博 士 （ 医 学 ） 川 村 直 之

博 士 （ 医 学 ） 川 村 直 之

学 ′ 位 論 文 題 名

HTLv‑Henv 蛋 白 の 作 成 と そ れ に よ る 感 染 抑 制 効 果

学 位 論 文 内 容 の 要 旨

  HumanTcell lymphtropic virus typeII（HTLV―II） はHTLV−Iと 塩 基 配 列上 高い 相同 性 を有 し， 坑原 性も 交又 する 。HTLV―IがATL，HAMな どと の病 因的 関連 性が 明 かに され ているの に 対 し ，HTLV―IIはHAM様 疾 患 やLGL leukemiaな ど と の 関 連 性 が 報 告 さ れ て い る も の の ， 病 因 的 関 与 及 び 感 染 病 理 は 未 だ 十 分 に 解 明 さ れ て い な い 。 本 研 究 で は 中 和 活性 を担 う坑 体 を 同 定 す る こ と を 目 的 と し ， 今 回 新 に 開 発 し た バ キ ュ ロ ウ イ ル ス に よ るHTLV―IIenv蛋 白 gp63発 現 系 を 用 い て 家 兎 の 能 動 免 疫 を 行 い ，HTLV−II感 染 防 御 効 果 に っ き 検 討 し た 。 材料と方法

1． 細胞HTLV−II感 染細 胞と してHTLV−II持続 感染 者よ り樹 立さ れたHTLV―IIト ラン スフォー ム 細 胞 株Vines及 びhairy cell leukemia患 者 よ り 樹 立 さ れ た 腫 瘍 細 胞 株 で90％ 以上 の細 胞 に ウ イ ル ス 産 生 が 見 ら れ る こ と が 知 ら れ て い るMo―Tを用 いた 。合 胞体 形成 効果 の検 出に は HTLV→II産 生 細 胞 と 合 胞 体 を 形 成 す る こ と が 知 ら れ て い るB細 胞 株BJABを 用 い た 。 Z． Sf一9Insect Cellによ るenv蛋白の発現env領域全域（5，180〜6．643）の1．464bpをPCRに て ´ ヾ キ ュ ロ ウ イ ル ′ス のtransform vector pVL1392のBamHIsiteに 挿入 し，Sf−9cellに コ トランスフェクションし，env発現Sfー9cellを得た 。

3． Recoibinant gp63に よ る 家 兎 の 免 疫 と 実 験 的HTLV―II感 染家 兎 ゛（New Zealand White 2． 5Kg）4羽（Ra―1，Raー2，Ra−3，Ra−4）を用いた。recombinant gp63による家兎の免疫は，2 羽の 家兎 （Ra−3，Ra―4）にっきそれぞれ上記gp63発現Sf−9cell 5xl06個をPBS Imlに懸濁した も の とFreund  adj uvant  Imlの 混合 液 を週1回 の割 合で4回筋 注に より 行っ た。HTLV―II感 染は 上記 免疫 家兎2羽に 加え ，対 照群 とし て非 免疫 家兎2羽（Ra−1，Ra−Z）の 計4羽 にっき，

そ れ ぞ れHTLV−II感 染 細 胞 株Vines細 胞1．Ox107個 の 耳 静 脈 投 与1回 に よ り 行い ，継 時的 に 採血してFicoll Conray法によルリンパ球と血清を分離・採取した。

4． PCR法に よるHTLV−IIゲ ノム の増 幅HTLV−Il遺 伝子 中， 保存 性の 高いenv領 域内 の631bpを 増幅 する 目的 で， プラ イマ 一対El（6031〜6051），E2（6641〜6661）を用いた。さらにNested PCRを 用 い たEl/E2領 域 内411bpの 増 幅 を 行 う 目 的 でEl/E2の内 側に プ ライ マ― 対EN1（6099〜 6118） ，EN2（6490〜6509） を 作 成 し ， 35サ イ ク ル の 増 幅 を そ れ ぞ れ 行 っ た 。 5． 特 異 的 増 幅 産 物 の 検 出PCR増 幅 産 物 を1％ ア ガ ロ ー ス ゲ ル に て 電 気 泳 動 後 ， ナ イ ロ ン 膜 に転写しSouthern blot法により検出を行った。

