課題番号 ：２７指１３０３
研究課題名 ：慢性B型肝炎の病態変動を検出するためのT細胞染色試薬の開発 主任研究者名 ：宮寺 浩子
キーワード ：B 型肝炎ウイルス (HBV)、慢性 B 型肝炎、ヒト白血球抗原 (human leukocyte antigens; (HLA)), MHC テトラマー
研究成果 ：
B 型肝炎慢性化、ウイルス排除、ワクチン応答は、ヒト白血球抗原(human leukocyte antigens; HLA) クラス II と強く関連することから、HLA クラス II の特定のアリルが HBs 抗原産生の誘導を介して B 型肝炎ウイルス(HBV)に対する免疫応答に大きく寄与すると考えられる。この一連の免疫応答に関わる HLA クラス II 拘束性エピトープ、およびこれを認識する T 細胞を同定することが出来れば、HBV に対 する免疫応答の詳細を明らかにする糸口となるだけでなく、B 型肝炎慢性化や再活性化等のリスクを予 測する上でも有用である。そこで本研究では、HLA クラス II の一つであり、B 型肝炎慢性化との関連 が報告されている HLA-DP に着目し、HLA-DP 拘束性 HBV エピトープを同定し、慢性 B 型肝炎の病態に伴 う T 細胞免疫系の変動を明らかにすることを目的として研究を行った。 まずHLA-DP拘束性HBVペプチドを同定するため、HLA-DPが結合しうるペプチド領域を同定することと し、組換えHLAタンパク質と合成-ペプチドとの相互作用を解析するためのアッセイ系を確立した（投 稿準備中）。以下に示す、日本人集団に高頻度に維持されるHLA-DPハプロタイプ６種類のDPアリル産物 を組換えタンパク質として発現した。
・慢性肝炎抵抗性ハプロタイプ：HLA-DP0401 (DPA1*01:03-DPB1*04:01), HLA-DP0402 (DPA1*01:03-DPB1*04:02), HLA-DP0201 (DPA1*01:03-DPB1*02:01)、
・感受性ハプロタイプ：HLA-DP0501 (DPA1*02-DPB1*05:01), HLA-DP0901 (DPA1*02:01-DPB1*09:01)、 ・中立性ハプロタイプ: HLA-DP0301 (DPA1*02:02-DPB1*03:01) これらのDPA1-DPB1ハプロタイプのアリル産物を組換えタンパク質として発現し、各HLA-DPアリル産 物に結合するHBV抗原ペプチド領域を表面抗原(HBs) （59ペプチド）, コア抗原(HBc)（40ペプチド） をカバーする合成ペプチドライブラリーから探索した。その結果、特定のHLA-DPアリル産物に結合す るHBs, HBc領域を複数箇所同定した（投稿準備中）。さらに、短鎖ペプチドを用いた結合解析を行い、 これらのウイルス抗原ペプチド配列とHLA-DPとの間の相互作用に大きく寄与するアミノ酸残基を推定 した。しかし、疎水性ペプチドの場合は非特異的シグナルを生じるため測定が困難であり、中でも数 種類のペプチドについては、合成困難のため測定を行うことが出来なかった。HBs抗原は疎水性領域が 多いため、半数以上のペプチドについてHLAとの結合アッセイを行うことが出来なかった。 このため次に、異なる評価系（HLA発現アッセイ）で、HLA-DP結合領域の探索を行った。この方法で は、HLAをペプチドとの融合タンパク質として培養細胞に発現し、内部コントロール(GFP)を用いて細 胞表面HLA発現量を定量化する（Miyadera, et al. 2015 J. Clin. Invest.; 宮寺・他 2016 日本臨床 免疫学会会誌）。HLAはペプチドと強く結合するほどタンパク質複合体が安定化し、細胞表面に高発現 する性質がある。そのため、細胞表面のHLA発現量を測定することによりペプチドとの相互作用の相対 的な強さを推測、評価することが出来る。この方法を用いることにより、疎水性領域を含むHBs, HBc 全領域についてHLAとの結合性を測定することが可能であった。H28年度はHLA発現アッセイを用いて、 3種類のHLA-DPアリルについてHBs, HBc抗原を対象としたHLA結合領域探索を行い、特定のHLA-DPにア リル特異的、かつ強い相互作用を介して提示されうるHBs, HBc抗原領域を複数箇所、見出した。 当初の研究計画ではHLAテトラマーを作成することにより、HLA-DP拘束性HBs, HBc抗原ペプチドを認 識するT細胞を同定する予定であったが、HLAテトラマー作製が困難であったため、他の方法によって 抗原特異的T細胞同定を進めることとした。具体的には、HLA-DPとの結合が示唆されたHBs, HBc抗原領 域についてHLA-DPとの融合タンパク質を作成し、HLA-抗原複合体として培養細胞表面に安定発現させ る。これを抗原提示細胞として用い、ワクチン応答陽性健常人末梢血中の反応性T細胞をスクリーニン グする。平成28年度は、このための抗原提示細胞作成を開始した。
Researchers には、分担研究者を記載する。
Subject No. ：２７指１３０３
Title ：Development of T-cell staining reagent for study of immune responses in chronic hepatitis B Researchers ：Hiroko Miyadera
Key word ：hepatitis B virus (HBV), chronic hepatitis B infection (CHB), human leukocyte antigens (HLA), HLA tetramer
