アレルギー関連因子の評価法の開発とその利用に関する研究

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九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

アレルギー関連因子の評価法の開発とその利用に関する研究

高杉, 美佳子

九州大学農学研究科食糧化学工学専攻

https://doi.org/10.11501/3135077

出版情報：Kyushu University, 1997, 博士（農学）, 課程博士バージョン：

権利関係：

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の

アレルギ一関連因子の評価法の開発とその利用に関する研究

高杉美佳子

199 8

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アレルギ一関連因子の評価法の開発とその利用に関する研究

第1章

緒論

.…・・…・・・…..… ・・…・・…・・……・・・…-…一…H・H・-…・・一……… H ・ H ・ - … . . . .

1 第2章ラットおよびヒトにおけるアレルゲン特異的および

非特異的抗体の分析 . . . . ・H・-……. . . . ・H・....・H・ . . . …・… . . . .……一一…………・….

5

第 3 章アレルゲン特異的抗体発現のクラスおよびサブクラス依存性 .…・.

21

第4章 MAST法を用いたアレルゲン特異的19Aおよび�IgG

定量法の開発 …ー…一. . . ・H・..…・. . . .. . . . .. . . .. . . ..

3 ₄

第5章ヒト血清および唾液中のアレルゲン特異的および非特異的抗体発現

パターンの解析 . . . . ・ H ・ . . . ... ... . . .. . . ... . .

44

第6章食品のアレルゲン活性評価法の検討 . . . ・H・..…・・……・………. . . ・ H ・ . . . ・ H ・ - …

60

第7章マウスリンパ球を用いた免疫調節機能因子検定系の開発・……・…・・. 71 第8章マウス牌臓細胞の抗体産生に及ぼす食品成分の影響 … . . … . . . .. . . ・ H ・ . . . 81 第9章総括 .…・・・……一…一一……一一…… . . . .. . . ..... ... . ... . . ... . . .. . . . ..

101 文献

.…-…・・・・……H・H ・ - … ー・…・・・……一……...・H・...・H・ -…・・・・………

110

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第1章緒論

近年、わが国では住環境の変化に加え、食生活の内容が豊かになり多様化してきた。このことは小児の食生活においても同様で、乳児の離乳の早期化、乳幼児および小児の高栄養化などが食物アレルギー患者増加の原因の一部と考えられている。また、乳幼児や小児の食物アレルギーが原因で成人後も食物や環境因子に対してアレルギー症状を示す者が多いため、食物アレルギーは小児だけでなく成人にとっても切実な問題となっている(Casimir

et

a1.， 1993)。アレルギーは免疫機能の過剰反応によって引き起こされるが、 Coombs and Gell ( 1968) はアレルギ一反応を四つのタイプに分類しており、食物アレルギーや環境アレルギーはI型アレルギーによるものが多い。 1型アレルギーは、マスト細胞や好塩基球表面に結合したアレルゲン特異的IgEがアレルゲンにより架橋され、ヒスタミンやロイコトリエンなどのケミカルメディエーターが放出されることにより誘導される(Metcalfe， 1991)。血清中のIgE濃度は、健常人では非常に低いが、アレルギー患者においてしばしば高濃度で検出される(Bjorksten

_et

a1.，

1983)。したがって、血清中の総IgEおよびアレルゲン特異的IgEの測定は食物アレルギーの発症機構を理解する上で必要不可欠であると考えられる。

IgEの測定にはradioaller gosorbent test (RAST) およびその応用法(Adler

_et

a1.，

1991; William

et

a1.， 1992) や皮膚受身アナフィラキシー試験(PCA) が用いられている(Ovary 1958; Sed gwick and Holt， 1983)。これらの方法はIgE検出のための感度は充分であるが、 RASTは放射性同位元素を使用するための特別な施設が必要であり、 PCAは定量性に欠け、一度に多くのサンプルを分析することが困難である。酵素抗体法(enzyme-linked immunosorbent assay ; ELISA) はこれらの方法の代替法としてヒト、マウスおよびラットIgEの検出にも利用されている

(Doke _et a1.， 1989; Fehlner _et a1.， 1991; Fritsche and Bonzon， 1990)。しかし、通常

のELISA法の感度では抗原特異的IgEの検出には不十分である。そこで、より

検出感度の高いアビジン-ビオチン法を用いてIgEの定量を行い、アレルゲン

特異的IgEの発現について解析した。

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IgEだけでなくその他のクラスの抗体もアレルギ一応答に関与している可能性がある。 19Aには二つのサブクラスがあり、血清中だけでなく、分泌型19A (sIgA) は腸管粘膜の分泌液や唾液、涙にも合まれており(Watanabe

et

a1.，

1984)、腸管粘膜中の s1gAは腸管からのアレルゲンの吸収を抑制することによりアレルギ一反応を抑制する(Shorter and Tomasi， 1982)0 IgGは血中に最も多量に合まれている抗体であり、アレルギーの減感作療法により誘導される抗体でI型アレルギーの原因抗体である19Eと競合することによりアレルギー抑制的に働いたり(Aalbers e

et

aJ.， 1993)、終生免疫の獲得に関与している。 19Gには四つのサブクラスが存在しており、補体の活性化能やナチュラルキラー細胞の活性化能に若干の違いが認められるが(Janewa)ら1996)、機能の違いについては不明な点も多い。 19 M は初期免疫に関与する抗体であり、抗原感作を受けると一番最初に産生される。これらの抗体はアレルギーの発症および抑制に関与していると考えられるが、抗体の発現をクラス別に総合的に解析したものはほとんどない。そこで、本研究では健常人およびアレルギー患者血清中のアレルゲン特異的および非特異的抗体の発現パターンを解析した。また、腸管分泌液中の19A 発現に関する情報も非常に限られており、腸管内のアレルゲン特異的19Aの発現を調べることは困難である。そこで、 ELISAによる唾液19A定量法を確立し、

唾液中の19A発現を解析することにより腸管免疫系の活性の推測を行った。

M ultiple ant ig en simultaneous tes t (MAST) は多項目のアレルゲン特異的19E の同時定量が可能な方法であり、 RASTの代替法として利用されている(Agata

et al.， 1993; Brown _et al.， 1985; Miller _et al.， 1984)。そこで、多くのアレルゲンに対する抗体の発現を同時に解析するため、 MAST法を用いた血清および唾液中のアレルゲン特異的19Aおよび19G定量法を確立し、アレルギー患者および健常人の血清あるいは唾液中のアレルゲン特異的抗体発現について解析した。

食物アレルギーは食品中のアレルゲンと呼ばれるタンパク質によって引き起こされるため、アレルギー予防にはアレルゲンの除去が有効な手段となる。そのためには食品中のアレルゲンの同定が重要であるが、食品は加熱や加圧などの加工を加えることによりその物性が変化し、抗原性や栄養価が変化すること

2

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がある(Kilshaw et a1.， 1982; Nakamura et aJ.， 1993; Varshney et a1.， 1991)。また、

加工食品にアレルゲン合有成分が添加される場合もあり、正確なアレルゲンの検出法を確立する必要がある。加うるに、低アレルゲン食品や代替食品の開発

を行う場合、 in vitroにおけるアレルゲン活性の測定は臨床試験を行う前の予備試験としても必要であり、 in vitroでの食物アレルゲンの検出に、サンドイツチ

ELISA (Levieux and Venien， 1994; 1ρvegrove et a1.， 1993; Makinen -Kijunen and Palosuo， 1992)、inhibition ELISA (Kilshaw et aJ.， 1982)、radioimmunoassay

