboxes㎞dicateβ 営∫脳0αandBδ5別5α.Grayboxesshowtheregions havinghighs㎞ilaritybetween8ハ360alldβ05・15.Thehighsimilahtylegionswelenumbered 加mlto17,andthelengthsofthesefegion曲L8'&60andnucleotideide且titieswe爬asfbllows, 1.253bp,95.7%;2.158bp,95。7%;3.245bp,90.6%;4.295bp,83.0%;5.393bp,90.7%;6. 213bp,97.2%7.743bp,≦ ∼3.0%;8.1β761∼p,93.3%;9.270bp,92.3%;10.69bp,93.9%;11. 827bp,92.1%12.317bp,88.4%;13.337bp,94.1%;14.708bp,87.9%;15.91bp,97。8%;16. 169bp,97.0%17.284bp,91.6%. 跡1FO7b 一 (ヱン38四 貫ソgroup) 80皿2β 、 (ヱン38γ四910up) βo∫1四2b (1ン3脚 剛9K》up) Bo5π12ご ■ ■一 ■[Z (Non-LTR) β魏F124 (乃39贋ygmup) BoSTFISa (1ン38}P剛9【oロP) βz5■F6伽 (Zン39}Pミ ソ910up)

一

一

一

一

一

需

Figure1-4. StructuresofSTFs. Thegenesofgag, ハノちRπ45θ 瓦andη2ε areshownbylarge boxes,and廿leo血er sequencesareshown byblackbars.

撫

+補

躍

國

閲

↑ノ

跡

<ト

ー 一1レ

ー レ

ー レ

即11ε

乙G5:乙 、

乙25P2

■

■ 團 團

f-SP4

high鱒

丑1噸regi・n

だpoi 皿乳・A _.、.. .po量 皿t・K

ノ

highsimilarityregion

画 心 覧1〃二

國

%瞬

ピ

、po血t _・C 10kb BrS-46___一_一 一_一 一

魏}慮 糠 嬰黙畢

Figure1-S.PhysicalmapsoftheSlocusofBrS-08andBrS-46.BlackboxesindicatetheSRK, 翻P11,and5肱 σgenbs.Glayboxesilldicatetheノ 置」凹 α,ノ蝦 『Pわ,.4岬c,DLら αRRc,5:Z4H2,∫ 乙L2, SPI,SP2,SP3,SP4,SP6,andSP8.Graycirclesanddottedwhitecirclesrepresentrecombination pointsofthebo皿daliesofconveltedrβgions.

8z5■肋

茄

ぐ

・

ゐ

當

鵬

難

嵩

勲†

7ε晦3

響∠ レ撃

β

翠

饗

■ 霞 ・・..・.・・1■1■1 1)・ Skb Con廿9磁 Con廿9r∫P6 Figure2-1.GenemapoftheSlocusofBrSfl. Thick血1es血dicatethesequen㏄d39.5-kband38.6-kbgenomere衷oロs,a且dthepositionsofthe genomicclonesareindicatedbelowthem.BlackboxesindicatelocationsofSLG,SRK,andSPIl, andwhiteboxesindicatethelocationsofotherS-locusgenes.Grayboxesindicate retrotransposon-likesequences.Arrowsshowthedirectionoftranscription.

(A)

BrS-f2BoS-28

β ア5Rκ ヲ2,,4、 ・・、 3do瓦 血 遮乱;; probe壽 rRNA

酬

◎一 ∫Lσ

BrSflBoS-28

(B)

βr5照 ヲ2 kinase doma血 probe

⋮鱒

rRNA ..、.ど'.ぬi'...、...、.

BrSPIlfl

probe

13ア躍 β05-28

.修

難

rRNA Figure2-2.AnalysisofgeneexpressionofSRKandSPITinBrSflhomozygotes. (A)No1血em-blotanalys治of5RKins虹gmaRNA.The5domainandthe㎞asedoln血ofβz5Rκ 一 flwereusedasprobes.ThestigmaofaBoS-28homozygotewasusedasapositivecontrol.NoS RKsignalwasdetectedinthestigmasoftheBrSflhomozygote.AnSLGsignalwasdetectedin bothBrSflandBoS-28.TherRNAbandswerevisualizedbystainingwithmethyleneblue. (B)No血em-blotanalysisofεP11血antherRNA.βzεPZ1クwasusedasaprobe.An5:PIl signalwasdetectedintheBoS-28homozygote,butnotintheBrSf2homozygote.