Abstract ：Susceptibility to chronic hepatitis B (CHB) and responses against HBV vaccination are associated strongly with polymorphisms in human leukocyte antigen (HLA) class II region, indicating that HLA class II are one of the major factors that mediate adapted immune responses against HBV. To identify detailed mechanisms of HLA class II-mediated immune responses, we aim to identify HBs and HBc antigen peptides that are presented to HLA class II and are involved in T-cell mediated immunity and antibody production against HBV. As the first step, we established in vitro assay to identify HLA class II-restricted HBV peptides. First, we prepared recombinant proteins encoded by the six HLA-DP haplotypes that are maintained at high frequencies in the Japanese population. These recombinant proteins were then used for HLA-peptide binding assay using labeled synthetic peptides. The peptide libraries that cover the entire region of HBs and HBc antigens were designed and used for screening. The in vitro assay worked well for approximately half of peptides in the libraries but did not work for hydrophobic regions. Therefore, we next established alternative methods that can also be applicable for hydrophobic regions. Up to the present, we identified several regions of HBs and HBc antigens that can be presented to particular HLA-DP allele products. Using the identified HBs and HBc regions, we plan to search for HLA-DP-restricted T-cell epitopes.
国際開発研究費 報告書 (H28年度）
課題番号
27指1303
（主任研究者：宮寺 浩子）
研究課題名
慢性B型肝炎の病態変動を検出するためのT細胞染色試薬の開発
目的 ：
・HLA-DP拘束性HBV抗原ペプチド（T細胞エピトープ）を認識する抗原特異
的T細胞を同定することにより、B型肝炎に対する免疫応答機序を解明する。
・抗原特異的T細胞を染色するための試薬(HLAテトラマー)を開発し、B型肝
炎の様々な病態でのT細胞の動態を明らかにする。
H28年度進捗 ：
1. HLA-DP提示HBV抗原の同定
HLA-DPアリル３種類について、HBs, HBc抗原領域を対象とした結合スク
リーニングを実施した。
2. T細胞エピトープ探索
健常人末梢血（HBVワクチン陽性者）を用いたT細胞エピトープ探索を行う
ための、HLA-抗原複合体の安定発現株（抗原提示細胞）の作成を開始した。
３．T細胞染色試薬(HLAテトラマー)の大量調製系を確立する。
技術的な課題があり計画を一部変更した。HLAテトラマーに代わる方法とし
てHLA-抗原複合体の安定発現株（抗原提示細胞）のパネルを作成し、これを
用いたT細胞染色を行うこととした。
背景１：B型肝炎慢性化抵抗性・感受性と関連するHLA-DPB1
アリルが同定された
Modified from Nishida, Sawai et al. 2014 PLoS One
DP0501, DP0901 ・慢性化と関連 ・ワクチン不応答と関連 DP0401, DP0402 ・慢性化抑制と関連 ・ウイルス排除と関連 ・ワクチン応答と関連 中和抗体産生
慢性肝炎
ウイルス排除 B細胞活性化 (Th2) CTL活性化 (Th1)背景２： HLAクラスIIが、どのような機序でB型肝炎慢性化の
抑制、促進に関わるのか、その機序は不明である。
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wikimedia.org 10 20 30 40 50 60 M Q L F H L C L IIS C S C P T V Q A S K L C L G W L W G M D ID P Y K E F G A S V E L L S F L P S D F F P S IR D L L 70 80 90 D T A S A L Y R E A L E S P E H C S P H H T A L R Q A IL C W G E L M N L A T W V G S N L E D P A S R E L V V S Y V N V 120 110 100 N M G L K IR Q L L W F H IS C L T F G R E T V L E Y L V S F G V W IR T P P A Y R P P N A P IL S T L P E T T V V R R 150 140 130 160 170 180 R G R S P R R R T P S P R R R R S Q S P R R R R S Q S R E S Q C 190 200 210 M ock DP *a a DP *b b DP *cc DP *d d DP *ee DP *ff Peptide [uM] 0 2 5 10 20 50 Peptide_#2 (HBc) Peptide_#1 (HBs) M ock DP *cc DP *bb DP *a a DP *d d DP *e e DP *ff 2.5 5 10 20 50 0.5 0.1 0.25 1 0.01 0.05 0 Peptide [uM]①HLA-ペプチド結合測定により、HLA-DP結合HBV抗原ペプチドを
同定した
