新規スクロースアナログ二糖の酵素利用合成と

新規スクロースアナログ二糖の酵素利用合成と プレバイオティクスとしての機能性評価

日本大学大学院 生物資源科学研究科 生物資源利用科学専攻 博 士 後 期 課 程

保 坂 浩 貴

２０２０

序論

1.

1-1.

1-2.

1-3.

1-4.

1-4-1.

1-4-2.

2.

(SucNAc)

2-1. N-

(SucNAc)

2-1. N-

(SucNAc)

3.

本論

第１章 新規スクロースアナログ二糖の合成 第

1

第

2

1.

1-1.

2.

2-1.

2-2.

第

3

1.

1-1.

1-2.

1 1 2 4 5 5

6 7 8

9

9

11 11

12

17

1-3. SucAM

2.

2-1.

2-2.

(Saccaromyces bisuporus NBRC1131)

2-3.

(GlcAM)

2-4. pH

2-5.

(SucAM)

2-6.

2-7.

2-8. SucAM

2-9.

第

4

1.

1-1.

1-2.

1-3.

2.

2-1.

2-2.

2-3.

第

5

1.

1-1.

1-2.

1-3.

2.

24 25 26 26 26 27 27 28 28

29 30 30

32 33 34

34 34

36

2-1.

2-2.

2-3.

第

6

第

2

1

第

2

1.

第

3

1.

1-1.

1-2.

1-3.

1-4.

1-4-1.

1-4-2. TLC

1-4-3.

1-4-4. pH

2.

2-1.

2-2.

2-3.

2-4.

第

4

36 36 36

38

38

48 48 48

49 49 50 50

50 50 50 51

51

第

3

第

1

第

2

1.

2 . Bifidobacterium pseudocatenulatum

2-1. Bifidobacterium pseudocatenulatum

Suc

2-2. Suc

(

pH)

2-3. Bifidobacterium pseudocatenulatum

SucNAc

2-4.

pH

2-5.

(TLC

) 2-6.

3. Bifidobacterium longum subsp. infantis

Suc

4. Bifidobacterium longum subsp. infantis

第

3

1.

1-1.

1-2.

TLC

2. Bifidobacterium. pseudocatenulatum

Suc

2-1.

2-2.

2-3.

Suc

52

52

54 58 58 62 63 64

64

66

68 68

69 70

70

2-3-1.

2-3-2.

2-3-3.

(TOYOPEARL Super Q-650 S)

2-3-4.

(DEAE-Sepharose)

酵素の精製

2-3-5.

(Phenyl-Sepharose)

2-3-6.

2-3-7.

2-8.

2-9. N

2-10. Bifidobacterium pseudocatenulatum

Suc

(

pH)

3. Bifidobacterium pseudocatenulatum

3-1.

3-2.

3-3.

の探索

3-3-1.

3-3-2.

3-3-3.

(TOYOPEARL Super Q-650 S)

3-3-4.

(DEAE-Sepharose)

酵素の精製

3-3-5.

(Phenyl-Sepharose)

70

71

71

72 72 73 73 74

75

75 76

76 76

77

77

77

78

3-3-6.

3-3-7.

3-3-8. N

3-3-9. Bifidobacterium pseudocatenulatum

Suc

(

pH)

3-3-10.

(TLC

)

3-3-11. Suc

SucNAc

4. Bifidobacterium longum subsp. infantis

Suc

4-1.

4-2.

4-3.

4-3-1.

4-3-2.

4-3-3.

(TOYOPEARL Super Q-650 S)

5.

Bifidobacterium longum subsp.

infantis

5-1.

5-2.

5-3.

5-3-1.

5-3-2.

5-3-3.

(TOYOPEARL Super Q-650 S)

第

4

第

4

78 79

80 80 80

81 82

82 82

83

83 84

84 85

85

86

87

4-1.

