品種の異なる大豆由来ペルオキシダーゼの精製とキャラクタリゼーション

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(1)Title. 品種の異なる大豆由来ペルオキシダーゼの精製とキャラクタリゼーション. Author(s). 藤倉, 治菜; 森田, みゆき. Citation. 北海道教育大学紀要. 自然科学編, 65(1): 29-34. Issue Date. 2014-08. URL. http://s-ir.sap.hokkyodai.ac.jp/dspace/handle/123456789/7576. Rights. Hokkaido University of Education.

(2) 北海道教育大学紀要(自然科学編)第 6 5巻第 1号 J o u r n a lo fHokkaidoU n i v e r s i t yo fE d u c a t i o n( N a t u r a lS c i e n c e s )Vo . l6 5 .No. l. 平成 2 6イ￨二 8月. . t2014 Augus. 品種の異なる大豆由来ペルオキシダーゼの精製とキャラクタリゼーション藤倉治菜・森田みゆき. 北海道教育大学被服学・生活環境工学研究集. P u r i f i c a t i o nandc h a r a c t e r i z a t i o no fp e r o x i d a s e fromd i f f e r e n tk i n d so fs o y b e a n s TOKURAHarunaandMORITA Miyuki Departmento fT e x t i l eandE n v i r o n m e n t a lS c i e n c e s .S a p p o r oCampus.HokkaidoU n i v e r s i t yo fE d u c a t i o n .S a p p o r o .0 0 2 8 5 0 2. ABSTRACT Theoptimumc o n d i t i o n swereexaminedf o rp u r i f y i n gsoybeanp e r o x i d a s e(SPO)u s i n g e x t r a c t sfromd i f f e r e n tk i n d so fs o y b e a n s .Themosts u i t a b l ec o n c e n t r a t i o no fammonium t h ef i r s tt i m e )，and90%( t h es e c o n dt i m e )，r e s u l f a t ef o rs a l t i n go u tt h eenzymewas30% ( s p e c t i v e l y .Themosts u i t a b l epHf o ri o nchromatographyo fOtohimemidori，Toyomusume， andOshimamidoriwas6.5，5.7，and6.0，r e s p e c t i v e l y .Asp u r i f i c a t i o nadvanced，t h es p e c i f i c h ef i n a ls p e c i f i ca c t i v i t ywas933-1260，whichwasapproximately a c t i v i t yi n c r e a s e d，andt 7 0 1 0 0 0t i m e sh i g h e rt h a nt h a to ft h ec r u d ee x t r a ct .Them o l e c u l a rw e i g h to fSPOf o u n du s 04，1 .49X 1 04，and2 . 2 2X 1 04f o rOtohimemii n gg e le x c l u s i o nchromatographywas2.30X1. e s p e c t i v e l y .Them o l e c u l a rweighto fSPOc l e a r l y d o r i，Toyomusume，andOshimamidori，r 旺e r e n tk i n d so fs o y b e a n s . d i f f e r e df o rd i. 1.緒言従来の布の漂白には，酸素系，塩素系の酸化漂. 用化されている 3)。近年，注目されているベルオキシダーゼ (POD) は活性部位にヘム鉄を有する酵素で，過酸化水素共存下でアミノ化合物や. 白剤が使用されていて，水質汚染，二酸化炭素の. フェノール化合物の酸化触媒として作用する。. 排出などという点で，環境負荷や安全面において. POD一過酸化水素漂白系は室温および、広い pH、で. 課題があるとされている。そのため環境負荷の削. 迅速にアゾ色素を退色することから，従来の過炭. 減を目的として酵素を洗剤や漂白剤に活用できな. 酸ナトリウム漂白系よりも実用的であり，環境負. いか検討されている1.2)。実際に一部のアミラー. 荷の削減と安全面においても期待されている 4)。. ゼやリバーゼなどの酵素は洗剤用に開発され，実. PODは様々な種類があり由来によって特性が. 2 9.