6． 1ITLVーII特 異 的 坑 体 の 検 出 家 兎 血 清 中 の 特 異 的 坑 体 は ， 以 下 の3方 法 で 検 出 し た 。 1． Particle Agglutination（PA） 法HTLV−IIとHTLV→Iが 坑原 的に 交又 す るこ とか ら，セ口     デ イ アHTLV−Iキ ッ ト （FUJIREBIO INC） を も ち い てPA法 で 坑 体 価 の 測 定 を 行 っ た 。 2． Western blot法プ ロブ ロッ トHTLV―I（HTLV−I特異坑体検出キット：FU川REBIO INC）を用     いて各HTLV―II蛋白に対する特異坑体を検出し た。

3． HTLV―IIrecombinant gp46蛋 白 を 用 い たWestern blot法HTLV−II env gp46（5，180〜     6，103） をpGEX一2Tベ クタ ―に 挿入 大腸 菌JM109で 大量 培養 後GSTーgp46を 回収 し，SDSー     PAGEよ ル ニ ト ロ セル 口宀 ス膜 に転 写 後抗gp46抗体 検出 のス トリ ップ 膜と して 作成 した 。

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結果と考察

1． Sf−9Insect cellにおけ るrecoibinant gp63蛋白の 発現HTLV−II env発現Sf−9cell を ニト口セ ルロ―ス 膜に転写後 ヒトHTLVーIIキ ャリア― 血清でWestern blot法で調べたと ころ，Sf―9細胞膜上にgp63（63Kd）の発現が見られたのに対し，このバンドは非キャリア一 血 清 で は 検 出 さ れ な か っ た 。 ま たenv非 発 現Sf―9cellに お い て も 陰 性 で あ っ た 。 2． Recoibinant gp63免疫家兎におけるHTLV―II特異的血清抗体env蛋白で免疫した1週間後 の家兎（Raー3，Ra−4）血清をrecombinant HTLV−II gp46蛋白を用いたWestern blot法により検 討 したとこ ろ，両家 兎血清とも所定の分子量に特異的バンドが得られ抗HTLV−II gp46特異 的 抗体を保 有するこ とが確認さ れた。一 方免疫前 血清にはgp46と反応する抗体は見いださ れ なかった 。また， プ口ブ口ッ トHTLV−I法の 結果，本 免疫血清はenv蛋白gp46のみと特異 的に反応しgag蛋白p24との反応は見られなかった。本免疫血清を用いてHTLV−II感染細胞塗 沫標本を螢光抗体法により染色した結果，Vines，Mo―T細胞はともに10 0%の細胞が染色され HTLV− Iお よ びHTLV―II非 感 染T細 胞 CEM，Molt―4は 全 く 染 色 さ れ な か っ た 。 3．免疫家兎血清によるHTLV―II細胞の合胞体形成抑制HTLV−II産生細胞は，B細胞株BJABと 融合し合胞体を形成することが知られている。上記血清を用いてVines及びMo―T細胞表面の HTLV→II env蛋白発現 をflow cytometryで検討した結果，両細胞にenv蛋白が表出しており 特 にVines細胞で 高い発現 が見られた。又，BJABとの混合培養により，Vines細胞はMo−T細 胞 と比較し て約3倍の 頻度で合胞 体を形成 した。そ こでVines細胞を用いて合胞体形成が上 記抗env免疫血清で阻止されるか否かを検討したところ濃度依存性に合胞体形成を抑制した。

4． 家兎に対 するHTLV―II感 染実験と特 異抗体の 推移recombinant env蛋白により免疫した 家兎（Ra−3，4）及び非免疫家兎（Ra−1，2）に対し，Vines細胞接種によりHTLV−II感染を試み，

特 異的血清 抗体の推 移を検討した。 PA法では非免疫家兎ではVines細胞接種2週目に抗体の 出 現を認め た後，抗 体価は上昇傾向を示したが，免疫家兎では，Vines細胞接種後に抗体価 が 軽度上昇 したもの の，6週目以 降低下す る傾向が 見られた 。GSトgp46を用 いたHTLV―II env特 異的蛋白 によるWestern blot法でも非免疫家兎では2週目に弱いバンドが出現し4週以 降10週目迄強 いバンド を維持した。又プロブロットHTLV−I法によりenv蛋白gp46及びgag蛋 白p24の推移を みたとこ ろ非免疫家兎ではVines細胞接種後4週目で2羽中2羽抗gp46抗体が検 出 され，6週 目以降で は2羽中1羽に 更に抗p24抗 体が検出 されたが，免疫家兎では全観察期 間を通じて抗gp46抗体のみが検出可能でありしかもZ週目以降徐々に弱くなる傾向を認めた。

