ビタミン・カロチノイドの発酵
星野達雄
ビタミンの種類（
13種）
水溶性ビタミン
ビタミンＢ１ ビタミンＢ２ ビタミンＢ６ ビタミンＢ１２ ニコチン酸 パントテン酸 葉酸 ビオチン ビタミンＣ脂溶性ビタミン
ビタミンＡ ビタミンＤ ビタミンＥ ビタミンＫ水溶性ビタミン
ビタミンＢ１ 補酵素 TPP ビタミンＢ２ 補酵素 ＦＭＮ，ＦＡＤ ビタミンＢ６ 補酵素 PDP ビタミンＢ１２ 補酵素 アデノシルＣｏｂ ニコチン酸 補酵素 ＮＡＤ，ＮＡＤＰ パントテン酸 ＣｏＡ 脂肪酸合成など 葉酸 補酵素 Ｃ１基の転移 ビオチン 補酵素 ＣＯ２転移 ビタミンＣ 水酸化に関与（OH-Pro)脂溶性ビタミン
ビタミンＡ 抗酸化ビタミン、ロドプシン ビタミンＤ Ｃａの吸収 ビタミンＥ 抗酸化ビタミン ビタミンＫ 補酵素（血液凝固因子） Ｃａの吸収に関与ビタミンの薬理効果
A E B1 B2 B6 B12 C しみ ● にきび ● ● 口内炎 ● ● 疲れ目 ● ● 目の乾燥 ● 肩こり ● ● 手足のしびれ ● ● ● ● 腰痛 ● ● 冷え性 ●ピロロキノリンキノン（
PQQ)
PQQの概要
• Coenzyme concerning redox cycling identified in 1979 • Water‐soluble compound (reddish brown powder) DistributionIn • daily foods and beverages • In human tissues, organs and human milkBioPQQ and Three Pillars
to Brain Health
• The Revolution has Begun! – BioPQQ can help you see improvements in the short term and protect your brain in the long term. Here are the three ways BioPQQ has revolutionized brain health. • Grow – Nerve Growth Factor • Energize – Increasing Mitochondria • Protect – Antioxidant （三菱瓦斯化学）コバラミンの種類
• ＯＨコバラミン 光に不安定 • ＣＨ３コバラミン 光に不安定 • Ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｙｌコバラミン 光に不安定 ＣＮコバラミン 室温で光に安定 工業生産するときは、全てＣＮコバラミンとし て回収している。ビタミン
B12発酵菌
始原菌、細菌、放線菌によって生合成される。 酵母、糸状菌、植物、動物には生合成能はない。 – Streptomyces olivaceus (グルコース：８．５ｍｇ・L) – Propionibacterium freudenreichii (グルコース：２５ｍｇ・L) – P. shermanii (グルコース： ３９ｍｇ・L) – Pseudomonas denitrificans (ビートモラセス： ５９ｍｇ・L) – Corynebacterium (パラフィン： ２．３ｍｇ・L)P. denitrificansを用いた例
• ビートモラセス（１００ｇ）、酵母エキス（２ｇ）、５， 6－ジメチルベンズイミダゾール(25mｇ)/Ｌのほ か、無機塩を含む培地を用いる。生産性：５９ ｍｇ・Ｌ。 • ビートモラセスに含まれているベタインが重要 な役割を果たしている。 – ベタインの役割については十分理解されていない生合成に関与する遺伝 子（３０）は既にクローニ ングされている。
ビタミン
B2（リボフラビン）生産菌
Ashbya gossypii (BASF) 5－6 g/l Candida flaeri (Coors) 7.5 g/l
Candida famata 20 g/l
Bacillus subtilis 4.5 g/l
(recombinant, Russia)
Corynebacterium ammoniagenes 17.4 g/l
ribA ribG
ribT ribH
ＤＳＭ社のB.subtilis組換え体による
Ｂ２発酵
B. subtilisではオペロンをなしている
Bacillus subtilisの
リボフラビンオペロン
ribT ribH ribA ribB ribG
ribO
転写物
rib C (Repressor gene)によって発現は コントロールされている
リボフラビンオペロンの改変
• 元のプロモーターを、強力なプロモー
ターと２カ所交換
• プラスミド上にオペロンを挿入
• 染色体上に組み込み
• 薬剤選択圧によるコピー数の増大
Ｂ２オペロン 耐性遺伝子 Ｂ２オペロン 組み換え Ｂ２ 耐性 Ｂ２ 耐性 Ｂ２
コピー数増大による薬剤耐性強化
Ｂ２オペロン数の上昇
Ｂ２生産の増大
培養液（４８時間後）
L-Sorbose 2KGA D-Glucose Vitamin C D-Sorbitol Diacetone-L-sorbose Diacetone-2KGA CH2OH HCOH HOCH HCOH HCOH CH2OH COOH C=O HOCH HCOH HOCH CH2OH CH2OH C=O HOCH HCOH HOCH CH2OH O=C HOC HOC HC HOCH CH2OH O CHO HCOH HOCH HCOH HCOH CH2OH 標準ルート 中国ルート 合成 合成 合成 合成 合成
