代謝制御によるポリ－γ－グルタミン酸生産の最適化1

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代謝制御によるポリ－γ－グルタミン酸生産の最適化

廣藤祐史^＊1

Optimization of the poly-gamma-glutamic acid production by metabolic pathway control

Yushi Hirofuji

液体培地におけるポリ－γ－グルタミン酸（

PGA

）の生産が非常に不安定である納豆菌を対象として，培養条件 によって代謝を制御し，

PGA

の生産安定性を向上させることを試みた。養分の枯渇と再投与，温度変動などのス トレスを与えることで

PGA

の収量が大幅に向上することを見出し，この現象は

PGA

分解酵素群の抑制によっても たらされていることが，γ－グルタミルトランスペプチダーゼ活性の変化から示唆された。

１ はじめに

ポリ－γ－グルタミン酸（以下

PGA

と略記する）

は

1937

年に

Bacillus anthracis

の菌体表面を覆う夾膜の 構成成分として発見された 。その後，^１）

PGA

は納豆菌

Bacillus Bacillus

を含むある種の 属細菌とその近縁種（

， ， ）

subtilis Bacillus licheniformis Bacillus megaterium

など によって生産されることが数多く報告されてきた 。^２）

これらの

PGA

の多くは数十万から

200

万程度の分子 量を有するのに対して，本研究が対象とした納豆菌は

－グルタミン酸と －グルタミン酸からなる，分

D L

。 子量が

300

万を超える極めて巨大な

PGA

を生産する

， ， ， ，

PGA

は化粧品 医薬品 食品の他に 水質浄化剤

， ，

コンクリートのひび割れ防止剤 砂漠緑化用保水材料 結露防止剤など幅広い用途が提案されており，近年注 目を集めている 。これらの用途の多くにおいて，分^２）

子量が大きいことは機能性の強化に繋がるうえに，納 豆菌由来の

PGA

は食経験に裏打ちされた安全性の点 でも，他菌種が生産する

PGA

よりも優れている。し かし，納豆菌を用いた液体大量培養による

PGA

生産 は，他菌種を用いた

PGA

生産と比較して極めて不安

， 。

定であり 実用的な生産方法が確立されていなかった は と呼ばれる膜結合酵素系によって

PGA PgsBCA

生 産 さ れ て お り ，

PgsBCA

を コ ー ド す る 遺 伝 子 は で ある。 は フ ェロモンによる

pgsBCA pgsBCA ComP

の制御下にあり，対数増殖期の終期か

Quorum Sensing

ら定常期の初期に発現することが報告されている 。^３）

の直下には －グルタミン酸と －グルタミ

pgsBCA D L

ン酸の結合を切断して分子量１０万から５０万に断片 化する γ－ＰＧＡ分解酵素

YwtD

を コードする遺伝

子，

ywtD

が 存在することが報告 されて おり ，^{４ ）}

PGA

の生産安定性は様々な

PGA

分解酵素群が生成するこ とによって損なわれているものと考えられる。これに 対処することを目的として，

ywtD

とγ－グルタミル トランスペプチダーゼ（

GGT

）の生産に係わる遺伝子 を破壊し， 高生産株を得る方法が特許として

ggt PGA

公開されている 。また，^５）

YwtD

以外の分解酵素に着 目し，

PGA

を分子量１０万に断片化する酵素ポリグ ル タミン酸ハイドラーゼ（

PghA

） の生産に係わる遺 伝子

pghA

と

ggt

を同様に破壊して

PGA

高生産株を得 る方法も特許として公開されている 。本研究は納豆^６）

菌内部の代謝を制御する培養条件を見出すことによっ て

PGA

分解酵素群の発現を抑制し，遺伝子破壊等に よらず，納豆菌を用いた高分子量

PGA

の安定生産手 法を確立することを目的として検討を行った。

２ 研究，実験方法 ２－１ 使用菌株

Bacillus subtilis

本研究が検討の対象とした納豆菌は

に分類され，

PGA

の生産に培地中のグルタミン酸と ビオチンを要求することを特徴とする食用発酵細菌で ある 。納豆製造業者の間では，納豆菌は遺伝的に不^７）

安定であり，継代培養によって粘質物生産能を容易に 喪失することが古くから知られている 。このため，^３）

一部の大手業者を除き，国内における納豆生産には種 菌業者（成瀬発酵化学研究所，高橋祐蔵研究所，宮城 野納豆菌製造所など）が供給する種菌が使用されてい る。本テーマでは，市販納豆から分離した保存菌株の 胞子を使用し，