(3) 藤倉. i 台菜・森日みゆき. 異なる。大豆由来 POD (SPO) は，西洋ワサビ. 分で遠心分離をかけて回収した上澄み 3品種(乙. 由来 POD (HRP) やモミガラ由来 POD (RPO). 姫みどり，. よりも退色速度は遅い 5)が，熱耐性があるため高. 下で，. 温でも失活しない 6)ので，漂白剤として応用でき. て0 .6mlずつ分取し，イオンクロマトグラフィー. る可能性がある。また，可食部からも PODを抽. ( 2 5x15cm， Macro-PrepDEAE) を行い，フ. 出することができる 7 )が，葉や茎，根からも POD. ラクションごとの活性をグアヤコール法，タンパ. を抽出することができるため，バイオマスの有効. ク質量をピシンコニン酸法で測定した。. トヨムスメ，おしまみどり)を自然滴. pH5 ， 7~6.5 の O.lM リン酸緩衝液を用い. ，. 活用にもつながると考えられる。しかし，分子量が明らかにされている HRPやRP08，9)などに比べ. 2-4 ゲルクロマトグラフィーによる精製と分. て， SPOの特性はまだ明らかにされていない。従って，本論文では，. SPO漂白剤として利用. 子量測定. 1 .5x23cmのカラムに pH7.4に調整した Bio. する可能性を探るため，品種の異なる大豆を自ら. G e lp 1 0 0を詰め，分子量の測定は，標準タンパ. 栽培し，それぞれの精製条件を決定するとともに，. ク質である B l u eDextran， Chymotrypsinogen. SPO精製段階別の比活性と収率及び分子量を求. A，Albumin，Ovalbuminを1 . 5x23cmのカラ. めた。. B i oG e lp 1 0 0 ) pH7.4のOlMリン酸緩衝液ム ( ，. を用いて各々 05ml滴下し，検量線を作成した。，. また，精製した SPOを同様に 0 .5ml滴下して，. 2 . 実験方法. 1'い，フラクションごゲルクロマトグラフィーを 1. 21 SPOの抽出. との活性をグアヤコール法で測定した。. 収穫した非可食部の大豆(乙姫みどり，. トヨム. スメ，おしまみどり)をよく水で士を洗い流した後，品種ごとに 5cm程度に裁断する。サンプル. 50gに対し超純水 250mlを加え 5分間ミキサーに. 3 . 結果及び考察 3-1 塩析における硫酸アンモニウム濃度の影. かけて抽出を行った。そしてポリエステルの布で櫨過した後に遠心分離(4o C，3500rpm，1 0 分間) にかけて上澄みを回収したものを抽出液とした。. 響. 塩析 1回目に得られた上澄み液の活性とタンパク質量の関係を図 1に示す。硫酸アンモニウムが増加するほど，上澄み液中のタンパク質量，活性. 2-2 塩析による精製事 1. 2 0. 抽出液 50ml をいれたビーカーに飽和度 10~. 50%の硫酸アンモニウムを溶解し，冷蔵庫内で一晩静置した後，遠心分離をかけて上澄みを回収し. ， .. た。上澄みを各々回収し，飽和度 60~90% の硫酸. アンモニウムを加えて冷蔵庫で一晩静置し，遠心分離をかけて上澄みと沈殿を分離した。活性はグ. 10. アヤコール法で，また，タンパク質量は 275nm の吸光度で測定し，決定した。最終的に得られた. 奇弘. 沈殿物はセロファン膜を用いて透析した。. 5 0 0 r .p m， 1 0 透析後 pH5 7~6 ， 5に調製し， 3 ，. 3 0. 事総泌. o. 2-3 イオンクロマトグラフィーによる車青製，. e. ¥ 司. 初汲-'"灘. 、. 襲 25. 1 む. t ' ' 1 0 2 0 3 0 40 50§j00 総量産アンモ毛織t t C 重量〉企員企. 企. = . ， J .. 図 1 塩析 1回目の上澄み液の活性とタンパク質量. .:活性. .:タンパク質量.