HBc(コア抗原） ペプチドライブラリー Ni-NTA plate (96-well) ビオチン化ペプチド アビジン-HRP 組換えHLA-DP ・DP0402 ・DP0401 ・DP0201 ・DP0301 ・DP0501 ・DP0901 ・Mock ・HBs(表面抗原） ・HBc(コア抗原）C. Chen, manuscript in preparation
1. HLA-DP提示HBV抗原の同定
HLA-ペプチド結合解析の測定法を二種類確立し、HBs, HBcライブラリーから、HLA-DPアリル特異的に結合する領域を
見出した。今後、HLA結合領域を対象としてT細胞エピトープを同定する。
preS1 preS2 S TM4 TM1 TM2 TM3 1 M G G W S S K P R Q G M G T10 N LS V P N P LG F20 FP D H Q L30D P A FG A N S N N P D W D F40 N P N K D H W P E A N Q V G A50 60 G A FG P G FTP P H G G LLG W S P Q A Q G ILTTV P A A P P P A S TN R Q S G R Q P TP IS P P LR D S H P Q A M 120 110 100 90 80 70 Q W N S TTFH Q A LL130 D P R V R G L140Y FP A G G S S S G TV N P V P T150 TA S P I160S S IFS R TG D P A P N M E N TT170 180S G FLG P LLV L190Q A G FFLLTR I200LTIP Q S LD S W W T210S LN FLG G A P T220C P G Q N S Q S P TS N H S P T230 S C P240 P IC P G Y R W M C LR R F250 IIFLF260ILLLC LIFLL270V LLD Y Q G M LP V C P L280 LP G TS T290TS TG P C K TC T300I P A Q G TS M FP S C C C T310 K P S D G N C TC I320 P IP S S W A F330 A R FLW E W A S V R FS W L340 S L350LV P FV Q W FV G L360 S P TV W LS V I370W M M W Y W G P S L380Y N ILS P FLP LL390P IFFC LW V Y I400 HBs(表面抗原） ペプチドライブラリー DPA1 puroR 安定発現 DPA1 puroR GFP 一過性発現 DPB1 IRES GFP HLA GFP GFP(内部コントロール） HLA ①HLAII α鎖 安定発現株 ②HLAII β鎖を一過性発現 （レトロウイルスベクターpMXs-IG) 異なるウイルス濃度（2～3点）で感染 ③HLA, GFP発現量測定②HLA発現アッセイにより、HBs, HBc全領域からHLA提示領
域を見出した
HLA発現アッセイの概要研究発表及び特許取得報告について 課題番号： ２７指１３０３ 研究課題名： 慢性B型肝炎の病態変動を検出するためのT細胞染色試薬の開発 主任研究者名： 宮寺浩子 論文発表 論文タイトル 著者 掲載誌 掲載号 年 HLAクラスII結合ペプチドの探索・同定法の 開発 宮寺浩子、野口 恵美子、溝上雅 史、徳永勝士 日本臨床免疫学会 会誌 Vol. 40 No.1 2017年 学会発表 タイトル 発表者 学会名 場所 年月
Stability profiling of HLA class II protein
for disease association studies Hiroko Miyadera,
Jun Ohashi and Katsushi Tokunaga The 13th International Congress of Human Genetics 京都 2016年 4月
A large scale screening of HLA-class II-binding peptides from HBs and HBc peptide libraries Hiroko Miyadera, Yuki Okabe, Cindy Chen, Katsushi Tokunaga, Masashi Mizokami The American Association of Immunologist (AAI) annual meeting 米国 2016年 5月 HLA-DP提示HBs、HBc抗原領域の探索 宮寺浩子、岡部由 紀、Cindy Chia-Jung Chen、徳永 勝士、考藤達哉、 溝上雅史 第52回 日本肝臓学会 総会 幕張 2016年 5月
HLA class II protein stability and disease susceptibility . Miyadera, J. Ohashi, and K. Tokunaga 16th International Congress of Immunology 豪州 2016年 8月 HLA結合ペプチドの大規模探索法の開発 宮寺浩子、徳永勝 士、野口恵美子 第44回 日本臨床免疫 学会総会 東京 2016年 9月 HLAクラスII提示B型肝炎ウイルス抗原領域の探索 宮寺浩子、岡部由 紀、Cindy Chia-Jung Chen、徳永 勝士、溝上雅史 第25回 日本組織適合 性学会大会 札幌 2016年 10月
Large scale analysis of HLA-peptide interactions H. Miyadera, Y. Okabe, K. Tokunaga, and E. Noguchi 66th Annual Meeting of the American Society of Human Genetics カナダ 2016年 10月
研究発表及び特許取得報告について その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等) タイトル 発表者 発表先 場所 年月日 該当なし 特許取得状況について ※出願申請中のものは( )記載のこと。 発明名称 登録番号 特許権者(申請者） （共願は全記載） 登録日(申請日) 出願国 該当なし ※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。 ※主任研究者が班全員分の内容を記載のこ