(Paganelli and Levinsky， 1980 ) などの方法が用いられている。

卵、大豆および牛乳はアレルギーを引き起こす主要食品と言われており、卵ではオボアルブ、ミン(OVA )" オボムコイド、オボトランスフェリン、リゾチームなどが(Ebbehoj et aJ.， 1995 )、大豆ではGJy mBd 30K などが(Ogawa et a1. ， 1991) アレルゲンタンパクとして同定されており、食品中の OVA抗原活性および大豆タンパクの抗原活性を調べることは卵アレルギーや大豆アレルギーの予防に役立つと思われる。また、アレルギー患者は代替食品を利用することも多いので、本研究では低アレルゲン食品あるいは代替食品開発のための基礎情報の獲得および抗原活性評価法の開発を目的として、分離大豆タンパク質のペプシンおよび微生物由来プロテアーゼ、分解非消化性画分であるUDFの抗原活性、

および降コレステロール食品として開発された大豆タンパク質を用いたマヨネーズ製品のOVA抗原活性を ELISA、inhibition ELISA により評価した。

19AやIgGの産生促進などのクラス特異的抗体産生調節はアレルギーの予防や生体防御に有効であると推察される。生体内では、 Bリンパ球はTリンパ球やマクロファージなどの免疫関連細胞と相互作用しており、 Bリンパ球からの抗体産生は、インターロイキン-4(IL-4)、IL-5、インターフエロン y(IFN-y) お

よび IFN-αなどのサイトカインによってクラス特異的に制御されている

(Gauchat et aJ.， 1991; Ochel et aJ.， 1991; Pene et a1.， 1988; Rousset et al.， 1991)。ま

た、マクロファージや抗原提示細胞などの接着細胞はIL-1を産生しており

(Borish et a1.， 1996)、 Tリンパ球を刺激することにより、抗体産生に影響を及ぼすことが考えられる。これらのサイトカインの他に、マイトジェンや生体およ

3

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び食品成分が抗体産生調節機能を有しており、産生応答が抗体のクラスにより異なることが報告されているが(Lim et a1.， 1994a， 1996; Kaku et a1.， 1997)、これらの実験はラットリンパ球を用いたものであるが、抗体産生調節機構の解明には抗体などの免疫関連試薬の充実しているマウスやヒトの系を用いることが望ましい。そこで、マウス牌臓細胞を用いた免疫調節機能因子検定系の開発を試みた。

ラクトフェリンやカゼインなどの乳タンパクはin vitroにおいて抗体産生を合めた免疫応答調節機能を有することが報告されているが(Yamada et a1.， 1989a，

1990a， 1991a)、その作用機構は不明であり、マウス牌臓細胞の抗体産生に及ぼす影響については明らかにされていない。そこで、マウス牌臓細胞の抗体産生に及ぼす乳タンパクの影響を検討し、その作用機構を解明するためにサイトカインの関与について検討した。

不飽和脂肪酸はリンパ球の増殖を抑制することにより免疫応答に影響を及ぼすことが報告されているが(Calder et a1.， 1992; Soyland et a1.， 1993; Tonkin et a1.，

1978)、抗体産生に及ぼす影響についての研究は非常に限られており、いずれもラットリンパ球を用いたものである(Lim et aJ.， 1996; Yamada et a1.， 1996)。そこで、脂肪酸がマウス牌臓細胞の抗体産生に及ぼす影響について検討した。多価不飽和脂肪酸の二重結合は酸素により容易に酸化され、それによって生じる脂質酸化物がアレルギーなどの免疫応答に影響を及ぼすことや(Doke et a1.，

1989)、天然抗酸化成分であるセサミンおよびαートコフエロールを摂食させたラッ

トでは肺のロイコトリエンc4の産生能が減少すること(Gu eta1.， 1994， 1995) などが報告されている。また、 Yamada et a1. (1996) はアラキドン酸のIgE産生促進作用の発現がαートコフエロールにより阻害されることを報告している。これらの報告は、抗酸化剤が脂肪酸の抗体産生調節活性を修飾する可能性を示している。そこで、脂肪酸と種々の抗酸化剤を共存させたときの抗体産生の変化についても検討した。

4

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第2章ラットおよびヒトにおけるアレルゲン特異的および非特異的抗体の分析

第1節緒百

食物アレルギーは小児だけでなく成人にも深刻な問題となっている。アレノレギ一反応は四つのタイプに分類されるが(Coombs and Gell， 1968)、食物アレルギーや環境アレルギーはI型アレルギーによるものが多い。 I型アレルギーは、

マスト細胞や好塩基球表面に結合したアレルゲン特異的IgE がアレルゲンにより架橋され、ヒスタミンやロイコトリエンなどのケミカルメディエーターが放出されることにより誘導される(Metcalfe， 1991)。血清中のIgE濃度は、健常人では非常に低いが、アレルギー患者においてはしばしば高濃度で検出される

(Bjorksten ^et a1 .， 1983)。したがって、血清中の総IgEおよびアレルゲン特異的 IgEの測定は食物アレルギーの研究に重要である。 IgEの測定には

radioallergosorbent test (RAST)およびその応用法(Adler

et

a1.， 1991; William

et

a1.， 1992)や皮膚受身アナフィラキシー試験(PCA) が用いられている(Ovary

1958; Sedgwick and Holt， 1983)。これらの方法はIgE 検出のための感度は充分であるが、RASTは放射性同位元素を使用するための特別な施設が必要であり、

PCAは定量性に欠け、一度に多くのサンプルを分析することが困難である。

酵素抗体法(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)はこれらの方法の代替法としてヒト、マウスおよびラットIgEの検出にも利用されている(Doke

^et

a1.， 1989; Fehlner

et

a1.， 1991; Fritsche and Bonzon， 1990)。しかし、通常の ELISA 法の感度では抗原特異的IgEの検出には不十分である。そこで、より検出感度の高いアピジンービオチン法を用いてラットIgEの定量を行い、アレルゲン特

異的IgEについて解析した。

IgEはアレルギーの発症に重要な役割を果たしているが、 IgEだけでなくその他のクラスの抗体もアレルギ一応答に関与している。分泌型IgA(slgA)は腸管粘膜の分泌液や唾液、涙にも合まれており(Watanabe

^et

a1.， 1984)、腸管粘膜中

5

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の sIgAは腸管からのアレルゲンの吸収を抑制することによりアレルギ一反応を

抑制する (Shorter and Tomasi， 1982 )

。

しかし、腸管分泌液中の19A発現に関する情報は非常に限られており、また、腸管内のアレルゲン特異的19Aの発現を

調べることは困難である。そこで、 sIgAの発現に関する情報を得るために ELISAによる唾液19A の定量を試みた。

第2節材料と方法

第1項一般試薬

ß-ラクトグロプリン(ß-L G)およびオボアルブ、ミン(OVA)は Sigma社(St.