(4) 品種の異なる大豆由来ベルオキシダーゼの精製とキャラクタリゼーション. が減少した。活性とタンパク質量が多いというこ. を櫛主怠. とは余分なタンパクも上澄みに残ってしまってい. 2 . 4. 平て. る可能性もあるため，タンパク質量が少なく，かっ活性が高い 30%を塩析 1回目における硫酸アン. 乙姫みどり. J 門. モニウムの最適濃度に決定した。各硫酸アンモニウムにおける塩析 2回目の沈殿. 翼線. 物質の活性を図 2に示す。硫酸アンモニウム濃度. 沈殿物に活性が一番高い硫酸アンモニウム濃度は. 90%であった。また，このときの上澄み液は活性. ¥~. 1. が増加するほど，沈殿物中の活性値は増大した。. 日台、、〉、 0..轟も. 。 L . 電量. SPOをより多く沈殿物に. が低かったことから，. 含んでいる 90%を 2回目の塩析の最適濃度に決定. つ7~静タ 3決議ン鵠閣弘. 鵠蝿. した。. 怠韓. うて. 2 . 4. トヨムスメ. j 入. 喜朗. 4削. 1 0!. ・. u a } k 瞬. 1 . 2λ ' 、 " 、旬が. O . 事号、. 司九_.._-. . . . 司署. I 1. 0 . 4. 九咽. 。 st i s a S 8 7きでて守縫 1 0 1 5 2 0 2 5 30 35 4. 。し....量~‘Lw婚話L.誕 tai. 。. 事. h. i. 7'!1!?シ議ン純弘. T 制樹毎級制蜘. 2 . 8. 70. 7 5. 銅器事事磁器器. .. 島 _. 2 . 4. 続犠アン宅 ; ; ; " 7 J . . 織自陸料}. 図 2 塩析 2回目における沈殿物の活性. 3-2 イオンクロマトグラフィーにおける pH の影響. 40. j. 3. 2 s s省幸略. 強. 、 p 、，、. 1 . 2~. . 2 0. 0 . 8持、. 3本の1.5x 3cm (注射器)のカラムに， pH5.7， 6.0， 6.5に調製したイオン交換樹脂. (Macro-PrepDEAE) を充填し，イオンクロマトグラフィーにおける各々の活性とタンパク質量の溶出曲線を図 3に示す。活性とタンパク質量の溶出曲線の最大値を示した各々の pHを比較した時に，活性が最も高くタ. 1 0 1. 品ヲ冨. ー・・7. 句哩F司n. F. ォ. 0 . 4. o 8. 1 ). S 1 0 J S 2 0 2 S 30. 事S. 40. 7 'J~シ譲:;，.緑n.. 図 3 イオンクロマトグラフィーにおける溶出曲線活性:・: pH5.7，・: pH6.0，.: pH6.5 タンパク質量:0: pH5.7，口: pH6.0，く>: pH6.5. ンパク質量が最も低い条件を，最適条件とした。その結果，乙姫みどり，. トヨムスメ，おしまみど. りの最適 pHは各々 pH6.5，6.0， 5.7となった。. このことから，品干重によってイオンクロマトグラフィーにおける最適 pHが異なることがわかった。. 3 1.

(5) i 台菜・森日みゆき. 藤倉. 3-3 精製による SPOの比活性と収率. 乙姫みどり，. E. トヨムスメ，おしまみどりの抽出. 液と各々の精製段階別(塩析，イオンクロマトグ 1 . 5. ラフイー，ゲルクロマトグラフィー)のよヒi 舌↑生と︽. gc岬-hN︾総訳出冒. 収率を比較した結果を表 1に示す。精製が進むにつれて比活性は高くなり，収率は低くなった。抽出液とゲルクロマトグラフィー後の比活性を比較してみると，乙姫みどりは 65倍，おしまみどりは 94 倍，. 0 . 5. トヨムスメは 1 3 0 0 1 音となった。しかし収率. を比較すると，いずれも 1%以下になってしまった。つまり，純度の高い SPOをある程度の量確保するためには，. 5. SPO抽出液が大量に必要にな. り，コストが高くなることがわかった。そのため，. 10 1 S 20 フラタシ送ンNo.. 2S. 30. ，・ :. 図 4 標準タンパク質の溶向曲線. : ・. SPOを洗浄の漂白剤として使用するためには，. 企 :B l u eDextran. Chymotrypsinogen-A Albumin，.:Ovalbumin. より低コストの精製法を開発するか，低純度の SPOで反応性を高める工夫をするかの検討が必. 要であると考えられる。. 0 . 2 5 0 . 2. 3-4 分子量の測定 SPOの分子量を測定するため，精製した SPO. 0 . 1 5. を用いてゲルクロマトグラフィ一法で検討した。 0 . 1. 標準タンパク質の溶出曲線を図 4に示す。図 4から，検量線を図 5に，ゲルクロマトグラフィーに. 0 . 0 5. 。. おける各品種 SPOの溶出曲線を図 6に示す。まず，図 4で得られた標準タンパク質の溶出曲. 2. 3. 6. 5. 4. 7. 4) 分子量 (x1 0. 線から，以下の式の標準タンパク質の分配係数 Kavを求めて，検量線を作成した o. 図 5 検量線. Kav= (Ve- V0 )/(Vt- V0 ). .:分配係数 ( K a v ). 表 1 精製段階における比活性、総括性、収率. 乙姫みどり. トヨムスメ. 総活性比活性収率 (U/mg) ( t o t a lu n i t ) ( % ). 総j 舌性比活性 (U/mg) ( t o t a lu n i t ) d. おしまみどり収率. ( % ). 比活性総活'性収率 (U/mg) ( t o t a lu n i t ) ( % ). 拙. 出. f 麦. 1 4 . 2. 1 .80x1 05. 1 0 0. 0 . 9 8 1. 1 .06x105. 1 0 0. 1 2 . 5. 2.06X105. 1 0 0. 透. 析. 後. 1 1 1. 1 .47X105. 8 2. 1 8 . 5. 3.18X104. 3 0. 31 .4. 5 . 3 0X1 04. 2 5. イオンクロマトグラフィー後. 2 4 4. 1 .1 3X1 03. 0 . 6 2. 5 2 7. 5 . 3 8X1 02. 0 . 5 1. 3 4 9. 9.36X102. 0 . 4 5. ゲルクロマトグラフイー後. 9 3 3. 7 2 . 6. 5 6 . 6. 0 . 0 2 7. 3 2. .26X103 0 . 0 4 0 1. 2 5 . 7. .1 7X1 03 0 . 0 2 4 1.