10

⁶

cfu ml /

と なるように，

PGA

生産培 地に接種した。

福 岡 県 工 業技 術 セン ター 研 究 報 告 No.14(2004)

＊１ 生物食品研究所

- 47 - ２－２ 培養装置

丸 菱 バ イ オ エ ン ジ

MDL300

型 （ 槽 容 積

3l

） 及 び

（ ） 。

MSJ-U2-50L

型 槽容積

50 l

ファーメンターを用いた

２－３ 培地組成

生産培地組成を表－１に示した。メイラード

PGA

A B

反応による培地の褐変を防止するため， 培地と 培地を別々に加圧蒸気滅菌（

121

℃，

20

分間）したも のを無菌的に混和して生産培地とした。納豆菌による の生産は，炭素源を原料として 回路のα－

PGA TCA

ケトグルタル酸から生成したグルタミン酸が使われ，

培地中のグルタミン酸は

PGA

の生成に直接は関与し ないものの，

PGA

の合成を大幅に促進することが報 告されている 。本研究が採用した培地組成も，同様^８）

の理由で

PGA

の生産原料であるグルコースと

PGA

の 生産を促進するグルタミン酸を含む構成とした。

表－１ 培地

1l

当たりの組成 培地（ ）

A 900ml

グルタミン酸ナトリウム１水和物

20.0

g リン酸２水素カリウム

2.5 g

リン酸水素２ナトリウム１２水和物

1.7

g

塩化ナトリウム

0.5

g

培地（ ）

B 100ml

グルコース

20.0

g

硫酸マグネシウム７水和物

0.5

g

ビオチン

0.1

mg

２－４ 培地粘度の測定

培地中の

PGA

蓄積量の指標として培地の見掛け粘

。 （ ， ）

度を測定した 粘度は

B

型粘度計 東京計器

BL

型

30 No.2

によって測定し 測定回転数は，

rpm

に固定して ローターを使用した。

No.2

ローターの測定限界を超

。 える粘度の培養液については

No.3

ローターを用いた

２－５ 培養に伴う培地組成の時間変化の検討

型ファーメンターを用いて，培養温度

MSJ-U2-50L

℃におけるグルコースとグルタミン酸ナトリウム

37

の濃度変化を検討した。グルコース濃度はグルコース

Ⅱ－テストワコー，グルタミン酸濃度はヤマサ －

C L

グルタミン酸測定キットを用いて測定した。攪拌翼に は２段６枚羽根ディスクタービンを採用し，培養液量

35 l

，攪拌回転数

110 rpm

，通気速度

30 l/min

の条件で

80

（ ）。

時間に渡って培養を行った

pH

制御は行っていない

２－６ 流加培養の検討

型ファーメンターを使用して，流加培

MSJ-U2-50L

養が

PGA

生産に与える影響を検討した。培養の進行 に伴って消費されるグルコースを補給するために

29

時間経過時点で濃度

2.0

％相当量のグルコースを流加 した。攪拌翼には２段６枚羽根ディスクタービンを採

用し，培養液量

35 l

，培養温度は

37

℃，攪拌回転数

120 rpm

，通気速度

30 / l min

の条件で培養を行った（

pH

制御は行っていない 。）

また，炭素源が

PGA

生産に与える影響を検討する ため，同様の培養条件においてグルコースが完全に枯

（ ）

渇し

pH

が上昇した状態

65

時間

30

分及び

137

時間 で，

2.0

％相当のグルコースを流加した。

２－７ 納豆菌の至適培養条件の検討

属細菌による の生産は ℃で行われ

Bacillus PGA 37

るのが通例であるが，市販納豆の製造は

40

℃前後の 高温で行われる。納豆菌の至適培養条件を定めること は培養効率を向上させるために重要であるため，納豆 菌の至適生育温度を検討した。至適生育温度の検討は 型ファーメンターによって行い，攪拌翼には