Iρuis ， MO)より購入し、分離大豆タンパク質(ニューフジプ口氏Soy)は不二製油(大阪，日本)より提供された。抗原特異的抗体の定量のため、 βLGおよび OVAは50mM炭酸緩衝液で50μgfmlとなるように調製して使用した。 Soyは

50mM炭酸緩衝液に1 mg/mlとなるように懸濁し、 12.5∞xgで20分間遠心分離した上清を使用した。

ヒトの唾液および血清サンプルは九州大学食糧化学工学科の学生(男性3人、

女性4人、年齢21 �26歳)よりインフォームドコンセントを得て採取した。血清は、真空採血管により採血して室温で30分間放置した後、 1 ，500x gで15 分間

遠心分離して調製した。唾液は、吐き出し法により採取して75xgで20分間遠心分離した上清を用いた。サンプルは全て実験に用いるまで-200Cで保存した。

ラット関連抗体では、ヤギ抗ラットIgE(εchain)はBethyl社(Montgomery^，

CA)より、ビオチン標識マウス抗ラットIgE (εchain)およびラットIgE標準抗体をZymed社(SanFrancis co， CA)より購入した。

ヒト関連抗体では、ウサギ抗ヒトIgA(α-chain)F (ab')2断片、ウサギ抗ヒト IgG (y-chain) F (ab')2断片、ウサギ抗ヒトIgE(ε-chain)、西洋ワサビペルオキシ

ダーゼ(HRP) 標識ウサギ抗ヒトIgA F (ab')2断片、 HRP標識ウサギ抗ヒト(y-

chain)、 HRP標識アビジンおよびヒト標準抗体はDako社(Glostrup， Denmark) より、ビオチン標識抗体であるアフイニティー精製ビオチン標識ヤギ抗ヒト

6

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IgE (ε)はKPL社(Gaithersburg， MD)より購入した。固相抗体は 50 mM炭酸緩衝液で、 HRP標識抗体およびビオチン標識抗IgEは2%魚ゼラチン溶液でそれ

ぞれ1，0ü0倍に希釈して用いた。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)のために、アグリルアミドモノ

マー、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンおよびグリセロールはナカライテスクより、 N， N'-メチレンビスーアクリルアミド、ドデシル硫酸ナトリウム

(SDS)、ブロモフエノーノレブ、ルーおよび2-メルカプトエタノールは和光純薬(大

阪，日本)より、過硫酸アンモニウム(APS)、 N，N， N， N'-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)および分子量マーカーであるSDS-PAGE standards low range は Bio Rad社より購入した。また、電気泳動装置としてミニプロティアン

II 1-D 、

電源としてモデル200 /

2.0パワーサプライをBio Rad社より購入して使用した。

ウエスタンプロッテイングのために、装置はミニトランスプロットセルをBio Rad社より、転写用のニトロセルロース膜は Cellulosenitrat(E)をSchleicher

&

Schuell社(Dassel， Germany)より購入した。

イムノプロッティングのために、ブロッキング液はブロックエースを大日本製薬(大阪，日本)より、 HRP標識ウサギ抗ヒトIgE をDako社より購入した。

HRP標識抗体は 1/10ブロックエースで1，000倍に希釈して使用し、洗浄液は Tween 20 をナカライテスク(京都3日本)より購入し、 0.05%Tween 20 合有生理リン酸緩衝液(TPBS)を調製して使用した。検出には Amersham社

(Buckinghamshire， England)よりECL western blotting detection reagents を購入して使用した。

第2項免疫

4週齢のBrown Norway系雄ラットをセアック吉富(吉富，日本)より購入し、

飼育中はカゼイン20%を合むOVA無添加食を与えた。 oおよび21日目に3%

Al (OH)3 - 0.15 M NaClに懸濁したOVA を50μg/rat腹腔内に投与した。 24日目にジエチルエーテルで、麻酔し、腹部大動脈より採血を行った。採取した血液は

7

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3，000 x gで 15分間遠心して血清を調製した。

第3項血清中の抗体の分画

血清中の抗体の分画のため、カラム充填剤はBio-Gel

_HT

Hydroxylapatiteを、

溶出用緩衝液の濃度勾配作成装置はModel 385 Gradient Formerを Bio-Rad社 (Hercules， CA)より購入した。カラム装置はModuline™ Medium-Pressure

L aboratory Column (150 x 10 mm， 12 ml bed volume)をアミコン社(東京，日本 ) より、フラクションコレクターはLKB . Redi Fracを Pharmacia社(Uppsala，

Sweden)より購入した。溶出用緩衝液は、 0.05 M NaCl添加10 mMリン酸緩衝液(pH 7ムA緩衝液 )および0.3 M NaCl添

別

500 mM リン酸緩衝液(pH 5.8; B緩

衝液)を使用した。

カラムにハイドロキシアパタイトを充填し、 A緩衝液で一晩カラムを平衡化させた後、ラットあるいはヒト血清を 500μi添加してA緩衝液を流し、分取を

開始した。 A緩衝液16 mlで洗浄した後、吸着した IgEを30 mlのA緩衝液およびB緩衝液の直線濃度勾配(リン酸緩衝液 ;10 mM "-' 500 mM、 NaCl; 0.05 M "-' 0.3 M、 pH; 7.5 "-' 5

.8)により溶出した。

さらに、

B緩衝液16 mlで洗浄し、

合計60本の画分を得た。流速は2.8 mllmin、分取量は1.6ml/tubeの条件下で行った。分画した血清は実験に使用するまで40Cで保存した。

プロテイン Aカラムキット(Pierce社製 ; Rockford， IL)を用いて、ヒト血清中のIgE 画分中に存在する IgGを除去した。実験はキットのプロトコールに従っ

て行った。カラムを室温に戻して保存緩衝液を流出させた後、結合緩衝液でカラムを平衡化させた。分画した血清と結合緩衝液を1:1に混合してカラムに添

加し、血清が完全に流出した後に結合緩衝液でカラムに吸着していないタンパク質を流出させ、この溶液を SDS-PAGEおよびイムノプロッティングに用いた。

第4項 ELISA法による抗体の定量

Immuno-plate Maxi sorp C96をNunc社(Roskilide， Denmark)より購入した。

ELISA プレート洗浄液はTPBSを使用し、魚ゼラチンはSigma社(St.lρuis，

8

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MO)より購入し、 TPBSで2%になるように希釈し、ブロッキング溶液、 HRP 標識抗体、サンプルおよび標準抗体希釈液として使用した。発色基質溶液は、

0.0069るHρ2合有0.2Mクエン酸緩衝液(pH 4 .0)、超純水および6 mg/ml 2， 2'-アジノービス(3-エチノレベンゾチアゾリンー6-スルホン酸)ジアンモニウム塩( ABTS) 溶液を 10:9: 1で混合して用い、反応停止液には 1.5%シユウ酸溶液を用いた。

また、吸光度の測定には東ソ一社製( 東京，日本)のマイクロプレート分光光度計、

MRP- A4iを使用した。

血清IgEの定量においては、血清中のIgE濃度が低いので検出感度を上げるためにアビジンービオチン法を用いた。ラット血清IgEの測定においては、 50

mM炭酸緩衝液で1，000倍希釈した固相抗体を100μi、もしくは食品タンパク溶

液150μlを96well ELISA プレートに添加し、 370Cで1時間保温した。つぎに、

ブロッキング溶液を300μl添加して、 40Cで一晩ブロッキングした後、ブロッキング溶液で希釈したサンプルまたは標準抗体 50μlを添加し、 37 0Cで1時間保温した。さらに、ブロッキング溶液で2，000倍に希釈したビオチン標識抗ラッ

トIgE 100μlを添加して 1時間保温した後、ブロッキング溶液で5，000倍に希釈したHRP標識アビジン100μlを添加して1時間保温した。ビオチン標識抗体およびHRP標識アビジン添加における反応温度は 4、 20、 370Cで行った。最後に、

発色基質溶液 100μlを添加して370Cで15分間保温した後、 1.5%シュウ酸溶液を 100μlを添加して反応を停止させ、マイクロプレート分光光度計で415 nmの

吸光度を測定した。各反応過程の聞はTPBSでプレートを3回ずつ洗浄し、サンプル添加以後の洗浄は 4 回ずつ行った。

ヒト血清IgEの定量においては、血清サンプルおよび標準抗体を添加後、 40C で 1時間反応させ、ブロッキング溶液で1，000倍に希釈したビオチン標識抗ヒトIgEを 100μlずつ添加して40Cで1時間保温した。つぎに、ブロッキング溶