βr5児κヲ2

一680+1+1 ,300+4,032+10,921+12,692 B7rL∫Rκ 一54r一 口→■■■■■1一一 一一 一一一 一7r=一一一一一一 暑署■澗凹H圏 ■ ね ら ロ   コ ロ へ も りの リ ロ  う7.1%998.1%1、 馬 、99.3弓 る、r. 一680,1:】=丁 「RL.馬 暢 、 馬LTlk 、 lkb ノ

::/

_..恥5窟

_馳

ロ ロ グ の   の   づ の

一

、 、 、 、 θ `

BoSRK28

ロ の の'ψ の コ の ロ つ の 一secondtoseven血exons

firstexon/Sdomain

Figure2-3.ComparisonofthegenestructuresofBrSRK-fl,BoSRK-28,andBrSRK54. Blackboxesi皿dicateexons,andagrayboxfeplesentsβz∫Z碗 α.

一237 BrSPil-f2-158 BoSPiI-28-251 BrSPli-54-22i BrSP11-9-231 BrSP11-f2-144 BoSPii-28-196 BrSP11-54-176 BrSPil-9-177 BrSPII-f2-137 BoSPIt-28-141 BrSP11-54-137 BrSPIt-9-153 TATCCCTCTTGAAG一 一 一一一一一 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 一一一一一一一一 TATCACTC'「T6AAGA'「ACGCCTAAGA丁TT'「AATTTAτTGCCCTA66CAATAAGAG TATCACTCTTGAAGAGACGCCTAAGATTTTAATTTATTACCCTAGGCAATAAGAG TAGACCAATTGAAAAGAT-CCTAGGATTTTATTTTATTAATCTGGGCAATTAGAG ******零**零***********零************零*** 一149 一一一一 一 一一一一一 一 一一一一一一一 一acaacrr CAACτGAGG6GGGGG窃GGG6GGGGGGGGGGGτT丁 ττττC丁Tτττ了τTTA6AACτ τ CAAC丁GAGGGGGGGGGGGGGGτG一 一 一. CAAC丁GA一 一一 一一一 一一 一一 讐.卿 *纏*纏* 一131 CGAAAAT-GG CGAAAAT-GG CGAAAAT-GG C-AGAATAGG ****零 一一一一一一一一TTTTGTTTTAGAACTT 一一一一一一 一GCGT6G6TTTAAAACAT 一123 零*******‡ AAATGGAAGACAACCC一 一一一ATA AAATGGAAGACAACCCATATATA AAATGGAAGACAACCC一 一 一ATA AAATGGAAGACAACC一 一一 一 一 *********************‡************‡* BrSPtt-f2-88 BoSPti-28-88 BrSPII-54-88 BrSP11-9-107 BrSPII-f2-36 BoSPII-28-36 BrSPiI-54-36 BrSPtl-9-56 TAτA'「ATATATAT'「AATAATAATTGTTTCC一 一一GT丁GTCACACA'「AAT6TCCTCA TATATATATATATTACTAATAATTGTTTCC一 一一GTTGTCACACATAATGTCCTCA τATATATA'「ATATTAATAATAATTGTTTCC一 一GTTG了CACACA丁AATGTCC丁CA 一一一一'「ATAAATATTACTAACAATTG丁 τTCCTTTATT6τrA'『ACAτAA'「GTTCTCA ****幽******************‡******纏*纏** TATAbox TTCTATTTGTCCT丁GAAAGACGTTGATTTTCGAGA一 一 一 一 一一一一一一 丁TCTATTTGTCCT'「GAAA6ACGTTGATATTCGA6A一 一一一一一 一一 一 一 一一一 TTCTATTTGTCCTTGAAAGACGTTGATTTTCGAGA一 一一一一一一一一一一 一一一 一 一 TTCTAT'「TGTτCτ 丁GAAA{葺ACGTTCATTTTCTCT'「AGAAA'『AGTGAAAGAATTAT ************‡ 乗************** 十1 十1 十1 十1 Figule2-4.Alig皿Rentof血enucleohdesequencesof止epromoterregionofβ ハ野 「11プ2, βo￡P11-28,β 旭 ∫ワ1-54,andβ 謡 ∫ワ1-9. AboldunderlineindicatestheputativeTATAbox.Aopenboxindicatestheputativeminimal promoterregionforexpressioninpollenassignedbyShibaetal.(2001}.Asterisksshowid enticalnucleotidesamongBoSPIl-28,BrSP11-54,andBrSP11-9.Thepositionofthe translationstartsiteisnumbered+1.

(kb)

23.1

9.4

6.6

4.8

2.3

2.0

1234

=

=

.嚇

●6

0●.;蜘

●

(kb)

23.1

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)b

k(

ユ 4 6 8 3 0 % 9 6 . 4 2 1 2 .