5． Vines細胞接種家兎におけるHTLVーII DNAの検出Vines細胞接種によりHTLV−II感染を試 み た免疫及 び非免疫 家兎にっき，末梢血リンパ球におけるHTLV―II DNAの有無をPCR法によ り継時的に検討した。非免疫家兎（Ra−1，2）ではそれぞれ4，及び2週目より検出可能となり，

以後12週間の観察期間を通じてHTLV−II DNAが検出された。但しHTLV−II DNAはそれぞれ12． 8週目以降Nested PCRのみにて検出可能とナょりこの時期を境にHTLV−II DNA量の減少が窺わ れた。一方，免疫家兎（Ra−3，4）においては10週間の観察期間を通じて，HTLV−IIDNAは検出 されなかった。以上の結果より，Vines細胞投与によるHTLV―II感染家兎モデル作成とenv蛋 白 の能動免 疫による 感染予防の可能性が示唆された。今回感染モデルと免疫モデルが各2例 と少なく今後多数例での検討が必要であるが，この研究はHTLV−II．に対する能動免疫成立の 可能性を初めて示したものであり，今後のHTLV−II研究を進める基礎になるものと思われた。

結語

  HTLV−Ilenv領域 の 機 能を解 析するた めrecombinant env蛋白を作 成して検 討し，次 の 結果が得られた。

1．バ キ ュ口 ウ イ ルス ベ クタ ーを用いて 作成したrecombinant HTLVーII gp63 env蛋白が   HTLV−IIキャリアーヒト血清にて認識されることを確認した。

2． Recombinant  env蛋白で家兎を免疫し，血清中にHTLV―II env特異的坑体の出現を認めた。

3．家兎坑env血清は，HTLV−II産生細胞VinesとB細胞株BJABとの融合による合胞体形成を濃   度依存性に抑制した。

4．家兎にVines細胞を接種しHTLV−II感染を試みた結果，HTLV―IIプ口ウイルスDNAが持続的   に 検出され ，recombinant env蛋白による能動免疫でこの持続が抑制される可能性が示唆   された。

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学位論文審査の要旨

主 査   教 授   浅 香 正 博 副 査   教 授   長 嶋 和 郎 副 査   教 授   大 里 外 譽 郎

学 位 論 文 題 名

HTLv‑uenv 蛋 白 の 作 成 と そ れ に よ る 感 染 抑 制 効 果

  HTLV−IIは 特 定 の 疾 患と の病 因的 関与 及び 感染 病理 は未 だ充 分 に解 明さ れて いな い。

本 研 究 で ； ま 中 和 活 性 を担 う抗 体を 同定 する こと を目 的と し， 今 回新 に開 発し たSf―9‑

バ キ ュ ロ ウ イ ル ス に よ るHTLV−IIenv蛋 白gp63発 現 系 を 用 い て 家 兎 の 能 動 免 疫 を 行 い，HTLV−II感染防御効果にっき検 討した。

    材料と方法

1‑細 胞HTLV−II感 染 細 胞と してHTLV―II持続 感染 者よ り樹 立さ れ たHTLV−Ifト ラン スフ オー ム細 胞株Vines及びhairy cell leukemia患 者よ り樹 立確 立さ れた.tlo−Tを 用いた。

2． Sf−9Insect Cellに よ るenv蛋 白 の 発 現env領 域 全 域 の1，464bpをPCRに て 増 幅 後 バ キ ュ ロ ウ イ ル ス のtransform vector pVL1392のBamHIsiteに 挿 入 し ，Sf−9cellと コトランスフェクションし，env発現Sf−9cellを得た。