液で 5，000倍に希釈した HRP標識アビジン100μlを添加して 40Cで30分間保温した後、発色反応を行ったo サンプル添加以後の洗浄は4 回ずつ行ったo

ヒト唾液19Aの定量は通常の ELISA 法で行った。サンプルおよび標準抗体を添加後、ブロッキング溶液で1，000倍に希釈したHRP標識抗ヒトIgA抗体100

9

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μiを添加して1時間反応させた後発色反応を行った。各反応過程の反応温度はブロッキング以外は全て37 0Cで行い、洗浄は3回ずつ行った。

第5項 SDS-PAGEおよびイムノプロッティング

サンプル緩衝液は超純水:0.5 Mトリスー塩酸緩衝液(pH6.8) : 509るグリセロー

ル:19るブロモフェノーノレブルー:2-メルカプトエタノール=20 : 5 : 8

_: ₁

: 2に混合して調製した。泳動用緩衝液は、トリス(ヒドロキシメチル )アミノメタン6

mg/ml、グリシン28.8 mg/mlおよび SDS ₁ mg/mlとなるように超純水に溶解した。

ウエスタンブロッティング用緩衝液は、トリス(ヒドロキシメチル )アミノメタン3 mg/mlおよびグリシン 14.1 mg/mlとなるように超純水に溶解し、使用直前にこの溶液とメタノールを 4: 1に混合した。

ゲルの銀染色には、シルバーステインプラスキットをBio R ad社より購入し、

キットのプロトコールに従って操作を行った。ゲルの固定化には、メタノール:

酢酸:fixative enhancer concentrate :超純水=200

: 40 : 40 :

120に混合して

fixative enhancer solution (FES)を調製して用いた。染色には、超純水 35 ml、

silver complex solution 5.0 ml、reduction moderator solution 5.0 ml、lmage

development reagent 5.0 mlを混合し、使用直前に室温の development accelerator solution 50 mlを加えて、充分に撹持することにより、staining solution (SS)を調

製した。

SDS-PAGEはLaemmli(1970)の方法にしたがい、49る濃縮ゲルおよび129る分離ゲルを用いて泳動を行った。サンプルはサンプル緩衝液と容量比1 : 1で混合し、1 000Cで 5分間加熱後、1ウェルあたり 10μlずつ添加して200V、30分間

泳動した。

SDS-PAGE終了後、ゲルを FESに浸して固定化し、超純水で、2回洗浄した。

調製したSSにゲルを浸し、おだやかに撹持しながら染色を行った。染色終了後、

5%酢酸溶液にゲルを浸して反応を停止させた。

ウエスタンプロッティングは 100V、1 時間の条件下で行った。転写後、40C で一晩ブロッキングを行い、HRP-標識抗体を添加して室温で2時間静置して反

(15)

検出 ECLによる蛍光発色はキットのプロトコールに従って行った。

応させた。

試薬1および2を1 : 1に混合してニトロセルロース膜に添加し、 1分間反応させ各 1分間現像した。

て蛍光発色させ、 8分間ポラロイドフィルムに感光した後、

操作の聞は全てTPBSで10分ずつ3回の洗浄を行った。

結果第3節

ELISA法によるラットIgE測定に及ぼす反応温度の影響第1項

OVA特異的19Bおよびバツクグランドの吸光度をFig.2-1に示した。

19Eを合まないパックグランドの吸光

度は、 370Cでインキュベートを行った場合、総19Eの測定においては0.12、

反応温度を変えたときのラット血清中の総19E、

しかし、反応

OVA特異的19Eの測定においては0.15とかなり高い値を示した。

パックグランドの値は総19Eの測定においては0.03、

温度を40Cにした場合、

OVA特異的 OVAで免疫したラットとしてい

また、

OVA特異的19Eの測定においては0.0 7にまで減少した。

IgEの測定値は、反応温度を370Cにした場合、

0 8 6 4

2 11 ハU ハU ハU

ハU

(23『)同切回ωロ刀ω色m，d刊kp。

じニ________.

1.0

令0.8

吋マ

"-' 0.6

同

同叫。心

] ^0.4

H 0

0.2 0.0 0

0.0 0 ₂₀ ₃₀ 40

Reaction temperature (OC)

40 10 20 30

10 Fig.2・1. Effect of Reaction Temperature on the Determination of Total and

Ovalbumin-specific Rat Serum IgE by the A vidin-biotin Method. The total and

OV A-specific IgE contents in sera from 3 rats immunized with OV _A (・) and in sera from

3 non-immunized rats (0) were determined at 4， 20， and 370C. Each A415 value was

deduced from the background level measured each reaction temperature ( ・ ) .

(16)

ないラットのどちらにおいても高濃度のOVA特異的IgEが検出されており、免

疫による抗原特異的IgEの発現量の違いは認められなかった。これに対して、

反応温度を下げた場合、免疫していないラット血清中のOVA特異的IgEのシグナルは免疫したラットのシグナルより速やかに減少し、反応温度が40Cの場合ではOVA特異的IgEの発現量に明らかな差が認められた。

第2項ハイドロキシアパタイトカラムを用いたラットおよびヒト血清の分画

Immunized Non-immunized

0.20 370C 370C

0.15

0.10

(23刊)同切同ω回一ωω島mad刊除。

0.05 O.∞

0.15 0.10 0.05

0.00 0 20 40 60 。 20 40 60

Fraction number

100

50

忠

信

』 ω

�

箇ロ

100 。

50 80 0

Fig.2・2 EtIect of Reaction Temperature on the Determination of OV A-specific IgE

in Sera Fractionated by a Hydroxyapatite Column. The OV A-specific IgE contents

in the hydroxyapatite column fractionates of sera obtained from a rat immunized with

OVA and a non-immunized rat were determined by the ELISA method at 4 and 370C.

(17)

ッ

一フ

第1項で示した反応温度による測定結果の違いを明らかにするために、

それぞれの画分のOVA特異ト血清をハイドロキシアパタイトカラムで分画し、

的IgE量を40Cおよび370Cの反応条件下でアビジンービオチン法により測定した。

Fig.2-2に示したように、免疫していないラット血清においては、 370Cで OVA これに対して、免特異的シグナルが検出されたが、 40Cでは検出されなかった。

疫したラット血清においては、 370CでOVA特異的シグナルのピークがいくつか番最後のピークのみが消失した。

検出されたが、 40Cでは

三F、ーー

の溶出位置の違いを解析するためには高濃度のIgEを合んだ血清が必要である。

OVA特異的IgEには複数のピークが検出されたが、

Fig.2-2の結果より、

(民)償・む匂ロ凶

100 1∞

。 50 50

(回同守司)同凶同ωロ℃ω《凶mEd刊k，。

。

ゥ，U

1i

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ハUぷU ハU

A

0.2 0.0

0.4

0.2 ハU ハU ハU

1.0 0.8 0.6 0.4

fo ハU

(虫マ〈)同関岡ωロ刀ω色白・ロ伺mwahc∞

(@eHM23刊)-30H

50 Fraction number

40 30 10 20

Fig.2・3. Measurement of Total and Antigen-specific IgE in Human Serum

Fractionated by a Hydroxyapatite Column. Total (A) and antigen-specific IgE (B)

contents were detennined by the ELISA method. (・); OVA-specific， (0); _soybean

specific IgE.