参考文献

序論

1

1-1

オリゴ糖とは、糖類の分類上の名称で

Oligo-saccharide

2-10

[1]

1-2

近年の食用のオリゴ糖に関する研究は、嗜好性からヒトの健康に及ぼす生理 機能特性を対象とする方向に発展してきた。その過程において、数種の特殊構造 ヘテロオリゴ糖に非・抗う蝕性、整腸効果、ミネラル吸収促進効果などの有用生 理機能特性が見出されたことから、それらは機能性オリゴ糖と呼ばれ健康補助 食品として使用されるようになった

[2]

1970

1980

[3]

世界に先駆けて種々のオリゴ糖生産が可能となった背景には、発酵や醸造など の伝統技術から得られた新しい微生物起源の糖質関連酵素の発見とそれらの利 用技術、オリゴ糖の分離・精糖技術の発展があった

[3]

パラチノース、フラクトオリゴ糖、ラクトスクロースをはじめ、現在までに数 多くの特殊構造オリゴ糖が酵素反応により生産され、その難消化性の性質から プレバイオティクスオリゴ糖として使用されてきた

[4]

スなど、生物が大量に生産し安価に入手できる身近な糖質の利用を基盤として 開発されたことと、これらの糖質に作用する様々な酵素の探索、基礎研究、およ び開発研究が活発に行われ、工業的に利用することが可能になったためである。

1-3

[4-8]

オリゴ糖には様々な機能特性があり、一次、二次、三次およびその他の機能特 性に分ける事ができる。

(Table 1)

Table 1

一次機能

消化性、難消化性、エネルギー値など。

二次機能 甘味、苦味、保湿性、水分活性、浸透圧、着色性、熱安定

性、

pH

三次機能

整腸作用、非・低・抗う蝕作用、血糖値上昇抑制作用、コレ ステロール上昇抑制作用、ミネラル吸収促進作用、インスリ ン分泌非刺激性、免疫賦活作用、抗酸化作用、肝機能改 善作用、アトピー性皮膚炎改善作用など。

その他

酵素特異的基質・阻害剤、エリシター活性、タンパク質のリ フォールディングなど。

一次機能はオリゴ糖の消化性、及び難消化性に関する栄養機能である。栄養表 示基準制度の施行

(

8

5

24

)

物理化学的特性 嗜好特性 栄養特性

生物学的特性 生体調節機能

よびエネルギーの表示が可能になった。二次機能はオリゴ糖の物理化学特性と それに基づく嗜好性に関わる分野であり、食品の美味しさと日持ち効果に関係 する諸特性がある。

また、三次機能は生体調節機能などの生物学的特性に関わる分野であり、最近 の新規オリゴ糖開発において特に重要視されるのがこの機能である。以下に機 能性オリゴ糖に関する三次機能の主な例を示す。

・難消化性：消化管では吸収されずに大腸まで到達するオリゴ糖類を、難消化性 オリゴ糖という。これらが腸内細菌に資化されることによって、様々 な生体調節機能が発現する。これらのオリゴ糖は消化管では吸収さ れず大腸に到達し、腸内細菌によって発酵を受け、酢酸、プロピオ ン酸、酪酸などの低級脂肪酸となって吸収され、エネルギーとなる。

・整腸作用：消化吸収されずに大腸まで到達したオリゴ糖は、腸内細菌の栄養源 となる。この腸内細菌の中において、有用な菌の代表となるのがビ フィズス菌であり、ビフィズス菌がこれを資化し、増殖することに よって、腸内の腐敗抑制、便秘や下痢の予防といった整腸にかかわ る効果が発現する。また、ビフィズス菌が有機酸を生成することに よって、腸内環境が酸性に保たれ、ヒトに悪影響を及ぼす菌の増殖 が抑制される。また、ビフィズス菌増殖活性を示す市販オリゴ糖は、

フラクトオリゴ糖、ラクトスクロース、ラフィノース、イソマルト オリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖などがあり、この機 能に基いて特定保健用食品としての表示許可を消費者庁より受け、

市販されている商品もある。

・抗う蝕性：う蝕

(

)

3

pH 5.5

(

)

・ミネラル吸収促進作用：難消化性オリゴ糖が腸内細菌に資化されて腸内環境 が酸性化することにより、カルシウムやマグネシウム、

鉄などの吸収が促進されやすくなることが動物実験 で明らかになっている。

1-4

[9]

整腸作用とは、

1

毎規則正しく便通がある状態を保つことがあげられる。

2

1-4-1

[10-13]

プレバイオティクスとは、

1995

Gibson

Roberfroid

宿主の健康に有利に働く非消化性食品成分」のことを示す

[10]

[11]

Lactobacillus

Bifidobacterium

[12]

プレバイオティクスの特徴は、由来の異なる様々な有益菌を生菌で摂取する プロバイオティクスとは異なり、摂取者の腸内常在菌を増殖できることにある。

そのため、プロバイオティクスとプレバイオティクスを合わせて摂取すること で、プロバイオティクスの効果と接種者本来の機能を高めることから、シンバイ オティクスが医療現場などで薦められている

[13]

1-4-2

[14-17]