(6) 品種の異なる大豆由来ベルオキシダーゼの精製とキャラクタリゼーションの結果，乙姫みどり，. 50. トヨムスメ，おしまみどり. .49X 104，2.22x の分子量は各々， 2.30x104，1 40. 104となった。このことから，品種によって分子. e 。当︾桜山崎. 量が異なるということが明らかになった。. 30. 20. 4 .総 f 百. 10. 。。. SPOを漂白剤に利用するための基礎研究とし. て，塩析における硫酸アンモニウム最適濃度と， 5. 10. 1 5. 20. 25. 30. フラタション No .. イオンクロマトグラフィーにおける最適 pHについて検討した結果，塩析での硫酸アンモニウムの. 35. 最適濃度を，. 30. 1回目が30%， 2回目が 90%と決定. した。イオンクロマトグラフィーでの最適 pHは. / ipH5.7 ，お乙姫みどりが pH6.5，トヨムスメ i. 25 。圃也、お︾劇山間. トヨム. しまみどりが pH6.0と決定した。. 20. これらの最適条件で、精製を行った結果，比活性. 1 5. は精製過程が進むにつれて増大し純度のより高い 1 0. SPOを精製することができた。しかし，精製段. 5. 。。. 階が進むにつれて，収率は大幅に低くなった。今 5. 1 0. 1 5. 20. 30. 後，より効率的な精製方法を検討していく必要がある。. フラタション N o .. ゲルクロマトグラフィ一法により，標準タンパ. 3 5. ク質による検量線から，各品種ごとの分子量を算 30. 出した結果，乙姫みどりが 2.30X 104，トヨムス. 。妥当︾桜山崎. 25. J王 1 .49X 104，おしまみどりが 2.22X 104であるメi. 20. ことがわかった。. 1 5 10. 引用文献. 5. 1)四方資通，繊維製品消費科学， 3 7，5 3，( 19 9 6 ). s. 10. I S. 20. l5. 30. フラクション鈍o . 容I 引曲帝京図 6 ケやルクロマトグラフイーによる SPOのi. 9，1 8 3 2)長嶋正子，石川貴章，高岸徹，繊維学会誌， 6 ( 2 0 1 3 ) 3)大矢勝，図解入門よくわかる. 本と仕組み，秀和システム，. 最新洗浄・洗剤jの基. pp 98~ 1 0 9( 2 0 1 1 ). 4)森田みゆき，上舘民夫，渡辺寛人，ベルオキシダー. ここで Kavは分配係数，. Veは試料分子の溶離. 容量，V。はボイド容量， Vtはカラム容量である。得られた Kavから図 5のように，検量線は y = -0.045x+0.344， R2=0.966となった。さら. 図 6から同様に各品種 SPOの分配係数 Kav を求めて，検量線を用いて分子量を算出した。そ. ゼを触媒とする色素の分解反応とその応用，表両， 3 9 ( 1 9 9 8 ) 3，N o .1， 7 ( 2 0 0 7 ) 5)森田みゆき，繊維学会誌， 6. 6 ) M.Morisaki.M.Morita.K.I to . ] .Ole o .S e i .，5 3， 1 7 7 1 8 1( 2 0 0 3 ). 7 ) RonM i t t l e r，BarbaraA .z i l i n s k a s，P u r i f i c a t i o nand C h a r a c t e r i z a t i o no fPeaC y t o s o l i cAscorbateP e r o x -. 3 3.

(7) 藤倉. i 台菜・森日みゆき. i d a s e， P l a n tP h y s i o ，l 9 7，962~968 ( 19 9 1 ) 8) 谷道子，森崎真奈美，森出みゆき，もみがら抽出酵素の精製とペルオキシダーゼ活件今，け本分析化学会北. 海道文部冬季:fi I J究発表会要旨集 ( 2 0 0 7 ). 9) R R kimm，V，V，P i s a r e v，andA .M，Egorov，Ana . l Biochem，1 9 9，1( 1 9 9 1 ). (藤倉治菜札幌校大学院生) (森田みゆき. 34. 札幌校教授).

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