(18)

そこで、血清IgEの抗体価が高く、以前に大豆アレルギーと診断されたヒトの血清について同様の検討を行った。 Fig 2- 3に示したように、総IgEにおいては 17 および 22番目に 2 つのピークが認められた。 OVA特異的IgEにおいては14、

17、19、22、26番目にピークが認められ、特に19番目のピークが最も高かった。

また、 Soy特異的IgEにおいては16、19、28 、46、5 0番目にピークが認められ、

特に28 番目のピークが最も高く、抗原の種類によりIgEの溶出ピークが異なることが明らかとなった。

第3項イムノプロッティングによるヒトIgEの分析

Fig.2-3で抗原特異的IgE抗体価が最も高かった19 および28 番目の画分について、 SDS-PAGEおよびイムノプロッティングを用いて解析を行った。また、

IgEに対する抗体はIgG と交叉反応することがあるのでプロテインA により

IgGを除去した画分についても同様の検討を行った。 OVA特異的IgEピーク画分および Soy特異的IgEピーク画分には分子量約74kDaのIgE重鎖と思われるバンド、分子量約51kDaのIgG重鎖と思われるバンド、および分子量約23 kDaの軽鎖と思われるバンドを合む複数のバンドが検出されたが、プロテイン Aで処理したそれぞれのピーク画分では51kDaおよび23kDaのバンドは消滅し、74kDaの濃いバンドおよび85 kDaの薄いバンドが検出された(Fig. 2-4 A)。

イムノプロッティングを行った結果、OVA特異的IgEピーク画分およびSoy 特異的IgEピーク画分では 74kDaと 85 kDaの二つのバンドが検出され、プロテインA で処理したそれぞれのピーク画分では分子量約85 kDaのバンドは消滅

し、74kDaのバンドのみが検出された(Fig. 2-4 B)。

第4項 ELISA法によるヒ卜唾液IgAの検出

成人ドナー5人の唾液中の総19A、ß-LG、OVA および、Soy特異的19A を

ELISA法で測定した結果をFig.2-5 に示した。 5人のドナーにおいて、唾液中の総IgA濃度は190- 470μg/mlで検出されており、その発現量の違いは約2.5倍であった。代表的な食物アレルゲンであるß-LG、OVAおよび、Soy に対する唾液

(19)

A

Heavy chain (ε)�

Heavy chain (y)一一炉

Light chain-・P

B

2 3 4

-

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一、写�.-!.;

i _-

ゐ園田園田

•

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‘晶噌副島

2 3

...-司ーー

e .

4 Fig.2・4. Detection of IgE in Human Serum by SDS-PAGE and Immunoblotting.

Serum fractionated by a hydroxyapatite column was applied to SDS-PAGE and immunoblotting. Panel A shows silver staining of polyacrylamide gel and panel B shows ECL detection of immunoblotted membrane. Lane 1， peak fraction of OVA- specifìc IgE� lane 2， peak fraction of soybean-specific IgE� lane 3， protein A -treated peak fraction of OV A-specific IgE� lane 4， protein A-treated peak fraction of soybean-specific

IgE.

19Aの濃度を測定した結果、各ドナーの分泌パターンは類似した傾向を示したが、

その発現量は2.7

_- ₅₀

ngfmlの範囲で検出されており、発現量の違いは約19倍と総19A量より個人差が大きいことが明らかとなった。また、総IgAに対する抗原特異的IgAの割合は1

_%

(ドナーC、 OVA特異的19A)から12

_%

(ドナーD、

(20)

600 60

Total Iß・lactoglobulin

宙

空 ^4∞ ^-

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( 、g 皆司 ^、、 ₄₀

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A B C D E A B C D E

Donors Donors

60 60

Ovalbumin _" I Soybean

-、g E 司、

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20

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￡

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￡

。。

A B C D E A B C D E

Donors Donors

Fig.2・5. Determination of Total and Food Component-specific IgA in Human Saliva. In adition to total IgA， ß-LG-， OVA- and s oy _b _ean _-spe _c _ifi _c IgA in human saliva obtained f rom fi ve donors (A -E) were dete口nined by ELISA.

Soy特異的19A)であり、ドナーCは、他のドナーが三種類の抗原において総

19Aに対する比率が8%以上であるのに対し、 5%以下と食品成分特異的唾液 19Aの発現率が低い傾向が認められた。

一人のドナーの唾液を午前10時から午後10時まで3日間連続して採取し、総

唾液I�生および食物抗原としてSoy特異的IgA発現量の日内変動を調べた。 Fig.

2-6に示すように、総IgAは107-5，400 f.tg/ml、 Soy特異的IgAは5 - 224 ng/ml の範囲で検出されが、その発現量にサンプル採取時刻依存性は認められなかっ

た。

16

(21)

第4節考察

多くの物質が合まれている溶液の中 ELISA法(Engvall and Perlman， 1971) は、

から種々のタンパク質や生体成分を特異的に検出する方法として最も頻繁に用ウいられている。抗体を用いる実験系では抗体の非特異的吸着を防ぐために、

シ血清アルブ、ミンや乳タンパクによるブロッキング操作が行われる(Yamada

et

アレルギーに関する実験を行う場合にはブロッキンしカ瓦し、

a1.， 1989b， 1991a)。

グ剤として使用する乳タンパク自身がアレルゲンとして検出される可能性があアレルゲン性の低い魚ゼラチンをブロッキング剤として用いることがるので、

本実験においても魚ゼラある(Fritsche and Bonzon， 1990; Yamada

et

a1.， 1996)。

チンをブロッキング剤あるいは抗体および、サンプルの希釈液として使用した。

アビジンービオチン法は通常のELISA法よりバックグランドレベルが高くなるバックグランドレベルをさげるために洗浄回数の増加や反応温度傾向にあり、

戸、J ハU 1i

ロ

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(-shュ)回。判定bgω回。ω司丘

E

よ

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24 22

20 18

16 12 14

10 Time

Fig.2・6. Time Courses of Total and Soybean-specific IgA Contents in Human

Saliva. Saliva were col1ected from a donor for successive ³ days. Open and closed

symbols are the result of total and soybean-specific IgA. Circles are the results of the

first， triangles are the second， and squares are the third day， respectively.

(22)

の検討が必要である。 OVAで免疫したラットおよび免疫していないラット血清中の総IgEおよびOVA特異的IgEを測定した結果、反応温度370Cでは免疫していないラット血清中にも高濃度のOVA特異的IgEが検出され、免疫による抗原特異的IgEの発現量の違いは認められなかった。反応温度を下げた場合、免疫していないラット血清中のOVA特異的IgEシグ、ナルは免疫したラットのシグ

ナルより速やかに減少し、反応温度が40Cの場合ではOVA特異的IgEの発現量に明らかな差が認められた。反応温度による測定結果の違いを明らかにするために、抗体の精製に利用されているハイドロキシアパタイトカラム分画(Juarez

Salinas et aJ.，

1986; Langone， 1982)を行って検討した。反応温度が370Cの場合、

免疫していないラット血清中には二つのOVA特異的IgEピークが検出されたのに対し、免疫したラット血清中には三つのOVA特異的IgEピークが検出された。

反応温度が40Cの場合、免疫していないラット血清中のOVA特異的IgEピークは消滅し、免疫したラット血清中のOVA特異的IgEピークは三番目のピークのみが消滅したが、他のピークのシグナル強度の減少などは認められなかった。

これらの結果は、アビジンービオチン法の非特異的シグナルを低減させるためには反応温度を下げることが有効であることを示している。 Masonand Williams (1980)は抗原抗体複合体の解離定数は抗体、 pHおよび温度に依存して結合定数よりも変化することを報告している。本研究で認められた低温での非特異的シグナル減少の原因は、抗体の非特異的結合の減少、あるいは非特異的に結合した抗原抗体複合体の解離促進などが考えられる。