1234

;欄■隙 鵜

firstezonofBoSRK-28 secondexonofBoSRk-28 βo即11-28

Figure2-5Southern-blotanalysisofgenomicDNAsofG-205andBoS-28.一After electrophoresis,genomicDNAdigestedwithEcoRIandEcoRVwashybridizedwithfireprobes

ofthefi】 臣並exonofβ05照 一28,secondexonofBo∫ 脳 一28,andfuU-1engthofβ05P11-28.1. BoS-28,EcoRIdigestion;2.BoS-28,EcoRVdigestion;3.0-205,EcoRIdigestion;4.0-205,

(A)

SC SI 08151832394562

EB)

F2plants 撚 ゼπα58 4c伽 朔 . .﹄ F ﹂

2・0「一 一 一一

1S

(C)

_{(KD・)5・548-5げ 躍} 200 116 97 SRK SLG 1.0 0.5 O S-54f5-54 Figure2-6.ExpressionanalysisofSRK (A)ElectrophoreticanalysisofRT-PCR

productsofε 搬 【a皿dαc琵 π.PlantsofO8,15, 18,and32wereself-compatibleand39,45, and62wereself-incompatible.PCRproducts after35cyclesareshown.Theactingene wasusedasacontrol. ;'齢 「 一一... } .. く=..「==.=嚇;.i . 冒重 P ー 蜂去..iξ.;= 、.」卜「.'.:.づ;.「 .ら..・:.〆∫ ...七.. ・.ζ'ひ. L ...'=. .㌃...= .:ヤ:..二;.ン.. 1. 」一 - i彗iii榔 「 _{羅:…蓄…轟=1.b.} 品..1鷺…. ー 聖

i

欝1

一5 「 ,= 「.ζ 撫 ・..;.{ ;.モ='. ...=.}1ミ... 1

(B)RNAlevelsof5:RKin∫ 一54(n=3)alld∫ ・5ガ(n=4)homozygotesa匝alyzedbylea1

血1e-PCR.Values(mean土s髄d訂demr)nomalized刃 吋 血1e艶lencetotheamo皿tof theactinRNAaleshownaslelativeva1鵬swiththecontro15-54homozygotebehlg givenavalueof1.0. (C)Westem-blotanalysisofSRKandSLGinBrS-54,BrS-54f,andBoSf1.Stigma proteinswereseparatedbySDS-PAGEanddetectedbyimmunoblottingwithananti-130SLG-03antibody.ArrowsindicateSRKandSLG. εdoma血 5Rκ ・541豆 豆罵transm㎝bra幽odomnin 8 1 匪 ε乙σ 一54,一5ザ ●

一

542by 100% 畢 1 馨 l II 481ψ 82.4免 豆111 ロさ 1奮1唇bp 1卯% 1匿

一

il識P,i鞍

欝 易.

一

一

■

Figure2-7.Comparisonofdeducedaminoacidsequencesandnucleotidesequences ofεRκand5乙 σin5・54and5-5彫 Thelegionshav血gd避elentsequencesbetween撚alld∫ 乙Gwereshownbyblack: bars(SRIandwhitebars(SLG).The100%identicalregionbetweenSRKandSLG wasshowningray.IntheSRKgeneofS-54f,1034bpsequenceshowninwhiteand

騨ywas100%identicalwid15乙 σ 一54,sugges血gthatgeneconve蔦ion丘om皿 σto

∫RK(indicatedbya血cka∬ow)o㏄uπedjnthisre暫on.Thebo肥dariesofthe convertedregionareinferredtobeintheregionsshownbygraybars.

論 文 審 査 結 果 要 旨

自 家 不 和 合 性 に お い て 花 粉 と雌 蕊 の 自 己 認 識 特 異 性 を 決 定 す る3遺

伝 子 座 は,複

対 立 遺 伝 子(∫

ハ

プ ロ タ イ プ)間

で 極 め て 高 い 多 様 性 が あ る こ と が 明 ら か に さ れ て い る 。 一 方 で,種

が 異 な っ て も 同 じ

認 識 特 異 性 を 有 す る ∫ハ プ ロ タ イ プ の 組 合 せ が 複 数 見 つ か っ て お り,そ

れ ら は 種 分 化 前 は 同 じ3ハ

プ

ロ タ イ プ で あ っ た と推 定 され て い る が,そ の ゲ ノ ム 構 造 の 相 同 性 は 明 ら か と な っ て い な い 。本 研 究 は,

