植物ポリフェノールに由来する新規生理活性物質に関する研究

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植物ポリフェノールに由来する新規生理活性物質に関する研究

井手誠二^＊１平野吉男^＊２小野昌志^＊２

Study on novel bioactive compounds derived from phytopolyphenols

Seiji Ide, Yoshio Hirano, Masashi Ono

種々の 4-ヒドロキシ-スチルベン誘導体を原料に 11 種のスチルベン 2 量体を合成し，天然型のレスベラトロール 2 量体,及び同スチルベン 2 量体の 5α-リダクターゼ阻害活性の測定を行った。ジヒドロベンゾフラン環の有無，置換基の種類，置換基の位置と数について，各々の阻害活性を系統的に比較することで構造-活性相関を調査した。

ジヒドロフラン環を有し，3,5 位に酸素原子が位置した場合，特にフェノール性水酸基の時に阻害活性が高くなることが明らかとなった。一方，4 位に嵩高い置換基が入る場合は促進活性を示す知見が得られた。

1 はじめに

5α-リダクターゼは前立腺，肝臓，皮膚，頭皮など男性ホルモン標的器官に存在する酵素で，血中の主要な男性ホルモンであるテストステロンをジヒドロテストステロンへと変換する酵素である。ジヒドロテストステロンは受容体と遺伝子との相互作用を著しく強め，このジヒドロテストステロンの過剰産生は前立腺肥大症，男性型脱毛症，にきび，女性における多毛症など男性ホルモン依存性疾患の原因^1）となることが知られている。このことから当該酵素の阻害剤は男性ホルモン依存性疾患の治療や予防に有効であり，さらには新規な阻害剤の開発により当該疾病のリスクの低減が図られ，人類の生活の質の向上に非常に有効なものとなる。

本研究ではこれまで樹木から新規な 5α-リダクターゼ阻害活性成分の探索を行ってきた。その結果，代表的な熱帯産樹木であるShorea属樹木に高い阻害活性を有するレスベラトロール（3,4',5-trihydroxy stilbene）のオリゴマーを見出し²⁾³⁾，さらにはレスベラトロールの重合により天然オリゴマーより阻害活性の高いレスベラトロール 2 量体を得た³⁾。

レスベラトロールの単量体には活性が認められないことから天然レスベラトロールオリゴマー，並びにそのアナログ化合物共通の 2,3-ジヒドロ-ベンゾフラン骨格が活性発現に重要であることが示唆された。

本研究はこれまでに得られた知見を検証し，さらなる強力な阻害活性成分の分子設計を行うことを目的に種々のスチルベン 2 量体の合成を試みると同時に構造-活性

相関の解明を行った。

2 実験方法

2-1 HRP を用いたスチルベン 2 量体の合成

スチルベン類は図-1 のとおりwittig反応で合成した。

得られたスチルベンは各々HRP／H₂O₂系を用いて重合し，

シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより 2 量体を分離した。

また，スチルベン 2 量体の脱メチル化反応ではブロモトリメチルシランを用いた時，ジヒドロベンゾフラン環が開環し次に脱メチル化合物が得られた。本化合物は収量が極めて少なく評価に必要な量を得ることができなかった。一方，t-ブトキシ基が導入された 2 量体はトリフルオロ酢酸で脱保護反応するとベンゾフラン環を保持した目的の生成物が得られた。

合成で得られた化合物の化学構造はMS及び¹H-NMRで確認を行った。（図-2.1 と図-2.2）

2-2 ラット肝臓ミクロソームを用いた 5α-リダクターゼ阻害活性の測定

5α-リダクターゼ阻害活性の測定はLiangら^４）の報告をベースとし，諸条件の変更を行いアッセイ系を組み立てた。

0.7µM[4-¹⁴C]テストステロン-エタノール溶液 10µL，試料のDMSO溶液 10µL及び 220・Lリン酸バッファー(pH6.5)に雌ラット肝臓ミクロソームを 10µL，1mM- NADPHを 50µL 加え，37℃，10 分間インキュベート後，3M-NaOH 10µ^Lの添加により反応を停止させた。これをエチルエーテルで抽出し，TLC （酢酸エチル:n-ヘキサン 7:3）により展開すると，テストステロンと 5α-リダクターゼの機能で

*1 生物食品研究所

*2 インテリア研究所

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λmax(ε) = 306 nm (19000) 328 nm (23000) HRP: Horseradish peroxidase

4.95, 5.50 ppm (each1H, d, J=9Hz) 3.69, 3.83 ppm (each3H, s, OCH₃) HRMS m/z (M⁺) calcd

for C₃₀H₂₆O₄ 450.1831 found 450.1840 4.46, 5.39 ppm (each1H, d, J=9Hz)

HRMS m/z (M⁺) calcd for C₂₈H₂₂O₂ 390.1620

found 390.1618

λmax(ε) = 280 nm (13000) 323 nm (10000)