免疫したラット血清中のOVA特異的IgEには複数のピークが検出されたが、

このピークの違いを解析するためには高濃度のIgEを合んだ血清が必要であった。そこで、血清IgEの抗体価が高く、以前に大豆アレルギーと診断されたヒ

トの血清についてもハイドロキシアパタイトカラム分画を行った。その結果、

総IgEおよび抗原特異的IgEにおいて複数のピークが認められること、抗原の種類によってピークの位置が異なることが明らかとなった。それぞれの抗原特異的IgEのピーク画分をプロテインAでさらに精製してSDS-PAGEおよびイム

ノプロッティングを行った結果、 SDS-PAGEでは分子量約74 kDaの濃いバンド

(23)

および分子量約85 kDaの薄いバンドが検出された。分子量およびイムノプロッティングの結果から74

kDaの濃いバンドが19E重鎖であると推察され、 85 kDa

のバンド、についてはさらなる検討が必要であると考えられる。また、それぞれ

のピーク画分の19E重鎖の分子量が同じであったことから、ハイドロキシアパタイトカラム分固による溶出ピークの違いは19E重鎖の分子量の違いによるものではないことが明らかとなった。

Juarez-Salinas _{et al.} (1986)はハイドロキシアパタイトカラム分画により軽鎖の分子量が異なる19Gアイソタイプが分画可能であることを示しているが、今回の実験からは軽鎖の分子量に明らかな違いは認められなかった。 Lyczak etaJ.

(1996)はヒトにはC末端付近の違いにより四つの19Eアイソタイプが存在し、

マウスミエローマ細胞株を用いてこれらのアイソタイプを発現させて解析し、

一つのアイソタイプが75 kDaの重鎖を持つことを示している。この結果は本実験の19E重鎖の分子量とほぼ一致している。また、 Batista

_{et al.}

(1995)はIgE重鎖に結合している糖鎖に違いがあることを報告している。糖鎖や機能の違いを合めてヒト19Bの多様性についてはさらに検討する必要があると思われる。

分泌液中の19Aの発現に関する情報を得るため、唾液中の総19Aおよび食物アレルゲン特異的19A定量法を確立し、 5人のドナーについてその発現を調べた。

その結果、唾液IgAの発現量には個人差があること、アレルゲンの種類によって総19Aに対する割合が異なることが明らかとなった。唾液の分泌量は持続的な運動により減少すること(Mackinnon and Jenkins， 1993)、食品や意識の影響を受けて変化すること(Edgar， 1992; Tachiyashiki

_{et aJ.，}

1992a， 1992b)などが報告されているo ここで認められた唾液19Aの発現量の違いが、唾液分泌量の変動に基づいている可能性が考えられたので、一人のドナーの唾液19A発現の経時的変化を3日間にわたって調べた。その結果、唾液IgAの発現量はある程度変動することが明らかとなったが、発現量にサンプル採取時刻依存性は認められなかった。これらの結果より、唾液19Aの発現量には個人差があることが明らかとなり、さらに多くの症例について検討することにより唾液19Aを利用したアレルギー簡易診断法の開発やアレルギ一発症機構の解明のための基礎情報が得

19

(24)

られる可能性が示された。

(25)

第3章アレルゲン特異的抗体発現のクラスおよびサブクラス依存性

第1節緒日

食物アレルギーは小児だけでなく成人にも深刻な問題となっている。食物アレルギーは免疫機能の過剰反応によって引き起こされるが、免疫機能に関与している抗体には19A、 IgD、 IgE、 IgG、 IgMの五種類がある。アレルギ一反応は Coombs and Gell (1968)によって四つのタイプに分類されているが、そのうち IgEはI型アレルギーの原因抗体であり、

食

物アレルギーや環境アレルギーはI

型アレルギーによるものが多い。 I型アレルギーはマスト細胞や好塩基球表面に結合したアレルゲン特異的IgEがアレルゲンにより架橋され、ヒスタミンやロイコトリエンなどのケミカルメデイエーターが放出されることにより誘導される(Metcalfe， 1991)。血清中のIgE濃度は、健常人では非常に低いが、アレルギー患者においてしばしば高濃度で検出される(Bjorks ten

_et

a1.， 1983)。

19Aは血清中だけでなく、分泌型19A (sIgA)は腸管粘膜の分泌液や唾液、涙にも合まれており(Watanabe

_et

a1.， 1984)、腸管粘膜中の sIgAは腸管からのアレルゲンの吸収を抑制することによりアレルギ一反応を抑制する(Shorter and

Tomasi， 1982)0 19Aには二つのサブクラスが存在するが(Depelchin _et a1. ，

1994)、機能の違いやアレルギーとの関連についてはほとんど明らかにされていない。

IgGは血中に最も多量に合まれている抗体であり、アレルギーの減感作療法により誘導される抗体で I型アレルギーの原因抗体であるIgEと競合することによりアレルギー抑制的に働いたり(Aalbers e

_et

a1.， 1993)、終生免疫の獲得に関与している。 IgGには四つのサブクラスが存在しており、補体の活性化能やナチュラルキラー細胞の活性化能に若干の違いが認められるが(Janewa�ら1996)、機能の違いについては不明な点も多い。

IgMは初期免疫に関与し、抗原感作を受けると最初に産生される抗体である。

(26)

これらの抗体はアレルギーの発症および抑制に関与していると考えられるが、

これらの抗体の発現について総合的に解析した研究はほとんどないため、本研究では成人およびアレルギー患者血清中のアレルゲン特異的抗体のクラスおよびサブクラス依存性について検討した。

第2節材料と方法

第1項一般試薬

ß-ラクトグロプリン(βLG)はSigma社(St.lρuis，

MO)より、

卵粗製アルブ、ミン(Alb)はナカライテスク(京都，日本)より、スギ花粉抗原(Cedar)は三光純薬 (東京，日本)よりアラスタットアレルゲンスギ抗原試薬を購入し、分離ダイズ

タンパク質(ニューフジプ口氏Soy)は不二製油(大阪，日本)より提供された。

血清サンプルは九州大学食糧化学工学科の学生4人(年齢22 �27歳)および国立療養所南福岡病院小児科でアレルギーと診断された患者8人(年齢o � 15 歳)よりインフォームドコンセントを得てから採取した。血清は、真空採血管を用いて採血して室温で30分間放置し、 1，500x gで15分間遠心分離して調製し、

実験に用いるまで-200Cで保存した。

抗体は西洋ワサビベルオキシダーゼ(HRP)標識ウサギ抗ヒトIgAのF (ab')2 断片、 HRP標識ウサギ抗ヒトIgG (y-chain)のF (ab')2断片、 HRP標識ウサギ抗ヒトIgM(μ-chain)のF (ab')2断片、 HRP標識アビジンおよびヒト標準抗体を Dako社(Glostrup， Denmark)より購入した。また、 IgE 定量のためアフイニティー精製ビオチン標識ヤギ抗ヒトIgE (ε)をKPL社(Gaithersburg， MD)より購入した。サブクラス抗体の定量には、抗ヒトIgAl、 IgA 2、 IgG l、 IgG 2、

IgG3、 IgG4およびHRP 標識ロバ抗ヒツジ IgG (H+L)をBinding Site社 (Birmingham， England)より購入して用いた。

第2項 ELISA法による各クラス抗体の定量

E L ISA用として、 Immuno-plate Maxi sorp C96をNunc社(Roskilide，

(27)

Denmark)より購入した。 EL1SAプレート洗浄液はTween 20をナカライテスクより購入し、 0.05%Tween 20合有生理リン酸緩衝液 ( TPBS)を調製して使用し