現在使われているビタミンＣの製造方法
ビタミンＣの合成能
• ヒトは、アスコルビン酸を生体内で合成できな い。 – その必要量をすべて食事などによって外部から 摂取する必要がある。 • 多くの動物は、アスコルビン酸を生合成でき る。 • 体内で合成できないのは、モルモットや霊長 類の一部（人間を含む）など一部だけである。動物におけるビタミンＣ生合成
Ｇｌｕｃｏｓｅ D-グルクロン酸 L-グロン酸 L-グロノラクトン ビタミンＣ植物のビタミンＣ生合成
ビタミンＣの微生物生産
微生物：３段階
動物： ９段階 植物： ９段階
ビオチン発酵の歴史
１９６０年代 ピメリン酸などの前駆体の添加がビオチ ン生産に有効であることを発見。 Bacillus sphaericus 0.8-1.1 μg/ml １９７０年代 ビオチン拮抗物質耐性変異株が取得さ れ利用されるようになった。 ビオチン拮抗物質（アシドマイシン、５－ （２－チエニル）n-吉草酸）耐性株株分離ビオチン発酵の歴史つづき
１９８０年代 遺伝子操作による菌株育種が行われた。E. coli
K-12 100-970 ｍｇ/ＬＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ
1ｇ/ＬＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ
４８ｍｇ/Ｌビオチンオペロン
Bacillus subtilis 168 Escherichia coli K-12 ビオチンによる強い フィードバックコントロール Ｂ Ｄ Ｆ Ａ Ｗ Ｂ Ｆ Ｃ Ｄ Ａビオチン発酵の課題
デチオビオチンに硫黄原子を導入する最終反 応はビオチン合成酵素によって触媒され、生合 成上の律速反応となっている。その反応機構 は未だ不明の点が多い。
ＤＴＢからビオチンへの反応系
ＮＡＤＰＨ、フラボドキシン、フラボドキシ ン還元酵素、鉄イオンが必要
ビタミンＢ６（ピリドキシン）
ＣＨＯ ピリドキサール
ビタミン
B6発酵
• 用途：医薬用原料、飼料添加物用原料、食品 添加物に利用される。 • 生産：現在微生物発酵によるビタミンB6生産 は行われていない。化学的プロセスで年間約 3,500トンのピリドキシンが生産されている。リゾビウムにおけるビタミンＢ
６生産とその生合成に関する研究
ビタミンB
6生産菌の分離
分離 1,590の細菌 28℃で培養 生産培地の寒天ブ ロックに植菌 ビタミンB6生産 Ｂ６検定培地に乗せる。 ビタミンB6定量 - 28℃で17時間間培養 49の土壌試 料の懸濁液 28℃で培養 10 g/mlのシクロヘキシミド入り 栄養寒天スクリーニング結果
Number of bacteria (%) Diameter of halo (mm) 20 ~ 25 25 ~ 30 20 < 30 > 41.6 30 24 4.4％ 0 20 40 60 80 100 液体培養 < 0.01 mg/L < 1 mg/L > 1 mg/L根粒菌におけるビタミンB
6生産
Rhizobium strain Vitamin B6 (mg/l)
R. meliloti IFO 14782 R. meliloti IAM 12035 R. huakii IFO 15243 R. huakii IFO 15244 R. leguminosarum strain 28-21 R. leguminosarum IFO 13337 R. leguminosarum IFO 13338 R. leguminosarum IFO 14168 R. leguminosarum IFO 14778 R. leguminosarum IFO 14784 R. leguminosarum IFO 14785 R. leguminosarum IFO 14994 R. leguminosarum IFO 14995 R. tropici IFO 15247 R. galegae IFO 14965 R. loti IFO 13336 R. loti IFO 14779 51 3 20 0 23 0 0 5 10 2 0 2 3 9 8 1 1
ビタミンＢ６の微生物生合成経路まとめ Ｇｒａｍ＋菌 4PHT AHP E4P 4PE P.P. PNP Pyridoxine Glucose 6P Glucose PYR DXP G3P ED GcolAD PdxR SerC PdxA PdxP Dxs YaaD, YaaE 6PG Eda PdxJ Ｇｒａｍ－菌
カロチノイド
• 植物・藻類・光合成細菌の光合成 • 動物の視覚（プロビタミンＡ） • 色彩（花、果物、野菜、動物、魚、卵黄など） • 抗酸化作用 • 現在約７５０種類のカロチノイドが単離・構造 決定されている。炭素４０からなる分子が一 番多く存在。主なカロチノイド生産菌
生産菌株 カロチノイド カビ・酵母 Blakeslea trispora β-カロチン Phaffia rhodozyma アスタキサンチン 微細藻類 Haematococcus pulvialis アスタキサンチン Dunaliella salina β-カロチンβ-カロチン ゼアキサンチン カンタキサンチン アスタキサンチン Ｅ Ｂ Ｉ Ｙ Ｚ Ｚ Ｗ Ｗ Ｚ Ｗ Ｚ Ｗ Ｚ Ｗ Ｚ Ｗ リコピン
Dunaliella salina の培養
βカロチンの生産
塩濃度：２０－３０％ 強い光が必要
