環境常在細菌が有する極貧栄養環境への新規適応機構に関する研究

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環境常在細菌が有する極貧栄養環境への新規適応機

構に関する研究

著者

稲葉慎之介

号

17 学位授与機関

Tohoku University

学位授与番号

生博第402号

URL

http://hdl.handle.net/10097/00127808

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東北大学第６４号

博士論文内容の要旨及び

審査結果の要旨

生命科学第１７集（課程博士）

（令和元年度授与）

東北大学

令和元年度

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氏名

学位の種類

学位記番号

学位授与年月日

学位授与の要件

研究科，専攻

論

文

題

目

博士論文審査委員

いなばしんのすけ

稲葉慎之介

博士（生命科学）

生博第４０２号

令和２年３月２５日

学位規則第４条第１項該当

東北大学大学院生命科学研究科

（博士課程）生態システム生命科学専攻

環境常在細菌が有する極貧栄養環境への新規適応機構に関する研究

（主査）教授永田裕二

准教授三井久幸

准教授大坪嘉行

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論文内容の要旨

自然環境で生息する細菌は、温度変化、高塩濃度、乾燥、栄養源の不足など、常に様々な環境ストレスに直面している。特に栄養条件は、激しく変動し、かつ基本的には枯渇状態である場合が多いと考えられることから、環境常在細菌が対処すべき重要な問題である。一般的に、細菌は栄養条件が好ましくない環境下では、緊縮応答により代謝活性を低下させ、さらには、グラム陰性細菌の休眠状態への移行や、グラム陽性細菌の胞子形成など、生命維持にかかるコストを極力抑え、「耐え忍ぶ」ことで対処していると考えられており、それら機構についても多くの知見が蓄積されている。一方、低栄養条件でも生理活性を維持し、積極的に増殖する細菌の存在は認知されているものの、その機構に関しては未解明な点が多い。本研究では、このような栄養源が制限された環境においても従属栄養細菌が増殖する現象に着目した。当研究室では、典型的な好気性従属栄養細菌でAlphaproteobacteriaに属するSphingobium

japonicum UT26株の難分解性環境汚染物質である有機塩素系殺虫剤 -hexachlorocyclohexane 分解資化能に着目した研究を長年行ってきた。本株は、全ゲノム配列が決定され、遺伝子操作系が確立されており、関連情報も蓄積されていることから、環境細菌の環境適応・進化機構の解明を目指した研究の優れたモデル細菌である。

先行研究により、UT26株のトランスポゾン突然変異株の中から、炭素源非添加の無機塩固体培地でCO2固定を伴ってコロニー形成する（oligotrophic表現型）株が見出され、推定

Zn-dependent alcohol dehydrogenase (ADH) 遺伝子 (adhX) の高発現が本表現型の直接の要因であることが示された。本研究では、adhX依存的なoligotrophic表現型の (i) 環境細菌における意義と、(ii) 機構解明を目的とした。 I. adhX依存的なoligotrophic 表現型の環境細菌における意義 UT26 株の adhX 近傍領域の解析により、 adhXは UT26 株染色体上のトランスポゾンに囲まれた領域に存在していた。また、当該領域と高い相同性を示す領域はUT26 類縁菌株にも存在し、それら領域はプラスミド上に存在する場合が多いことから、adhX を含む領域が環境中で水平伝播している可能性が示唆された。そこで、UT26 株由来のadhX 高発現プラスミドを他細菌株に導入したところ、UT26 類縁菌株のみならず、系統的に離れた Betaproteobacteriaに属する株でもadhX高発

現によるoligotrophic 表現型を示す株が存在した (図 1)。すなわち、adhX依存的なoligotroph 表現型がより普遍性の高い現象であることが示唆された。

一方、そもそもadhX高発現株はトランスポゾン突然変異株の中から見出された株であり、これまでの研究では、人工的にadhXを発現させた際のoligotrophic 表現型について検討を行って

図1. 他細菌株でのadhX 依存的な oligotrophic 表現型の検討 -:空ベクター導入株 +:adhXUT26高発現株

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いた。すなわち、adhX 依存的な oligotrophic 表現型の本来の意義は不明であった。そこで、 oligotrophic 表現型を示す突然変異が野生株でも起こり得るのか、変異型 dnaQ を用いた hypermutator 株で検討した。その際、UT26 野生株だけでなく、adhXを破壊したUT26DAX 株でも検討した。その結果、UT26 hypermutator 株では当該表現型を示す sub-population が培養 5 日目で出現し、検討した全ての単離株で adhX が高発現していた。一方、UT26DAX hypermutator 株では 3 週間の培養期間中で当該表現型株は全く取得できなかった。以上、 oligotrophic 表現型は自然突然変異で生じ得ること、および、その出現にはadhXが必須であることを明示した。さらに、(i) これら UT26 hypermutator 株由来の oligotrophic 表現型突然変異株のadhX上流域には変異が生じていないこと、(ii) adhX上流域を広宿主域プロモーター検索ベクターのレポーター遺伝子上流に挿入したプラスミドを UT26 hypermutator 株由来の oligotrophic 表現型株に導入すると、野生株に導入した場合より高いレポーター活性を示したこと、から、発現抑制因子の脱抑制変異によりadhX高発現突然変異が生じている可能性が強く示唆された。一方、hypermutator 株でない UT26 株を炭素源非添加の無機塩固体培地で培養した場合でも、低頻度ながらspontaneous に oligotrophic 表現型を示す突然変異株が出現することを見出した。そこで、これら突然変異株を複数単離し、ゲノムリシークエンスを実施した。その結果、推定二成分制御制御因子をコードする遺伝子などの十数種類の遺伝子に突然変異が生じていた。現在、これらの突然変異とoligotrophic 表現型との関連性を検討している。