腸は消化・吸収器官としてだけでなく、最大の免疫器官であることがわかって きた。腸は常に外界からの病原菌、毒素、アレルギー原因物質にさらされている

[14]

6

[15]

Bifidobacterium

100

[16]

Bacteroides

Eubacterium

Peptostreptococcus

減少することである。幼児期から成人までの腸内細菌叢に差異は示さないが、老

人 に な る と 腸 内 細 菌 叢 が 変 化 す る 。 健 康 な 成 人 と 比 べ 老 人 の 腸 内 は 、

Bifidobacterium

[17]

Escherichia coli

Clostridium

perfrigens

だけでなく、宿主の生理、病理、気象、ストレスや食生活など様々な要因によっ ても腸内細菌叢は変化する

[16]

2

(SucNAc)

2-1 N -

(SucNAc)

[18-20]

平野らにより、サトウキビなどから抽出して得られるスクロース

(Suc)

N-

(GlcNAc)

β-

Aspergillus oryzae

基が

GlcNAc

N-

(Fru β -

2,1- α GlcNAc, SucNAc)

[18]

A. oryzae

SucNAc

反応法と

UDP-GlcNAc

させるという酵素合成法の

2

[19, 20]

UDP-GlcNAc

SucNAc

に対し、当研究室の

SucNAc

GlcNAc

A. oryzae

2

2-2 N -

(SucNAc)

[21]

佐藤らは、

SucNAc

[21]

A. oryzae

β-

A. oryzae

A. oryzae

GlcNAc

SucNAc

の連続生産を行うことができた。研究室レベルのごく小規模な生産システムを 利用しているにもかかわらず、一か月間の反応で得られた

SucNAc

100 g

SucNAc

この生産プロセスで、カラムリアクターからの溶出液に酵母による前処理を 行うことにより夾雑する糖質を除去し、活性炭カラムクロマトグラフィーのみ を用いて高度に

SucNAc

また、酵母による前処理を行った場合には、比較的高価な原料である

GlcNAc

3

古くより、

Suc

これらオリゴ糖の殆どは、グルコース

(Glc)

3

Suc

(GlcN)

(GlcA)

本論

第１章 新規スクロースアナログ二糖の合成

第１節 緒言

食用オリゴ糖の中で、スクロースは甘味料・調味料として最も大量に消費されて いるオリゴ糖である。また、本二糖は種々の機能性オリゴ糖の製造原料としても使 用されており、グルコースおよびフルクトースの供給源となっている。しかし、ケ トヘキソフラノースである

_D -

_D -

β,α - 2, 1

(

)

第

2

1.

1-1.

N-

(SucNAc)

(ORGANO Amberlite IRA402BL OH AG)

100°C

5

SucNAc

の後、ろ過により回収した樹脂を水で

2

1 N HCl

(Fig. 1)

Fig. 1

m/z

= 406 [M+Na]

m/z = 342

[M+H]

m/z = 364 [M+Na]

SucNAc

のアセトアミド結合が加水分解された

SucN

SucNAc

SucN

93%

(Fig. 2)

Fig. 1 ESI-MS

. A:

(SucNAc)

ESI-MS

, B:

(SucN)

ESI-MS

Fig. 2

(SucN)

2.

2-1.

原料で用いた

SucNAc

[16, 19]

SucNAc 1 g

30 mL

(ORGANO Amberlite IRA402BL OH AG)

20 g

100°C

5

(5A)

2

1 N HCl

行った

(pH 6.5)

真空ポンプを用いて乾固した。乾固したサンプルにイオン交換水

10 mL

- 80°C

(VD-800F)

2-2.

LCMS-2020 (SHIMADZU)

ESI

1 mg

2 mL

第

3

1.

1-1.

(GlcA)

Suc

Microbacterium saccharophilum (M.

saccharophilum) K-1

-fructofuranosidase

ン酸

(SucA)

この原因が

GlcA

GlcA

(GlcAM)

グルクロノ

-6,3-

(GlcL)

(IRA402BL OH AG)

GlcAM

[22]

GlcAM

72.3%

(Fig. 3)

Fig. 3

しかし、

GlcAM

GlcL

GlcA

告されている

[23]

GlcAM

pH

GlcAM

を用いて確認した。

pH 4.0~8.0

1/5 McIlvaine

GlcAM

2% (w/v)

GlcAM

pH 4.0-6.0

GlcAM

酸性条件下で比較的安定であることがわかった

(Fig. 4)

Fig. 4

pH

.