3． reco:binant gp63に よ る 家 兎 の 免 疫 と 実 験 的HTLV−II感染 家兎 の免 疫は ，2羽 の家 兎（Raー3，4） にっ きそ れぞ れ上 記gp63発 現Sf―9cellとFreund's adjuvantの混合液を週 1回 の 割 合 で4回 筋 注 に よ り 行 っ た 。HTLV‑II感 染 は 上 記 免 疫 家 兎 に 加 え ， 対 照 群 と し て 非 免 疫 家 兎2羽 （Ra−1，2） の 計4羽 に っ き ， そ れ ぞ れHTLV‑II感 染 細 胞 株Vines細胞 1． Ox10‑個 を 耳 静 脈 投 与1回 に よ り 行 い ， 継 時 的 に り ン パ 球 と 血 清 を 分 離 採 取し たっ 4． PCR法 によ るHTLV―IIゲ ノム の増 幅HTLV−II遺伝 子中 ，保 存性 の高 いenv領域 内の631 bp（6，031〜6，661）をPCRで増幅後，その内側411bp（6．099〜6，509）をNested PCRで増幅 し，Southern blot法で特異性を確認した。

5． fITLV−II特 異 的 抗 体 の 検 出 家 兎 血 清 中 の 特 異的 抗体 は，Particle Agglutination

（PA）法（セ口デイアHTLVーIキ・ソト），プ口ブロットHTLV−I法（HTLVーI特異抗体検出キッ ト ） を 用 い た 。HTLV−II recombinant gp46蛋 白 を用 いたWestern blot法 にはHTLVーII env gp46を 大 腸 菌 に て 発 現 し ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 に 転 写 し た も の を 作 成 し て 用い た。

    結果と考察

1． Sf―9Insect cellに お け るrecombinant gp63蛋 白 の 発 現HTLV−IIenv発 現Sf−9 cellをニ トロ セ ルロ ―ス 膜に 転写 後ヒ トHTLV―I【キ ャリア一血 清でHrestern blot法で調 べたところSF−9細胞膜上にgp63（63Kd）の発現が確認された。

2． reco:binant  gp63免 疫家 兎に お けるHTLV―II特異 的血 清抗 体env蛋白 で免 疫し た家 兎（Ra−3，4） 血清 にはHTLV―II gp46蛋白に特異的バンドが得られ抗HTLV−IIgp46特異的 抗 体 が 確 認 さ れ た 。 本 免疫 血清 を用 いたHTLV−II感染 細胞 塗沫 標 本でVines，Mo―T細胞 はともに10 0cvの細胞が染色された 。

3． 免 疫 家 兎 血 清 に よ るHTLV―II細 胞 の 合 胞 体 形 成 抑 制 上 記 血 清 を 用 い てVines及 びMo

−T細 胞 表 面 のHTLV‑II env蛋自 発現 をf！ow cytometryで検 討し た結 果両 細胞 にenv蛋白 が 表 出 し て お り 特 にVines細 胞 で 高 い 発 現 が 見 ら れ た 。 ま た 上 記 抗env免 疫 血 清は 濃度

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依存性にVines細胞の合胞体形成を抑制した。

4．家兎に対するHTLV―II感染実験と特異抗体の推移PA法で非免疫家兎（Ra―1，2）では Vines細 胞接種2週 目に抗体 の出現を認めた後，抗体価は上昇傾向を示したが，免疫家 兎（Ra―3，4）で；よ，接種後に抗体価が軽度上昇したものの，6週目以降低下する傾向が見 ら れたっ非 免疫家兎 では接種 後4週目で2羽中2羽に抗gp46抗体が検出され，6週目以降 で は2羽中1羽に更に抗p24抗体が検出された。免疫家兎では全観察期間を通して抗gp46 抗 熔 の み が 検 出 可 能 で あ り し か も2週 目 以 降 徐 々 に 弱 く な る 傾 向 を 認 め た 。 5． Vines細胞接種家兎におけるHTLV−II DNAの検出Vines細胞接種後HTLV―IIDNAの存 在の有無をPCR法により継時的に検討した結果、非免疫家兎（Ra−1，2）で；まそれぞれ4週 目 及び2週目 より検出 可能とな り以後12週間の観察期間を通じてHTLV−IIDNAが検出さ れた。しかし，免疫家兎（Raー3．4）においては10週間の観察期間を通じて，HTLV‑II DNA は 検出され なかった ョ以上の 結果は，Vines細胞投与によるHTLV‑II感染家兎モデルと env蛋白の能動免疫による感染予防の可能性が示唆された。

  以上本研究；ま，新しく作成したrecombinant  HTLV‑ II  env蛋白による能動免疫による HTLV―H感染抑制の可能性を初めて示したものといえHTLV‑ II感染機構の解明に寄与し た も の であ り ，よ っ て 博士 （ 医 学） の 学位 授 与 に充 分 値す る も のと判定 された。

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