II. adhX依存的なoligotrophic 表現型の機構解明

AdhX 産物の機能について検討した。まず、His タグを付与した AdhX、および推定 NAD+_結

合ドメインを構成するアミノ酸残基に変異を導入した３種の変異型AdhX(C42A)、AdhX(H43R)、 AdhX(T44A)を大腸菌で高発現・精製し、ADH 活性を測定した。その結果、AdhX は methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol に対して ADH 活性を示した。また、AdhX(H43R)は AdhX より弱いADH 活性を示したが、AdhX(C42A)と AdhX(T44A)は ADH 活性を示さなかった。次に、 AdhX、および３種の変異型 AdhX をそれぞれ高発現する UT26DAX 株を作製し、これら株の oligotrophic 表現型を14_CO₂_{incorporation assay ならびにプレート上のコロニー画像のイメー}

ジングによる新規手法を用いて定量的に評価した。その結果、AdhX(H43R)発現株は野生型 AdhX 発現株より弱いoligotrophic 表現型を示し、AdhX(C42A)と AdhX(T44A)発現株は当該表現型を示さなかった。これらの結果から、(i) adhXが実際にADH 活性を有するタンパク質をコードすること、(ii) AdhX の ADH 活性の強さと oligotrophic 表現型との間の相関関係があること、を明示した。一方、先行研究で、UT26 adhX高発現株のトランスポゾン突然変異株ライブラリーの解析から、ピルビン酸/リン酸ジカイネース、アセチル CoA シンテターゼ、イソクエン酸リアーゼをコードすると推定される遺伝子がoligotrophic 表現型に必須な遺伝子として同定されていた。これらの遺伝子の推定機能と、UT26 株のゲノム配列情報からホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ (PPC)による CO2固定を伴うグリオキシル酸回路が本表現型を司る中心的な機構であると推定された。そこで、本回路に必須な推定PPC 遺伝子とリンゴ酸シンターゼ遺伝子をそれぞれ破壊した adhX 高発現株を作製した。しかし、両破壊株は oligotrophic 表現型を示し、他の

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CO2固定を伴う過程がoligotrophic 表現型で機能していると示唆された。

以上、本研究により、adhX依存的なoligotrophic 表現型が、少なくとも UT26 株類縁細菌群では重要な極貧栄養環境適応機構の一つであることを明示すると共に、他の環境常在細菌でも同様の極貧栄養環境適応機構が機能している可能性を示した。また、adhX高発現突然変異が発現抑制因子の脱抑制による突然変異で起こることが強く示唆された。一方、adhXが実際に ADH 活性を有するタンパク質をコードし、AdhX の ADH 活性の強さと oligotrophic 表現型との間の相関関係があることを明示した。さらに、PPC による CO2固定を伴うグリオキシル酸回路以外

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論文審査結果の要旨

好気性従属栄養細菌の

Sphingobium japonicum

UT26株は有機炭素非添加の無機塩最小固体培地では生育できない。しかし、先行研究で本株のトランスポゾン突然変異株の中から、当該条件でCO2固定を伴ってコロニー形成する（oligotrophic表現型）株が見出され、その

後の解析で推定alcohol dehydrogenase (ADH) 遺伝子 (

adhX

) の高発現が本表現型の直接の要因であることが示された。本研究では、本現象を解析することで、環境細菌の低栄養環境適応に関する知見を得ることを目的とした。

adhX

UT26高発現プラスミドを様々な環境細菌に導入したところ、UT26 類縁株に加え、

系統的に離れた株でもoligotrophic 表現型を示し、本現象が比較的普遍性の高い現象であると示唆された。一方、UT26 株の自然突然変異で oligotrophic 表現型株が生じること、当該突然変異株の出現には

adhX

が必須であり、それら変異株では

adhX

が高発現していることを明示した。すなわち、

adhX

依存的なoligotrophic 表現型が環境細菌の環境中での棲息に重要な現象であることが強く示唆された。次に、大腸菌で発現・精製したAdhX産物が実際にADH活性を示し、その活性と oligotrophic表現型の強度に相関活性があることを示した。一方、先行研究で、本表現型に関与する候補遺伝子が複数同定されていた。これらと他の推定関連遺伝子の破壊株と相補株のoligotrophic表現型を評価した結果、グリオキシル酸回路の関与と共に、複数のCO2固定機能の存在が示唆された。以上、本研究では、「

adhX

依存的なoligotrophic表現型」という現象が、環境細菌が有する新規の低栄養環境適応機構として機能している可能性を提示した。また、本現象の分子機構について、遺伝学的アプローチで一定の成果を得た。以上の成果を以って、自立して研究活動を行うに必要な高度の研究能力と学識を有することを示している。したがって、稲葉慎之介提出の論文は、博士（生命科学）の博士論文として合格と認める。

環境常在細菌が有する極貧栄養環境への新規適応機構に関する研究