0.67% (w/v) GlcAM

1% (w/v) Suc

20 mM

(pH 5.0)

M. saccharophilum K-1

 - fructofuranosidase

10 U

27°C

(TLC)

その結果、

Fig. 5

確認できた

(Fig. 5)

M. saccharophilum K-1

移型

β-fructofuranosidase

Glc

本反応でも、基質である

Suc

(Fru)

Glc

が

Fig. 5

TLC

Glc

資化する

Suc

Saccaromyces bisuporus NBRC1131(S. bisuporus

NBRC1131)

Fig. 5 TLC

.

示す

.

上記と同様の条件で作成した混合糖溶液に、

S. bisuporus NBRC1131

β-

10 U

27°C

(HPLC)

TLC

Fru

(Fig. 6A-1)

Suc

S. bisuporus NBRC1131

Fru

S. bisuporus NBRC1131

Glc

Suc

(Fig. 6A-3)

S. bisuporus NBRC1131

基質に影響を及ぼさないことも確認できた

(Fig. 6A-2)

HPLC

S. bisuporus NBRC1131

とが確認でき、

S. bisuporus NBRC1131

(Fig. 6B)

得られた生成物を、活性炭カラムクロマトグラフィーに供し、水を流すことで単 糖類を除去した後、

5%

Suc

15%

Fig. 6

. (A) TLC

, 1: M. saccharophilum K-1 β-fructofuranosidase

, 2: S.

bisporus cells

, 3: M. saccharophilum K-1 β-

fructofuranosidase

S. bisporus cells

,( )

, ( )

Fru

. (B) HPLC

, (  ) M. saccharophilum K-1 β-

fructofuranosidase

, (  ) M. saccharophilum K-1 β-

fructofuranosidase

S. bisporus cells

.

1-2.

糖転移生成物の構造確認は、¹

H-NMR

C-NMR

HSQC

HMBC

その結果、

ESI-MS

m/z = 393 [M+Na]

できた

(Fig. 7)

SucAM

らに、各

NMR

(Fig. 8-11)

Fig. 7

ESI-MS

Fig. 8

_H-NMR

Fig. 9

_C-NMR

Fig. 10

_H-

_{C HSQC-NMR}

Fig. 11

. (A)

_H-

_{C HMBC NMR}

. (B)

NMR

:

H-NMR

C-NMR

HMBC NMR

NMR

GlcAM

anomeric proton( δ 5.52) の結合定 数は 3.88 Hz (J

)

GlcAM

α-

化合物中のグリコシド結合の位置は、¹

H-

C HMBC-NMR

GlcAM

anomeric proton のシグナルは、それ自身の C3(

72.3)

C5(

71.7)

Fru

C2'(

104.0)

このことから、反応生成物は

α-

1

β-

2

(SucAM)

1-3. SucAM

精製した

SucAM

(Amberlite IRA402BL OH AG)

50°C

30

1N NaOH

6 N HCl

中和した溶液を活性炭カラムクロマトグラフィーに供し、イオン交換水を充分に流 して塩類を除去した後、

10%

化合物の構造確認は、¹

H-NMR

C-NMR

HMQC

HMBC

その結果、

ESI-MS

m/z = 355 [M-H]

(Fig. 12)

NMR

(Fig. 13-16)

Fig. 12

ESI-MS

Fig. 13

_H-NMR

Fig. 14

_C-NMR

Fig. 15

_H-

_{C HMQC-NMR}

Fig. 16

. (A)

_H-

C HMBC NMR

. (B)

NMR

:

H-NMR

C-NMR

HMBC NMR

NMR

GlcA

anomeric proton( δ 5.41) の結合定数 は 3.79 Hz (J

)

GlcA

α-

化合物中のグリコシド結合の位置は、¹

H-

C HMBC-NMR

GlcA

anomeric proton のシグナルは、

C3(

72.3)

C5(

71.7)

Fru

C2'(

104.0)

α-

1

β-

2

β- D -fructofuranosyl-(2↔1)-α- D -glucopyranuronide (

酸

: SucA)

本操作により、原料である

Suc

SucA

36.9%

2.

試薬は特記しない限り富士フィルム和光純薬株式会社の物を用いた。また、試薬の調 製は特記しない限り使用キットマニュアルおよび、バイオ試薬調製ポケットマニュアル

(

)

2-1.