た。魚ゼラチンはSigma社より購入し、 TPBSで2%になるように希釈し、ブロッキング溶液、 HRP標識抗体、サンプルおよび標準抗体希釈液として使用した。

発色基質溶液は、 0.006%

H202合有0.2 M クエン酸緩衝液 (pH 4.0)、超純水および6mg/ml 2， 2'_アジノービス(3-エチルベンゾチアゾリン-6- スルホン酸) ジアンモ

ニウム塩(ABTS)溶液を10:

9: 1で混合して用い、反応停止液には1.59るシュウ酸溶液を用いた。また、吸光度の測定には東ソ一社製(東京，日本) のマイクロプ

レート分光光度計、 MRP-A4iを使用した。

血清19E の定量においては、血清中の19E濃度が低いので検出感度を上げるためにアビジンービオチン法を用いた。抗原特異的抗体定量のための抗原溶液と

して、ß-L Gおよび A1bは50mM炭酸緩衝液で50μg/mlとなるように調製した。

Soyは50mM炭酸緩衝液で1mg/mlとなるように懸濁し、 12，500

x

gで20分間遠心分離した上清を使用した。スギ抗原は50mM炭酸緩衝液で106倍に希釈して用いた。これらの抗原溶液を150μlずつ96 well EL1SAプレートに添加し、

370Cで1時間保温した。ブロッキング溶液を300μiずつ添加して 40Cで一晩ブロッキング、した後、ブロッキング溶液で希釈した血清または標準抗体を50μ1ずつ添加し、 40Cで1時間反応させた。つぎ、に、ブロッキング溶液で1，000倍に希釈したビオチン標識抗ヒト19Eを1∞μlずつ添加して40Cで1時間反応させた。

ブロッキング溶液で5，000倍に希釈したHRP標識アビジンを100μlずつ添加して 40C に30分間保持した後、発色基質溶液を100μlずつ添加し、 370Cで15分

間反応させた。最後に、 1.59るシュウ酸溶液を100μ1 添加して反応を停止させ、

マイクロプレート分光光度計で 415 nm の吸光度を測定した。各反応過程の問は TPBSでプレートを3回ずつ洗浄し、サンプル添加以後の洗浄は 4回ずつ行った。

19A、 IgGおよび19M の定量は通常のEL1SA法で行った。サンプルおよび標準抗体を添加後、ブロッキング溶液で1，000倍に希釈したHRP標識抗ヒト19A、

19Gおよび19Mを100μiずつ添加して1時間反応させた後に発色反応を行った。

各反応過程の反応温度はブロッキング以外は全て370Cで行い、洗浄はTPBSで

(28)

3回ずつ行った。

第3項 ELISA法による各サブクラス抗体の定量

抗原溶液を150μlずつ96 well ELISA プレートに添加し、370Cで1時間保温した。ブロッキング溶液を300μlずつ添加して40Cで一晩ブロッキングした後、

ブロッキング溶液で希釈した血清を 50μlずつ添加し、40Cで1時間反応させた。

つぎ、に、ブロッキング溶液で10，∞0倍に希釈した抗ヒトサブクラス抗体を100 μlずつ添加して40Cで1時間反応させた。さらに、ブロッキング溶液で2，000倍に希釈したHRP標識抗ヒツジIgG を100μ!ずつ添加して40Cで1時間反応後、

発色基質溶液を100μlずつ添加して370Cで15分間反応させた。 1.5%シュウ酸溶液を100μl添加して反応を停止させ、マイクロプレート分光光度計で415nm の吸光度を測定した。各反応過程の聞はTPBSでプレートを3回ずつ洗浄し、

サンプル添加以後の洗浄は4回ずつ行った。サブクラスの抗体価は各被験者の IgGlおよびIgA1のA415値を1 としたときの相対値として表した。

第3節結果

第1項健常人におけるアレルゲン特異的抗体発現パターンの解析

本学科学生4人の血清中のアレルゲン特異的抗体量を ELISA により定量した結果をFig.3-1に示した。 MA STでアレルゲン特異的血清 IgEを測定した結果、

donor AおよびBではスギ花粉に対するIgEが検出されており、donor Cおよび Dではいずれのアレルゲンに対しでもIgEは検出されなかった。 Fig.3-1に示す

ように、ß-LG、Soy、Cedar特異的IgEは4人のドナー全てに検出され、Alb 特

異的IgEはdonor Cでは検出されず、donor A、Bで高い傾向が認められた。 IgA では、donor A およびCのAlb、 ß-LG、Cedarに対する抗体が高い傾向が認め

られ、donor CのSoy に対する抗体は検出されなかった。 IgG では、donor A 以外のドナーのAlbおよびß-LG に対する抗体が高い傾向が認められ、donor A は他のドナーに比べて抗体の発現量が低い傾向が認められた。 IgMでは、donor B

24

(29)

IgE(略Iml) IgA(nglml)

3 4 _ ⁵ _ ^-1 _ ⁰ _ ¹ _ ² _ ³ ⁴ ⁵ _ � ⁶

10 -

10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

-1 0 1 2 3 4 5 -1 0 1 2 3 4 5 6

10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

IgG(昭Iml) IgM (nglml)

Alb

Soy

ß-凶

Cedar

Soy

Cedar Alb

ß-lβ

EEω国司

Fig.3・1. Expression of Allergen-specific Antibodies in Sera of Healthy Adults. Sera were collected from 4 donors and applied to ELISA.

(口);

donor A，

(圏);

_{donor B，}

(図);

donor C，

(・);

_donor D.

3 3

2

(HEOM巴省S回。ωOω同ωkFZSω出

ß-LG

A1b

。

Cedar Soy

。

(何日間。凶同)恒国畠ロ。ωO回同ωkZ富山ω出

。 C D

B A D

Donor

B C A

。

Fig.3・2. Expression of Allergen-specific IgG Subclωses in Sera of Healthy Adults.

The data of IgG2， IgG3， and IgG4 are expressed as the relative value of the data of IgG 1.

(口);

IgGl，

(圏);

IgG2，

(図);

IgG3，

(・);

IgG4.

(30)

およびCのSoyに対する抗体が検出されなかった。

Fig.3- 2にIgGサブクラスの発現を検討した結果を示した。 AlbおよびβLG ではIgG 4の発現が、 SoyではIgGlの発現が優位で、あり、 CedarではIgG lと

IgG4が同程度に発現していることが明らかとなった。また、いずれのアレルゲ

ンにおいてもIgG2とIgG3の発現は同程度であった。

Fig.3-3に19Aサブクラスの発現を検討した結果を示した。 Albおよびß-LG ではIgAl とIgA2が同程度に発現し、 Cedarおよび SoyではIgAlの発現が優位である傾向が認められたが、 donorCのβLGに対する19A2の発現のみ低かった。

第2項アレルギー患者におけるアレルゲン特異的クラス抗体発現パター

ンの解析

アレルギー患者のうち、卵アレルギー患者patientA

'"'-' D

(年齢0'"'-'1歳)の血

2 s

J H

E 国

^盟 E

O

�

沼芯 E

ω

a

s 国

・

l

。 Alb

Soy

円円円

A B C

。-LG 2

1 3

⁽

^，4 ^司 ¹ ¹

o s g ^‘固' H Cedar

-4。・可

⁴ a

円円円円円 ¹ 壱凶 ^.5

q砂 ^，

D A B C D 。

Donor

Fig.3・3. Expression of Allergen-specific IgA Subclasses in Sera of Healthy Adults.

The data ôf IgA2 is expressed âs the ralative value ôf the data ôf IgAl. (口); 19A1， (圏);

19A2.