5P11と3R1【

が 極 め て 類 似 す る8ハ

プ ロ タ イ プ の ∫遺 伝 子 座 を 比 較 し,種

分 化 後 の3遺

伝 子 座 の 構 造

変 化 を解 明 す る と と も に,自

家 和 合 性 へ の 変 異 と5遺

伝 子 座 の 構 造 の 関 係 を 明 ら か に し よ う と した も

の で あ る 。

キ ャ ベ ツ を 含 む 飾 α∬菰cβoJ8rαc80,ハ ク サ イ や カ ブ を 含 む 飾 α∬∫c研4ρoの2種

間 で 同 じ 認 識 特 異

性 を 持 つ3対

の ∫ハ プ ロ タ イ プ ペ ア の3遺

伝 子 座 の ゲ ノ ム 構 造 を 比 較 す る た め,3遺

伝 子 座 の ゲ ノ

ミ ッ ク ク ロ ー ン を 単 離iし,6ハ

プ ロ タ イ プ で 合 計390kbの

塩 基 配 列 を 決 定 し た 。 い ず れ の ペ ア で も,

且o伽

πVθ

α の3遺

伝 子 座 の 方 が,B.Z叩

α の も の よ り大 き い こ と が 分 か り,RoZ餌C即

の ∫遺 伝 子 座 に

は 多 く の 異 な る レ ト ロ トラ ン ス ポ ゾ ン が 見 出 され た 。2種

間 で 全 体 の ゲ ノ ム サ イ ズ は 大 き く異 な ら な

い こ と か ら,1式ozθrπcε

αの ∫遺 伝 子 座 に 特 異 的 に レ トロ トラ ン ス ポ ゾ ン が 挿 入 され た と考 え られ た 。

Rr4ρ α の ∫一8と3-46の3遺

伝 子 座 の 比 較 に よ り,こ

れ ら の 問 で は,2つ

の 部 分 の 相 同 性 が 極 め て 高

い こ と が 見 出 さ れ た 。 こ の よ う な3ハ

プ ロ タ イ プ 間 の 部 分 的 類 似 性 は,遺

伝 子 変 換 で 生 じ た 可 能 性 が

高 い と考 え られ た 。

Y6110wSarsonはB.π

ワα の よ く 知 られ た 自家 和 合 性 品 種 で あ る が,そ

の 原 因 と な る ∫遺 伝 子 座 の 変

異 は 解 明 され て い な か っ た 。 ∫遺 伝 子 座 の78kbの

塩 基 配 列 を 決 定 し,そ

の 変 異 前 の 原 ハ プ ロ タ イ プ が

∫一54で あ る こ と を 見 出 し た 。Y6110wSarsonで

は,柱

頭 側 の 認 識 分 子 の 遺 伝 子 で あ る3R1(の

第1イ

ン ト

ロ ン に 約5kbの

レ ト ロ ト ラ ン ス ポ ゾ ン の 挿 入,花

粉 側 の 認 識 分 子 の 遺 伝 子 で あ る3P11の

プ ロ モ ー タ ー

に89bpの

欠 失 を 見 出 し た,こ

れ らの 挿 入 や 欠 失 が,3RKと5P〃

の 正 常 な 転 写 が 起 こ ら な い 原 因 で あ

る こ と を 明 ら か に し た 。

カ イ ラ ン(B.018駕

θ

αy砿 α1わ08Zo加

α)の 自家 和 合 性 は,∫一28の 変 異 に よ る も の で あ る こ と を 見 出 し,

カ イ ラ ン の3RKが

第1エ

キ ソ ン か ら第2エ

キ ソ ン ま で 欠 失 し,5P11も

欠 失 し て い る こ と を 示 唆 し た 。

ハ ク サ イ のFi品

種 の 自殖 分 離 集 団 に 見 出 した 自 家 和 合 性 を解 析 し,3RKの

塩 基 配 列 が 原 ハ プ ロ タ イ

プ の ∫一54と 異 な り,3-54の3LGと

相 同 性 が 高 い こ と を 見 出 し た 。 こ の こ とか ら,3ZGか

ら3RKに

遺

伝 子 変 換 に よ り塩 基 配 列 が 移 され,そ

の 結 果SRKの

認 識 特 異 性 に 変 化 が 生 じ た た め 自 家 和 合 性 に な っ

た も の と示 唆 し た 。

以 上 の よ う に 本 研 究 は,ア

ブ ラ ナ 科 植 物 の.自家 不 和 合 性 に 関 与 す る3遺

伝 子 座 の ゲ ノ ム 構 造 の 変 異

を 明 ら か に す る と と も に,主

要 な 自 家 和 合 性 品 種 の 自家 和 合 性 変 異 の 原 因 を 解 明 し た 。 よ っ て 審 査 員

一 同 は 本 論 文 は 博 士(農

学)の

学 位 を 授 与 す る に 値 す る 内 容 で あ る と判 定 した

_。