本研究で対象とした

M. saccharophilum K-1

β-fructofuranosidase

β-fructofuranosidase

Suc

を

Somogyi-Nelson

50 mM

液

(pH 6.5)

30

1

1 μmol

Suc

1 U

酵素反応は

0.4% (w/v) Suc 50 µL

50 µL

30°C

10

0.1 mL

Somogyi

0.1 mL

20

Nelson

0.2 mL

1.6 mL

後、

15

OD

検量線用基準液は市販のグルコースを使用し、

0-100 µg/ mL

1 mL

U/mL ・ min = 標準液の還元糖量 ( µM ) 標準液のΔ OD

× サンプルのΔ OD

× 1

反応時間 ( 分 )

×

反応液量 ( mL )

使用した酵素量 ( mL ) × 1

2 × 酵素原液希釈倍率 × 1

1000

発色試薬は以下の組成で調整した。

(Somogyi

*)

・

Somogyi A

硫酸銅

5

(CuSO

H

O) 15 g

100 mL

・

Somogyi B

炭酸ナトリウム

(Na

CO

) 25 g

(NaHCO

) 20 g

(Na

SO

) 200 g

1 L

Fill up

*

Somogyi A

1 mL

Somogyi B

25 mL

(Nelson

)

ヒ素水素

2

7

(Na

HAsO

7H

O) 3 g

50 mL

(A

)

[(NH

)

Mo

O

4H

O]

25 g

900 mL

23 mL

A

1 L

2-2.

( Saccaromyces bisuporus NBRC1131)

本研究で使用した

S. bisuporus NBRC1131

(NITE)

S. bisuporus NBRC1131

YM

[0.5% (w/v)

0.3% (w/v)

1% (w/v)

0.3% (w/v)

2%

(w/v) Agar]

1

2 mL

YM

[0.5% (w/v)

, 0.3% (w/v)

, 1% (w/v)

, 0.3% (w/v)

]

(28°C, 200 rpm, 1

)

50 mL

YM

500 µL

(28

200 rpm

1

)

(4

, 8,000×g, 5 min)

20 mM

(pH 5.0)

20 mL

(4

, 8,000×g, 5 min)

2

2-3.

(GlcAM)

グルクロノ

-6,3-

(GlcL) 30 g

600 mL

(ORGANO Amberlite IRA402BL OH AG) 30 g

1

(5A)

(ORGANO Amberlite

IRA402BL OH AG)

30 mL

置することで未反応

GlcL

2

GlcL

40 mL

GlcAM

2-4. pH

0.2 M

0.1 M

pH

(pH 5.0, 6.0, 7.0, 8.0)

Mcllvaine buffer

Mcllvaine buffer

5

1 / 5 Mcllvaine buffer

GlcAM 0.1 g

1 / 5 Mcllvaine buffer 5 mL

P-120 (

)

(

10

×

100 mm)

光度は以下のように計算した。

[α]

= α

𝑚 × 𝑐 × 100

α:

(

) (

) m:

(10 cm = 1 dm) c:

% (w/v)

°C:

(23°C) D:

(

D

; 589 nm)

2-5.

(SucAM)

Suc 1 g (2.92 mmol)

GlcAM 0.67 g (3.21 mmol)

20 mM

(pH 5.0)

10 mL

ある

S. bisuporus NBRC1131

M. saccharophilum K-1

β-fructofuranosidase

を

10 U

27°C

0, 1, 2, 4, 8, 24h

500 µL

(4

, 8,000×g, 5 min)

(Centrifugal Filter Units 10K) (4

, 10,000

g, 5 min)

TLC

HPLC

酵素反応により生成したオリゴ糖および単糖は、薄層クロマトグラフィー

(6 cm

10 cm) (Silica Gel 60; 0.25 mm, Merck)

/

[7 : 1(v/v)]

Silica Gel 60

10

1 µL

[2.4% (w/v)

, 5% (w/v)

, 1.5% (w/v)

]

(HEATING GUN, HAKKO)

1% (w/v) Suc

1% (w/v) Glc

1% (w/v) Fru

1% (w/v) GlcAM

1% (w/v) GucL

(

; 1 µL)

サンプリングした反応液を

10

HPLC

Sugar-D

(

4.6

250 mm, Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)

(RI)

/

[41 : 9(v/v)]

1 mL / min

2-6.

反応液を活性炭カラムクロマトグラフィー

(

30

200 mm)

5% (w/v)

Suc

10% (w/v)

2-7.

糖転移生成物の構造解析は、¹

H-NMR

C- NMR

(MS)

H-NMR

C- NMR

Varian NMR system 600 spectrometer (Varian, Palo Alto,