(31)

清中のアレルゲン特異的抗体量をELISAにより定量した結果をFig.3-4に示し

た。 PatientAおよびBは卵に対してのみ、 patientCおよびDは卵以外に牛乳および大豆に対してアレルギー症状を示す。 Fig.3-4に示すように、 patientAおよびBはAlbおよびß-LGに対するIgEを有しており、 patientCおよびDは4

種類のアレルゲン全てに対するIgEを有していた。 IgAにおいては、 Soyに対する抗体の発現がpatientAおよびBで認められず、 Cedarに対する抗体の発現が patient Bで認められなかった。 A1bおよびß-LG特異的I!Þ生はいずれのpatient においても発現していた。 IgGは、いずれのアレルゲンに対しでも高濃度で検出される傾向を示したが、 Soyに対する抗体がpatientBで検出されなかった。

IgMは、 patientDで発現が低い傾向を示し、 A1bに対する抗体は検出されなかった。アレルギー患者のうち、環境アレノレゲンに対してアレルギー症状を示す

patient E

，..____，

H

(年齢7，..____，

15歳)の血清中のアレルゲン特異的抗体量をELISAにより定量した結果をFig.3-5に示した。 MASTによりpatientEおよびFは環境アレルゲンに対するIgEが検出されており、 patientGおよびHは環境アレルゲ

ン以外に卵白および大豆に対するIgE が検出されている。 Fig.3-5に示すように、

アレルゲン特異的IgEの発現量は全体的に低い傾向を示し、 A1bに対するIgE は patient EおよびGに検出され、 ß-LGに対するIgEは全てのpatientで検出された。 IgAにおいては、 A1bに対する抗体はpatient全員に検出されており、 ß-LG およびSoyに対する抗体は2人のpatientにしか発現が認められず、 Cedarに対する抗体の発現がpatientEで認められなかった。 IgGはいずれのアレルゲンに対しでも高濃度で検出される傾向を示した。 IgM はアレルゲンの種類やpatient による発現量の違いは少ない傾向を示したが、 patientEの Soyに対する抗体は検出されなかった。

第3項アレルギー患者におけるアレルゲン特異的IgGのサブクラス依存性

Fig.3-6に卵アレルギー患者血清中のIgGサブクラスの発現を検討した結果を

示した。 A1bおよびβLGではIgGlの発現が最も強く、次いで、IgG3あるいは

(32)

IgE(nglmJ) IgA(ngl凶)

1 ，，，U ，(\ I ，(\2 ，(\3 . (\4 . (\ 5 -1 0 1 2 3 4 .5 6

10 10 - 10 -

10

-

10 10 � ¹⁰ J ¹⁰ - ， ¹⁰ ^v ¹⁰ ¹ ¹⁰ ^L. ¹⁰ ^� ¹⁰

^斗

¹⁰

^コ

¹⁰

⁰

A1b

βLG

Soy

Cedar

S Meg- -d司

-・・・・・圃・・・・・圃・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・...

“““““““““““““““L 4

A1b

ß-LG

Soy

zwifØfi?p/A?Jþiß/?(1'j7A'

ー ¹ • (\ ⁰ • (\ ¹ _ _ ² ³ _ ⁴ ⁵ ^- ^-1 ⁰ ¹ ² ³ ⁴ ^弓 ^民

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10 10 � 10 --'

10 喝 IO J

lO u

IgG(ngl凶) IgM(ngl凶)

Cedar

Fig.3・4. Expression of Allergen-specific Antibodies in Sera of Egg Allergy Patients.

Sera were collected from ⁴ egg allergy patients and applied to ELISA.

(口)�

patient A，

(函)�

patient B， (図)� patient C， (・)� patient ^D.

IgE(nglmJ) IgA(ngl凶)

ー ¹ _ ⁰ _ ¹ ² _ ³ _ ⁴ ⁵ ^-1 ⁰ ¹ _ ² _ ³ _ ⁴ ⁵ ⁶

10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

』-・E・-・E・-圃圃圃園田・圃圃E・E・圃

“““““““““““““““““負““““““ι.

「一一一一一一一一一一一一一一一

A1b

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件LG

Soy

A1b

Soy

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10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

IgG(ngl凶) IgM(ngl凶)

Cedar

Fig.3・5. Expression of Allergen-specific Antibodies in Sera of Allergy Patients

Sensitive to Environmental Allergens. Sera were collected from ⁴ allergy patients

sensitige to environmenta1 allergens and applied to ELISA.

(口)�

patient E， (圏); patient

F，

(図);

patient ^G，

(・);

patient ^H.

(33)

IgG4の発現が強い傾向が認められた。しかし、 patients Aにおいては他の

patientに比べてβLGに対するIgG4の発現が強かった。 SoyおよびCedarでは IgGlの発現がかなり優位であることが明らかとなった。

Fig.3-7に環境アレルギー患者血清中のIgGサブクラスの発現を検討した結果を示した。 AlbではIgGlおよびIgG4の発現が同程度、もしくはIgG4の発現が強い傾向が認められ、 IgG3の発現も比較的IgGlの発現量と近い傾向が認められた。 ß-LGではpatientにより発現パターンが異なっていたがIgG4の発現が強い傾向が認められた。しかし、 patientEにおいては他のpatientに比べてβLGに対するIgG4の発現が弱かった。 SoyではIgGlの発現が優位である傾向が認められたが、 patientFにおいてはIgG3の発現が、 patientHにおいてはIgG4の発現

が強かった。

CedarではIgGl およびIgG4の発現が優位で、ある傾向が認められた。

第4項アレルギー患者におけるアレルゲン特異的IgAのサブクラス依存性

Fig.3-8に卵アレルギー患者血清中のIgAサブクラスの発現を検討した結果を示した。卵アレルギー患者においては、いずれのアレルゲンにおいても恥位の発現はIgAlの半分以下であり、 IgA1の発現がかなり優位であることが明らかとなった。また、 IgA2の発現の割合はpatientおよびアレルゲンの種類により若干異なっていた。

Fig.3-9に環境アレルギー患者血清中の19Aサブクラスの発現を検討した結果を示した。環境アレルギー患者においては、 Albに対するIgA1 および19Azの発現が同程度であったが、他のアレルゲンでは19A1の発現が優位で、あった。特に、

SoyおよびCedarに対するIgA2の発現の割合が低い傾向が認められた。

第4節考察

健常人およびアレルギー患者について血清中のアレルゲン特異的抗体量を測定した。その結果、アレルギー症状が認められないdonorAおよびBにおいて、

(34)

2 書

H

a s gω ^o

。

凶

E τ T ω ^a 4 a

Z 3 ，

I

。

Alb

Soy

n n n n

A B C D

ß-LG

Cedar

n n n n

A " B C

Patient

D 2

1 8

。同⁾^例

a 1 1 a

0 S

ロ

5 。oll

l

ta

^-

^g ^ω ^ee ^b

。

Fig.3・6. Expression of Allergen-specific IgG Subclasses in Sera of Egg Allergy

Patienú句・

The data of IgG2， IgG3， and IgG4 are expressed as the relative value of the data of IgG 1.

(ロ); IgGl， (圏); IgG

2， (図); IgG3， (・);

IgG4.

4 3

( 官o

同H ) se

2 a

制

a

回。

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。

個凶^圃

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。

Alb

Soy

四

E F G

ß-LG

Cedar

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H 4 3

2 ;円

o

同^H⁾

e l町la 、

o

o a

世

g

回^u

3 。

。n同

。

Fig.3・7. Expression of Allergen-specific IgG Subclasses in Sera of Allergy Patients Sensitive to Environmental Allergens. The data of IgG2， IgG3， and IgG4 are expressed as the relative value of the data of IgG 1.

(口); IgGl， (圏); IgG

2，

(図); IgG3， (・); IgG4.

アレルギー関連因子の評価法の開発とその利用に関 する研究

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository