ウシ副腎皮質細胞における

ウシ副腎皮質細胞における

による 糖質コルチコイド産生への

の関与に関する研究

松 本 康 訓 利 田 美 幸

東京慈恵会医科大学薬理学講座第 1

（受付 平成 16年 7月 21日）

INVOLVEMENT OF Ca ON  CYCLIC AMP‑INDUCED  CORTICOIDOGENESIS IN  BOVINE  ADRENOCORTICAL CELLS

Yasunori M^ATSUMOTO and Miyuki K^AGATA

Department  of  Pharmacology (I), The Jikei  University School  of  Medicine  

Cyclic adenosine monophosphate(cAMP)and calcium  ion(Ca )play important roles as intracellular messengers in  the corticoidogeni  c effects of adrenocorticotropic hormone (ACTH)in  bovine adrenocortical(BA)cells. However,which  messenger has a  greater effect on  ACTH  remains controversial. The nonhydr  olyzable cAMP  derivative dibutyryl cyclic AMP (BtcAMP)stimulates corticoidogenes  is even  in  the absence of extracellular Ca . Therefore,we examined the effect of  nicardipine and EGTA  on BtcAMP‑induced corticoidogenesis in the absence of extracellular  Ca in isolated BA  cells. We also measured the mobilization of intracellular concentration of   Ca (［Ca ］)by BtcAMP  in a primary cultured  BA  cell using  the Ca ‑imaging  sys tem. We found  that:BtcAMP (1 mM)and forskolin(10μM)each enhanced corticoidogenes  is time‑dependently even in the absent of extracellular Ca . However,the addition  of  nicardipine(2μM)markedly  inhibited  cor- ticoidogenesis induced by BtcAMP  or forskolin in the absence of extracellular Ca . In addition,the BtcAMP‑induced corticoidogenes is was markedly inhibited by the addition of 1 mM  EGTA. This inhibitory effect of EGTA  was   observed after 10 minutesʼincubation. In the presence of extracellular Ca ;BtcAMP‑i  nduced［Ca ］ responses increased  slowly, witha time lag at 7 to 12 minutes,and peaked after approximately 20 minutes;in the absence of extracellular Ca ;the gradual increase［Ca ］ due   to BtcAMP were observed with the Ca ‑imaging system. Our results suggest that   cAMP  releases Ca from  BA  cells to the extracellular space and Ca follows to influx i ntracellularly via the cAMP‑activated calcium channels. Our results also suggest that both cAMP  and Ca ar  e required for on ACTH‑

induced corticoidogenesis.

(Tokyo Jikeikai Medical Journal 2005;120:1‑8) Key words:adrenal cortex,corticoidogenesis,cyclic AMP,Ca

I.緒 言

ウシ副腎皮質束状層細胞（BA細胞）において，

cyclic  AMP (cAMP)が副腎皮質刺激ホルモン (adrenocorticotropic hormone:ACTH)による 糖質コルチコイド産生（ステロイド産生）に必須

であるこ と は よ く 知 ら れ て い る ．ACTH は ACTH レセプターに結合すると，それと連関して いる Gsタンパクを介して adenylyl cyclaseを活 性 化 し，cAMP産 生 を 刺 激 す る．産 生 さ れ た cAMP は protein kinase A活性化を介してステ ロイド産生を促進する．一方，Ca が ACTH の 慈恵医大誌 2005;120:1‑8.

細胞内メッセンジャーであり，細胞内 Ca 濃度 の上昇が cAMP上昇よりもステロイド産生促進 に重要な役割を持っているという報告がある ． 柳橋らはウシ副腎皮質束状層細胞において，細胞 内 cAMP濃度の上昇を生じない生理的低濃度の ACTH により，細胞外 Ca 存在下でステロイド 産生が刺激されること ，そして ACTH の作用が dihydropyridinesにより抑制されることを示し た ．