図-1 ベンゾフラン環を有すスチルベン 2 量体の合成と脱アルキル化

O HO

H H

O HO

H H

H₃CO

OCH₃

O HO

H H

OCH₃

OCH₃ CHO

O HO HO

(OR)_n

(OR)_n CH₂

OCOCH₃ Ph₃P⁺Br^-

+

1) Wittig reaction

2) Hydrolysis HRP/H₂O₂

O HO

RO

OR

HO H3CO

HO HO

HO

OH

O HO

HO

OH

TFA

TMSBr (excess) TMSBr (1.2 eq)

R = CH3

R = C(CH₃)₃

HO

OCH₃

1 2 3

4.52, 5.49 ppm (each1H, d, J=9Hz) 3.75, 3.80 ppm (each3H, s, OCH₃) HRMS m/z (M⁺) calcd

for C₃₀H₂₆O₄ 450.1831 found 450.1840 図-2.1 メトキシプロトンとベンゾフラン環２,３位プロトンのケミカルシフト

及びマススペクトル

(3)

O HO

H H H₃CO

OCH₃

O HO

H H

H₃CO

OCH3

H3CO OCH₃

O HO

H H H₃CO

OCH3

OCH₃ H₃CO

4 5 6

4.45, 5.36 ppm (each1H, d, J=9Hz) 3.78 ppm (6H, s, OCH₃)

HRMS m/z (M⁺) calcd for C₃₀H₂₆O₄ 450.1831

found 450.1834

4.95, 5.51 ppm (each1H, d, J=9Hz) 3.64, 3.69 ppm (each3H, s, OCH₃) 3.79 ppm (6H, s, OCH₃)

HRMS m/z (M⁺) calcd for C₃₂H₃₀O₆ 510.2042

found 510.2039

7 8 9

3.76 ppm (6H, s, OCH 4.45, 5.49 ppm (each1H, d, J=9Hz)

3.60, 3.71, 3.72, 3.79 ppm (each3H, s, OCH₃)

found 510.2042

4.51, 5.45 ppm (each1H, d, J=9Hz) 1.34, 1.35 ppm (each9H, s, OC(CH₃)₃) HRMS m/z (M⁺) calcd

for C₃₆H₃₈O₄ 534.2770 found 534.2783

3) FABMS m/z (M⁺) calcd for C₃₀H₂₆O₄ 450

found 450 O

HO H

H OCH₃ H₃CO

OCH₃

OCH3

O HO

H H

OC(CH3)3

(H3C)3CO

HO H3CO

OCH3

HO

HO HO

OH

HO O

HO H

H

OH HO

O HO

HO

OH

OH 4.75, 5.40 ppm (each1H, d, J=9Hz) 3.72, 3.73, 3.82, 3.83 ppm (each3H, s, OCH₃)

found 510.2046

11 12 10

4.46, 5.44 ppm (each1H, d, J=9Hz) 4.46, 5.50 ppm (each1H, d, J=9Hz)

FABMS m/z (M⁺) calcd for C₂₈H₂₂O₄ 422 found 422 FABMS m/z (M⁺) calcd

for C₂₈H₂₂O₄ 422 found 422

Resveratrol dimer

図-2.2 メトキシプロトンとベンゾフラン環２,３位プロトンのケミカルシフト及びマススペクトル

(4)

各々のスポット濃度を¹⁴C標識を利用し，その放射活性をイメージングアナライザー(Fuji Film Co., Ltd.) により測定した。

テストステロンがジヒドロ体へと変換され難いものほど，その時加えた阻害剤が高い活性を有すことを示す。

ほど，その時加えた阻害剤が高い活性を有すことを示す。

3 結果・考察 3 結果・考察

3-1 スチルベン 2 量体の 5α-リダクターゼ阻害活性 3-1 スチルベン 2 量体の 5α-リダクターゼ阻害活性

レスベラトロール 2 量体を含む，種々のスチルベン 2 量体の阻害活性を表-1 に示した。

なお，置換基の位置と数が，容易に判断できように基本構造を下記に示した。また，正確なIC₅₀の値が得られなかったものは，反応系における化合物 50ppm時の阻害活性割合を示した。

なお，置換基の位置と数が，容易に判断できように基本構造を下記に示した。また，正確なIC

表-1 スチルベン 2 量体の阻害活性表-1 スチルベン 2 量体の阻害活性

化合物 R 阻害活性（IC50）化合物 R 阻害活性（IC

50の値が得

られなかったものは，反応系における化合物 50ppm時の阻害活性割合を示した。

50） 1 H ^a）12 % at 50 ppm 2 2-OCH₃ 197 µM

3 3-OCH₃ 171 µM 4 4-OCH₃ 193 µ^M 5 2,5-OCH₃ 2 % at 50 ppm 6 2,4-OCH₃ 4 % at 50 ppm 7 3,5-OCH₃ 142 µ^M 8 4-OC(CH₃)₃ 32 % at 50 ppm 9 4-OCH₃ (開環) 4 % at 50 ppm 10 OH（開環） −^ｂ）