MDL300

２ 段６ 枚羽 根 ディス ク ター ビン を使 用し て培養 液量

， ， ，

2 l

攪拌回転数

120 rpm

通気速度

2 / l min

の培養条件で

， ， ， ℃の培養温度において，培養開始か

35 40 45 50

ら

pH

が低下を始めるまでの経過時間を調べた。

２－８ ストレスの組み合わせがPGA生産に与える影響

納豆菌の至適培養条件を検討したところ，生育至適 温度と

PGA

生産至適温度が相違していたことから，

の生産が開始される対数増殖期後期から定常期

PGA

初期までは至適生育温度である

45

℃で培養し，その 後培養温度を

37

℃に変更することによって，

PGA

分 解酵素群の生成を抑制することを試みた。また，合わ せてグルコース流加と

pH

制御を行い，

PGA

生産量と 生産速度の改善を試みた。培養は

MSJ-U2-50L

型ファ ーメンターで行い，攪拌翼はフルゾーン翼を使用して 培養液量

35 l

，攪拌速度

80 rpm

，通気速度

30 / l min

の条 件で行った。

pH

制御はアルカリの流加のみで行い，

1 N

水溶液により に制御した。

NaOH pH=6.9

２－９ ストレスが分解酵素活性に与える影響の検討

炭素源の枯渇と再投与や温度変動などの外的ストレ スが，実際に

PGA

分解酵素の活性に影響を与えてい るかを確認するため，酵素活性を測定した。納豆菌が 有する

PGA

分解酵素としては

YwtD

，

PghA

と

GGT

の ３種が報告されている。

YwtD

と

PghA

は膜結合型酵 素であり，単離・精製に成功した例がなく，測定が困 難である。

GGT

は培地中に分泌される酵素であり測 定が容易であるため，培地中の

GGT

活性で分解酵素 活性の変化を検討した。

GGT

活性はγ－グルタミル

－

p

－ニトロアニリド基質法によって測定した 。^９）

福 岡 県 工 業技 術 セン ター 研 究 報 告 No.14(2004)

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福 岡 県 工 業技 術 セン ター 研 究 報 告 No.14(2004)

３ 結果と考察

３－１ 培養に伴う培地組成の時間変化

図－ １に 培 養の進 行 に伴 うグ ルコ ース の濃度 変化 を，図－２にグルタミン酸ナトリウムの濃度変化を示 した。グルコース濃度は対数増殖期後期にあたる

12

時間経過時点から低下を始め，約

70

時間で全量が消 費された。グルタミン酸ナトリウムは対数増殖期後期 に急減するものの，以後消費されず一定の濃度を保っ た。グルコースが枯渇するとグルタミン酸の消費が開 始され，

pH

の上昇を伴いながら濃度が低下した。

図－１ 培養の進行に伴うグルコース濃度の変化

図－２ 培養の進行に伴うグルタミン酸濃度の変化 これらの結果は，

Bacillus subtilis IFO3555

は炭素源 の存在下ではグルタミン酸を消費しないが，グルタミ ン酸の存在が

PGA

の生産量を著しく増強するという

Kunioka

の 報 告 と 一 致 す る^{８ ）}。

Kunioka

は ま た ，

PGA

が培地中のグルタミン酸からではなく，炭素源から菌 体内で合成されたグルタミン酸を原料として合成され ることを報告しており，納豆菌についても同様の機序 で

PGA

の生産が行われていることが推察される。な

mPa s

お，80時間経過時点の培養液の見掛け粘度は

80 ･

であった。

３－２ 流加培養がPGAの生産に与える影響

グルコース濃度を維持することを目的として流加培 養を行った場合の経過を図－３に示した。

29

時間経 過した時点でグルコースを流加した場合，

70

時間経 過後の見掛け粘度は

60mPa s ･

であった。

これに対して，一旦グルコースを枯渇させた後にグ

0 5 10 15 20 25

0 20 40 60 80 100

time[h]

Glucose[g/l]

0 5 10 15 20 25

0 20 40 60 80 100

time[h]

Na-Glutamate[g/l]

図－３ グルコース流加培養の経過（その１）

ルコースを流加した場合の経過を図－４に示した。１ 回目の流加を行った時点で培養液粘度は

10mPa s ･

で

215 190

あったが，２回目の流加直前の粘度は

mPa s ･

， 時間経過後の粘度は

1,810mPa s ･

に達した。この結果 は，

PGA

蓄積を阻害していた

PGA

分解経路がグルコ ースの枯渇によってさらに強く発現し，グルコースの 流 加に よっ て 逆に強 く 抑制 され たた め， 結果と して 合成経路が優勢となり，高濃度の 蓄積をも

PGA PGA

たらしたことを示唆するものと考えられる。

図－４ グルコース流加培養の経過（その２）

３－３ 納豆菌の至適培養条件

培養温度が

pH

の低下開始時間に与える影響を図－

５に示した。

の低下開始時間は培養初期の菌体増殖速度を反

pH

図－５ 納豆菌の至適生育温度

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

30 35 40 45 50 55 60

培養温度[℃]

pH低下開始時間[h]