すなわち，生理的濃度の ACTH は電位依存性 カ ル シ ウ ム チャネ ル（voltage‑operated  Ca channel:VOC）を活性化することにより細胞外 からの Ca 流入を促進し，その結果ステロイド 産生が刺激されることを示唆した ．一方，Salaら は高感度の測定法を用いて，ラット副腎皮質細胞 における ACTH による cAMP産生を測定し，ス テ ロ イ ド 産 生 能 と 比 較 検 討 し た 結 果，低 濃 度 ACTH でも細胞内 cAMP濃度を上昇させること を報告し，ACTH の作用は cAMPが中心となり 発現するものと考えた ．しかしながら，彼等の実 験 は 細 胞 外 Ca の 存 在 下 で 行 わ れ た た め，

cAMPによる細胞外からの Ca 流入によりステ ロイド産生が促進した可能性も考えられる．この 様に ACTH のステロイド産生促進作用に対し，

cAMPと Ca のどちらが主として関与している のかはいまだ明確にされていない．一方，膜透過 性 cAMP誘導体である dibutyryl  cyclic  AMP (BtcAMP)が，細胞外 Ca 非存在下でもステロ イド産生を刺激することが報告されている ．こ の場合，細胞外 Ca 非存在下において BtcAMP がステロイド産生に関与しているとするならば，

BtcAMPによる直接的なステロイド産生刺激 と，BtcAMP刺激によって細胞内から細胞外へ 放出された Ca が，カルシウムチャネルを介し て細胞内へ再流入することによる Ca を介した ステロイド産生刺激の 2つが考えられる．そこで 後者の可能性の有無を知るために，我々は BA細 胞を用い，細胞外 Ca 非添加条件下において，

BtcAMP刺激によるステロイド産生に対する VOC阻害薬である nicardipine やカルシウムキ レーターである EGTAの効果を検討した．また，

単一培養 BA細胞を用いた BtcAMP刺激時の 細胞内 Ca 濃度変動の観察も行った．

II.方 法

1.ウシ副腎皮質遊離束状層細胞の採取

遊離 BA細胞はウシ副腎皮質組織から trypsin 処理法で得た ．この方法を簡潔に述べると，可及 的速やかに屠畜場から運んできたウシ副腎皮質を 細切し試料として用いた．緩衝液として Ca を 含 ま な い Krebs‑Ringer‑bicarbonate‑glucose‑

albumin緩衝液（123 mM  NaCl,5.9 mM  KCl,1.2 mM  KH PO , 1.2 mM  MgSO , 25.  0 mM NaHCO ,2 mg/ml gl ucose,3 mg/ml bovine serum  albumin(BSA),0.  01 mM  EGTA;pH 7.4）(Ca ‑free KRBGA）に 0.  25%trypsinを加

えて使用した．37℃，95% O 5% CO 気相下で，

副腎皮質を Ca ‑free KRBGAでイ ン キュベー ションし，採取した細胞浮遊液を遠心した．その 細胞を trypsin阻害薬含有の Ca ‑free KRBGA で懸濁し，trypsin作用を停止させ実験に用いた．

細 胞 は 13‑36×10cells/0.5 mlに な る よ う 調 整 し，ステロイド産生実験に用いた．

2.ステロイド産生の測定

Trypsin処理によって得られた 遊 離 BA細 胞

（13‑36×10 cells/0.5 ml）に BtcAMP，nicar- dipine等を添加し，95% O 5% CO 気相下，

37℃ の条件下でインキュベーションし，dichlor- omethaneで反応を止めステロイドを抽出した ． ステロイドホルモン定量は Slavinskiらの方法 を用いて行い，cortisolを標準ステロイドとした．

3.ウシ副腎皮質束状層細胞の初代培養

BA細胞は collagenase処理法にて無菌的に調 整し初代培養した ．方法を簡潔に述べると，屠畜 場から運んできたウシ副腎を周囲の脂肪を除去 後，火炎滅菌した．滅菌済み Ca ‑free KRBGA にて洗浄，髄質を除去し皮質を細切した．この皮 質細切片を 0.1%collagenase I,0.005% deoxyr- ibonuclease  Iお よ び 1.2 mM  CaCl含 有 の KRBGA中 で 37℃，5%CO 気 相 下 で イ ン キュ ベートし，その後ピペッティングにより細胞を遊 離し，副腎皮質束状層細胞を採取した．得られた 細胞を 5% fetal calf serum,10% newborn calf serum,2.5% horse serum および抗生物質を含有  する滅菌 Ham  F‑10培養液に懸濁し，Cellmatrix で処理したカバーグラスに播種し，37℃,5%CO