11 OH 11 % at 50 ppm 12 3,5-OH 8.6 µM

a) : 促進活性を示した。

b) - : 評価に足る収量が得られなかった。

ベンゾフラン環の有無が 5α-リダクターゼ阻害活性に寄与しているかを，4 と 11 で比較した。ベンゾフラン環が含まれる 4 はIC₅₀が 193μM(24% at 50 ppm) であったのに対し，同環が開環した 11 は（11% at 50 ppm）であった。また，2 量体となっていない重合前のスチルベン体は全く活性がないことから，明らかに，

ベンゾフラン環構造が阻害活性を高めていることを示している。

3-3 置換基の種類と 5α-リダクターゼ阻害活性置換基の種類が 5α-リダクターゼ阻害活性に寄与しているかを，3,5 位にフェノール性水酸基が有るレスベラトロール 2 量体 12 と同メトキシ体 7 と置換基を有さない 1 で比較を行った。各々の活性は 12 が劇的に高く，続いて 7 であり，1 は阻害活性ではなく若干の促進活性が見られた。このことは，阻害活性に対してフェノール性水酸基の存在が大きく寄与していることを示唆している。

O HO

2 3 4 5 6

1 1

2 3

4 5 6 Rn

R_n また，4 位のみに置換基を有する，11，4，8，1 で比較を行った。阻害活性の高さは 4 > 11 > 1 > 8 であり 1，8 に至っては促進活性を示した。4 位に直鎖状アルキル基が導入されたものは高い阻害活性が期待されるのに対し，t-ブチル基の様な嵩高い置換基が導入された場合，促進活性を示すものと考えられる。

図-3 スチルベン２量体の基本構造

4 位の置換基は，その立体的要因が活性の種類を左右することを示唆している。

3-4 置換基の位置，数と 5α-リダクターゼ阻害活性置換基の位置が 5α-リダクターゼ阻害活性に寄与しているか 2 つのメトキシ基を有す，5，6，7 で比較した。阻害活性の高さは，7 > 6 > 5 の関係にあり，

特に 3,5 位にメトキシ基を有す 7 は他の２つに比較して高い活性を示す。このことは 3,5 位に置換基が位置することが同活性に大きく寄与することを示している。

さらに，1 つのメトキシ基を有す 2，3，4 でも同様の比較を行った。同活性の高さは 3 > 4 > 2 の関係であり，3 位にメトキシ基が位置した場合，同活性が高いことがわかる。このことは 2 つのメトキシ基の場合 3，5 位で活性が高くなる上記の傾向と共通の挙動である。

一方，置換基の数が 5α-リダクターゼ阻害活性に寄与しているか，2 つのメトキシ基を有すものと 1 つのものとで比較した。

(5)

7 と 3，6 と 4，5 と 2 を各々比較したところ，何れの場合も 2 つのメトキシ基を有す 5，6，7 が高い阻害活性を示した。

これらのことは，高い阻害活性が，特定の位置に 2 つの置換基を有すことに起因していることを示している。

3-5 高い 5α-リダクターゼ阻害活性が期待される構造上記の結果から，高い 5α-リダクターゼ阻害活性が期待される構造は次のとおりに推測される。

①ジヒドロベンゾフラン骨格を有すスチルベン誘導体の重合物で 2 量体であること。

②3,5 位にフェノール性水酸基があること。

③4 位に直鎖状のアルキル基があること。

4 まとめ

人口の高齢化が深刻化する中で前立腺癌，前立腺肥大症といった高齢性の男性ホルモン依存性疾患の有効な治療，予防法の確立は早急に対応しなければならない課題の一つである。

本研究では性ホルモン代謝系における男性ホルモン活性化酵素である 5α-reductase の阻害をターゲットとし，男性ホルモン依存性疾患の治療や予防に有効な成分の探索を行ってきた。

各種化合物の合成を試みた本研究の結果から，新たな高い阻害活性を有する阻害成分は得られなかったが，

構造-活性相関に関わる幾つかの知見が得られた。

一方，樹木資源からの 5α-reductase 阻害活性成分の探索では，本研究の結果推測された高活性の化合物構造に類似した新たな阻害成分が見つかっており，これらの知見は，今後さらに強力な阻害成分を分子設計する上で重要であるものと考えられる。

5 参考文献

1）Bruchovsky N, Wilson J.D., J. Biol. Chem., 243, p. 2012-2021(1968)

2) a) Hirano Y., Kondo R., Sakai K., J. Wood Sci., p. 308-312(2001) b) Hirano Y., Kondo R., Sakai K., J. Wood Sci., p. 53-58(2003) 3) Hirano Y., Kondo R., Sakai K., J. Wood Sci., p.

64-68 (2002)

4)Liang T.,Liao S., Biochem. J., 285,p.557-562 (1992)