流加

流加 流加

DO

ORP

Air

Temp

Agit

pH

DO

ORP

pH

Agit Temp

Air

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福 岡 県 工 業技 術 セン ター 研 究 報 告 No.14(2004)

映する。納豆菌の至適増殖温度は，今まで採用してき

37 45 37 45

た ℃ではなく ℃であった。しかし， ℃と

℃で

PGA

の生産を試みた結果，

45

℃では菌体の増殖

， 。

は良好であるものの

PGA

が全く蓄積されなかった これらの結果は，

45

℃では

PGA

分解酵素系の発現 が増強されるため，

PGA

が蓄積されないことを示唆 しており，３－２項の結果と合わせて考えれば，適切 な段階で培養温度を

45

℃から

37

℃に切り替えること によって

PGA

分解酵素系の発現を抑制し，

PGA

の生 産効率を高めることを期待できる。

３－４ ストレスの組み合わせがPGA生産に与える影響

培養温度の切り替えとグルコースの流加を組み合わ せて行った場合の培養経過を図－６に示した。

図－６ 複合ストレスが

PGA

生産に与える影響

温度は溶存酸素濃度（

DO

）が飽和濃度の７割程度 となる培養開始から７時間が経過したときに，

45

℃

37 pH

から ℃に切り替えた。グルコースは枯渇に伴う の上昇を指標として

37

時間が経過したときに流加し た。培養液粘度は

27

時間で

610 mPa s ･

，

37

時間で と急 速に増加し，グル コース流加後も順

1,820mPa s ･

44 2,420 50 3,200

調に増加して 時間で

mPa s ･

， 時間で に達した。３－３項で推察したとおり，温度の

mPa s ･

変動もグルコースの枯渇と再投与と同様に

PGA

生産 の安定化に極めて有効であることが確認された。

３－５ ストレスがPGA分解酵素の活性に与える影響

培養条件が培地中の

GGT

活性に与える影響を表－

２から表－４に示した。表－２に明らかなように，グ ルコースを流加することによって

GGT

活性は有意に 低下した。しかし，培養温度の変更は

GGT

活性を増 強する効果を示した（表－３ 。培養温度の変更とグ） ルコースの流加を合わせて行った場合も

GGT

活性は 全体的に高い値を示したが グルコースの流加は，

GGT

流加

DO

Agit ORP

Air

Temp

活性を有意に低下させた。

YwtD

と

PghA

活性を評価 していないため，

PGA

分解酵素群の抑制の裏付けと しては不完全ではあるが，培養条件によって

PGA

分 解酵素の生産が抑制されていることが示唆された。

表－２

GGT

活性の変化

（

37

℃

, 52:05:

グルコース流加

, 101:00

終了

, 120mPa s

･）

7:30 11:15 24:00 52:00 56:30 59:30 72:30 101:00

時間[h:m]

GGT

[IU l

/

]

0.0 0.2 2.3 2.4 1.8 1.4 4.5 5.5

表－３

GGT

活性の変化

（

45

℃→

37

℃(７

:00 , 24:00

) 終了

, 450mPa s

･）

7:30 11:15 24:00

時間[h:m]

GGT

[IU l

/

]

0.0 0.4 11.9

表－４

GGT

活性の変化

(

45

℃→

37

℃(

7:00 ,34:40:

) グルコース流加

,53:00

終了。

1,200

mPa s･)

6:50 8:30 11:30 34:30 38:00 41:30 53:00

時間[h:m]

GGT

[IU l

/

]

0.0 1.2 3.3 12.2 10.8 8.7 12.8

４ まとめ

納豆菌による

PGA

生産の安定性を向上させること を目的として 代謝を培養条件によって制御して，

PGA

分 解 酵 素 群 の 生 成 を 抑 制す る 方 法 を検 討 し た。

PGA

の原料となるグルコースをいったん枯渇させてから再 度流加することにより，

PGA

分解酵素群の生成を抑 制して

PGA

の収量を大幅に向上させられることが明 らかとなった。また，培養温度を生育至適温度から生 産至適温度へ変動させることによっても同様の効果が 得られることが明らかとなった。両者を組み合わせる ことによって生産効率を大幅に改善することが可能で あり，これらのストレスは

PGA

分解酵素群の発現を

。 抑制していることが

GGT

活性の変化から示唆された

５ 参考文献

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pH