培養器で初代培養した．実験には 3〜4日培養した 細胞を使用した．

4.カルシウムイメージング

カバーグラスに播種した初代培養 BA細胞を 用 い て 実 験 を 行った．ま ず，Krebs‑Ringer‑ HEPES‑glucose‑緩衝液（123 mM  NaCl,5.9 mM KCl,1.2 mM  KH PO ,1. 2 mM  MgSO ,10.0 mM HEPES,2 mg/ml glucos  e,0.01 mM  EGTA,1.2 mM  CaCl;pH  7.4）（KRHG）に cr  emophor EL

と蛍光性カルシウム指標薬である fura  2/acet- oxy methyl ester(fura 2/AM)を添加し，10%

cremophor EL,5 mM  fura 2/AM 含有 KRHGを 調整した．この緩衝液で 37℃，90分インキュベー トし，細胞に fura 2を負荷して実験に用いた ． カルシウム測定には超高感度 CCDカメラを備 えた倒立顕微鏡（ニコン TE300)，蛍光画像解析プ ログラム（浜松ホトニクス Aquacosmos）を使用 した．まず，細胞を播種したガラス板とチェンバー をグリースで接着，固定し顕微鏡にセットする．細 胞が乾燥しないように，常に KRHGで灌流した．

そして BtcAMPm などで刺激して，fura 2蛍光 強度を蛍光波長（510 nm）と励起二波長（380 nm と 340 nm）により測定 し た．細 胞 内 Ca 濃 度 (［Ca ］)の 変 動 は 340 nm お よ び 380 nm で 励 起した時の蛍光強度の比（I 340/I 380）で表した ．

5.試薬

BtcAMP,nicardipine,forskolin,deoxyribo- nuclease  I,Ham  F‑10，ウシおよびウマ血清は Sigma社（St.Louis, MO, USA）よ り，col- lagenase Iはフナコシ社（東京）より，fura 2/AM は Dojindo Lab（熊本）より，Cellmatrixは新田 ゼラチン社（大阪）より購入した．その他の試薬 はすべて特級を用いた．

III.結 果

1. BtcAMP刺激によるステロイド産生に対する nicardipineの効果

遊離 BA細胞における BtcAMP刺激ステロ イ ド 産 生 に 対 す る VOC阻 害 薬 で あ る nicar- dipineの 効 果 を 検 討 し た．細 胞 外 に 添 加 し た BtcAMPは細胞内に移行し，細胞外に Ca を添 加しなくてもステロイド産生を刺激する ．そこ で，細胞外 Ca 無添加条件下で 1 mM  BtcAMP

によりステロイド産生刺激を行ったところ，イン キュベーション時間依存的にステロイド産生を促 進した（Fig.1)．そして，インキュベーション開 始 30分後，60分後，90分後に 2μM  nicardipine を添加したところ，すべてにおいて BtcAMP刺 激によるステロイド産生は nicardipine添加後，

完全に抑制された．また，インキュベーション開 始と同時に nicardipineを添加した場合，30分イ ン キュベーション 後 の BtcAMPに よ る ス テ ロ イド産生量は nicardipine無添加時 と 比 べ て 約 30% の抑制を示したが，30分以後は著しい抑制傾 向が観られた．

ステロイド産生における cAMPと Ca

Fig.1. Effect of nicardipine on BtcAMP‑induced corticoidogenesis in BA  cel  ls in the absence of extracellular Ca .  

BA  cells were incubated with 1 mM  BtcAMP in  Ca ‑free  KRBGA  f  or  the  times  shown (●⎜●). After BA  cells were started to incu- bate,these were added 2μM  nicardipine at 0 (‥●‥),30(‥■‥),60(‥○‥)and 90 min (‥ ‥),respectively. Each  value  represents the mean±S.E.of tripl icate determinations.

3

  2. BtcAMPおよびnicardipine前処理BA細胞

におけるBtcAMPによるステロイド産生の 動向

細胞外 Ca 無添加条件下で 1 mM  BtcAMP また は 1 mM  BtcAMP＋ 2μM  nicardipineに よ り 30分 間 前 処 理 し た 後，細 胞 を Ca ‑free KRBGA で 洗 浄 し た．そ の 細 胞 を 用 い て 

BtcAMPの効果を検討した．Fig.2に示す様に，

細胞外 Ca 無添加条件下において BtcAMPで 30分間前処置した場合，BtcAMP刺激によるス テロイド産生はインキュベーション 30分，60分 それぞれ約 110 pmol/10cells，約 160 pmol/10 cellsであった．また，BtcAMPとともに nicar- dipineを添加し 30分間前処置した結果，30分，60 分 イ ン キュベーション 時 の BtcAMPに よ る ス テロイド産生はそれぞれ約 50 pmol/10cells，約 100 pmol/10cellsであり，BtcAMP単独前処理 に比べて，BtcAMPによるステロイド産生活性 は弱かった．

3. Forskolin刺激によるステロイド産生に対する nicardipineの効果

Forskolinは直接 adenylyl cyclaseに作用し，

その活性を促進することによって細胞内 cAMP を増加させることは知られている ．そこで 10 μM  forskolinによるステロイド産生に対する nicardipineの効果を検討した．まず，細胞外 Ca 無添加条件下で forskolin単独刺激を行った．Fig.

3に示す様に，インキュベーション時間依存的に ステロイド産生は増加した．そこで forskolinで 刺激し，インキュベーション開始 30分後，60分 後，90分後にそれぞれ 2μM  nicardipineを添加 したところ，以後のステロイド産生において強い 抑制傾向が観られた．しかしながら，インキュベー

Fig.2. Effect of BtcAMP on corticoidogenesis in BtcAMP‑or  BtcAMP  and  ni  cardipine‑

pretreatment in BA  cells.

BA  cells were pretreated by 1 mM  BtcAMP (□)or  1 mM  BtcAMP＋2μM  nicardipine (^■)for 30 min in Ca ‑free KRBGA,followed by wash with Ca ‑free  KRBGA. The washed cells were incubated wi th 1 mM  BtcAMP  in Ca ‑free  KRBGA  at 30  and  60   min. Each value represents the mean±S.  E.of triplicate determinations.  

Fig.3. Effect of nicardipine on forskolin‑induced corticoidogenesis in BA  cel  ls in the absence of extracellular Ca .  

BA  cells were incubated with 10μM  forskolin in  Ca ‑free  KRBGA  f  or  the  times  shown (^●⎜●). After BA  cells were started to incu- bate in the above condition,these were added 2 μM  nicardipine at 0(‥^●‥),30(‥■‥),60 (‥○‥)and  90 min(‥ ‥), respectively.

Each value represents the mean±S.E.of tripli- cate determinations.

ション開始時に nicardipineを添加すると，添加 後 30分間の forskolin刺激によるステロイド産 生は抑制されたが約 30% であった．そして 30分 以後は forskolinの作用を強く抑制した．

4. BtcAMP刺激によるステロイド産生に対する EGTAの効果

BtcAMPに よ る ス テ ロ イ ド 産 生 に 対 す る EGTAの 効 果 を 検 討 し た（Fig.4)．1 mM BtcAMPと 1 mM  EGTAを同時添加すると，イ 

ンキュベーション開始 10分間のステロイド産生 にはほとんど影響が観られなかったが，それ以後 のステロイド産生は完全に抑制された．

5. BtcAMP刺激による細胞内Ca 濃度の変動 初代培養 BA細胞とカルシウムイメージング 装置を用いて，細胞外 1.2 mM  Ca 添加および，

無添加条件下で BtcAMP刺激による単一細胞

内カルシウム濃度の変化を検討した．細胞外 Ca 添 加 時 に お い て，測 定 開 始 30秒 後 に 1 mM BtcAMPで刺激したところ，Fi  g.5に示すよう

に BtcAMP刺激後，7分頃から［Ca ］がゆるや かに上昇し始め 18分前後でピークに達し，その後 は徐々に基線に戻った．一方，細胞外 Ca 無添加 条件下において，上記と同様に 1 mM  BtcAMP で刺激すると，弱いながら緩やかな［Ca ］の上 昇が観られた．この実験には単一細胞を用いて，少 なくとも 4つの細胞で観察された．そして，細胞 外 1.2 mM  Ca 添加条件では，BtcAMP添加後

［Ca ］の上昇時間が 7〜12分，ピークに達する のに 18〜25分と個々の細胞によって差が観られ た．

IV.考 察

ウシ副腎皮質束状層細胞を用いて，細胞外 Ca 無添加条件下における膜透過性 BtcAMP刺激 ステロイド産生に対する L型 VOCの特異的阻害 薬であ る nicardipineお よ び カ ル シ ウ ム キ レー タ−である EGTAの効果を検討し，間接的では あるが，cAMPにより刺激されるステロイド産生 において Ca が重要な役割を果していることの 証明を試みた．細胞外 Ca 無添加条件下におい て BtcAMPお よ び forskolinに よ り，細 胞 内 cAMP濃度を上昇させた時のステロイド産生に 対 す る nicardipineの 効 果 を 検 討 し た 結 果，

BtcAMPおよび forskolin単独刺激では時間依 存的にステロイド産生が増加した．そしてイン キュベーション開始 30分後，60分後，90分後に それぞれ nicardipineを添加すると，それ以後，ス テロイド産生において強い抑制傾向が観られた．

このことは，少なくとも BtcAMPおよび fors- kolin刺激 30分以後は，細胞外に放出された Ca が VOCを介して再び細胞内へ流入し，ステロイ ド産生に参画していることを示唆している．一方，

インキュベーション開始時に nicardipineを添加 した場合，BtcAMPおよび forskolinによるステ ロイド産生はやや抑制されたものの，完全な抑制 は示されなかった．したがって，この結果から少 なくともインキュベーション開始後 30分間のス テロイド産生において，cAMPが重要な役割を果 たしていることが示される．しかしながら，細胞 Fig.4. Effect of EGTA  on BtcAMP‑induced cor-

ticoidogenesis in  BA  cells in  the absence of extracellular Ca .  

BA  cells were incubated with 1 mM  BtcAMP in the presence(^●⎜●)or   absence(‥^○‥)of 1 mM  EGTA  in  Ca ‑f ree  KRBGA  for  the times  shown. Each  val  ue  represents  the mean±S.E.of triplicat e determinations.

5 ステロイド産生における cAMPと Ca

外 へ 放 出 さ れ た Ca を EGTA添 加 に よ り キ レートし，細胞内への Ca の再流入を阻害した 実験においては，インキュベーション開始 10分間 はほとんどステロイド産生は抑制されず，10分以 降は完全に抑制された．したがって，cAMPが主 として直接ステロイド産生に関与しているのは，

刺激開始後 10分間であり，その後 cAMPにより VOCが活性化し，細胞外に放出された Ca が再 流入しステロイド産生をさらに促進したものと考 えられる．実際，細胞内 Ca 濃度変動に対する BtcAMPの影響をみたところ，明らかな Ca 流 入 が 観 察 さ れ た．cAMPに よ り 細 胞 外 か ら の Ca 流入が促進されることは MDCK細胞 ，ウ シ副腎皮質顆粒層細胞 ，MIN6細胞およびヒト ランゲルハンス細胞 で報告されている．cAMP によるカルシウムチャネルの活性化機序について は，cAMPが直接 L型 VOCを活性化するという 報告 や cAMP依存性の protein kinase Aによ るリン酸化を介して L型 VOCの活性化がおこる という報告 がある．ウシ副腎皮質細胞におい て，cAMPによる VOCの活性化がどちらの機序

により発現するかは現在のところ不明である．し かしながら，cAMP添加 7〜12分後に Ca 流入 が観察されたことから，protein kinase Aによる リン酸化を介する活性化の可能性が高いが，今後，

更なる検討が必要である．

それでは，細胞外へ放出された Ca の起源は どこにあるかという問題が残されている．今回の 実験で BtcAMP単独および，BtcAMP＋nicar- dipine同時添加により 30分間前処置を行い，そ の後 細 胞 を 洗 浄 し BtcAMPで 刺 激 し た 結 果，

BtcAMP単 独 前 処 理 と 比 べ て BtcAMP＋

nicardipine同時前処理では，ステロイド産生は著 しく少なかった．これは BtcAMPと nicardipine を同時に前処置することにより，BtcAMPの刺 激によって Ca ストアからの Ca が細胞外に 放出され，再び細胞内へ流入するのを nicardipine が 阻 害 し た と 考 え ら れ る．こ の 結 果 も ま た，

BtcAMPによるステロイド産生には細胞外の Ca が重要な役割を果たしていることを示唆し ている．すなわち，Ca は BtcAMPによって細 胞が刺激されることにより，細胞内 Ca ストア Fig.5. Effect of BtcAMP on the［Ca ］ mobilization in BA  cell.

Fura 2‑loaded BA  cell was stimulated by 1 mM  BtcAMP at 30 sec after the start of recording in the presence(A)or absence(B)of extracellular  Ca . The result is the trace of typical experi- ment. Four such experiments were performed.

から放出が起こり，Ca が細胞外へ放出される．

その Ca が再度細胞内へ入りステロイド産生を 持続されると考えられる．この可能性については，

ウシ副腎皮質遊離細胞を用いた研究で cAMPが 細胞内 Ca 貯蔵部位からの Ca 放出を促進す ることを間接的に示唆した報告がある が，今 回，我々は BtcAMPが細胞内 Ca 貯蔵部位か らの Ca 放出を刺激することを Ca イメージ ングにより，直接的に示した．

細胞内 Ca 貯蔵部位として考えられるのは小 胞体，ミトコンドリア，核などがあるが，現在最 も活発に細胞内 Ca 動態に影響を与えているの は小胞体であり，おそらく cAMPは小胞体からの Ca 放出を促進すると思われる．小胞体からの Ca 放出に関与しているのは inositol 1,4,5‑tri- sphosphate(IP)の受容体 (IPR)およ び Ca ‑ induced Ca releaseを引き起こす ryanodine受 容体 (RYR)である ．cAMPは protein kinase A活性化を介して IPRをリン酸化し，I  Pの結合

性を高める可能性が示されているが ，一方で は膵 β細胞において，cAMPはある種のタンパク と結合し，その複合体が小胞体の RYRを介して 小胞体から Ca を放出するという報告もある ． 我々の用いた BA細胞に IPRが存在することは 明らかにされている ．また，今回データに示さな いが，我々は RT‑PCRにより RYRの存在を示唆 する結果も得ている．しかしながら現在のところ，

cAMPによる細胞内 Ca 貯蔵部位からの Ca 放出機構に，どちらの受容体が関与しているのか は不明である．今後の検討が必要である．

結 語

1) ウシ副腎皮質細胞におけるステロイド産生 と Ca イメージングを指標にして cAMPによ るステロイド産生と Ca の連関について検討し た．

2) 細胞外 Ca 無添加条件下で，BtcAMPお よび，forskolin刺激では時間依存的にステロイド 産生を促進したが，インキュベーション開始 30分 後，60分後，90分後に nicardipineを添加すると，

以後のステロイド産生は強い抑制傾向が観察され た．

3) 細胞外 Ca 無添加条件下で，BtcAMPお

よ び nicardipine前 処 置 し た 細 胞 に 対 す る BtcAMPによるステロイド産生は BtcAMP単 独前処置よりも弱かった．

4) 細胞外 Ca 無添加条件下における EGTA 添加により，BtcAMPによるステロイド産生は 抑制された．

5) Ca イメージングにおいて，細胞外 Ca 存在および非存在下で 1 mM  BtcAMPは細胞内 Ca 濃度を上昇させた．

6) 以上の結果より，ウシ副腎皮質細胞におい て，cAMPにより Ca ストアから遊離した Ca が細胞外へ放出され，VOCを介して細胞内へ再流 入しステロイド産生に関与していることが示唆さ れた．

本論文を作成するにあたり，御指導，御校閲を賜り ました川村将弘教授に深甚なる感謝の意を捧げます．

また，本研究に御協力いただきました東京慈恵会医科 大学薬理学講座第 1の方々に深く感謝いたします．

文 献

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