ペプチド(アミノ酸残基 7~8 個 )

(1)

第 5震

第

5章

ロイシンの摂食による筋原線維タンパク質分解

抑制メカニズムの検討

第

1 節目的

前章までの結果より、ラットに無タンパク質摂取時にロイシンを摂食することで、週齢に関係なく筋原線維タンパク質の分解が抑制されることが示されたO 本章では、その抑制メカニズムについて検討するO 筋原線維タンパク質の分解は、まずカルパインが筋原線維の Z帯を切断して、ミオシンフィラメントとアクチンフィラメントを遊離するO さらに、プロテアソーム系により小さいペプチドにまで分解され、リソソーム系によってアミノ酸にまで分解されるというメカニズムが考えられている [17] (Fig.5-1)。 Nagasawaら [63]は、ロイシン投与による筋原線維タンパク質分解抑制が、どの分解系を阻害することによるものかを検討するため、単離筋肉切片をインキュベーションした緩衝液中に、カノレパインまたはリソソーム系の阻害剤を添加し、 MeHisの放出速度を測定した

5

結果、プロテアソーム系の関与がないことを示唆し、さらに排腹筋可溶成分中のミオシン重鎖量に変化がなかったことから、カノレパインの関与もないことを示唆したO 平野 [89]は絶食後に 20%カゼイン飼料を摂食させ、排腹筋中のプロテアソーム活性を測定し、プロテアソーム活性が絶食時と比較して変化しなかったことから、食餌タンパク質による分解抑制にプロテアソーム系の関与がないことを示唆した、また、代表的なリソソームプロテアーゼである、カテプシン

L

、

B

、

H

の活性を測定したところ、活性が減少する傾向があることを示したO これらの結果から、食餌タンパク質やロイシンによる筋原線維タンパク質の分解抑制は、リソソーム系により制御されていると考えられるO しかし、 Hamelら [65]による

i

nv

i

t

r

o

の実験では、ロイシンを含むい

(2)

ダ 5掌くつかのアミノ酸がプロテアソ } ム系を阻害することにより骨格筋タンパク質分解を抑制することを示唆しているO 本章では、ロイシンの継続摂取による、筋原線維タンパク質分解抑制のメカニズムを解明するため、カルパインとプロテアソームの酵素活性、代表的なユピキチンリガーゼ、である、 Atrogin圃1と MuRFlの遺伝子発現、オートファジーのマーカータンパクである LC3の発現の変化を調べて検言せしたO 筋原線維タンパク質ミオシン、アクチンユピキチン " フ。ロテアソーム系ペプチド(アミノ酸残基 7~8 個) 二リソー系 Fig.5闘1 筋原線維タンパク質分解の概略図

(3)

第 5毒苦第 2節方法 1. 動物実験本章で用いたサンプルは、 3章で得られた実験 1(若齢)のラットの排腹筋を使用したO 2. カノレパイン活性の測定方法 (1) カルパイン活性測定法カノレパインはカノレシウム依存性のプロテアーゼであるO 本実験では、カノレシウムの存在、非存在下における基質の分解量の差をカルパイン活性としたO カルパイン活性の測定は、基質としてアゾカゼインを用いる方法 [90]で検討したO {試薬

l

pHは酢酸を用いて調製したO ホモジネートバッフア 100mMTris、1mMETDA (pH 7.5) 基質用バッファー1: 100mM Tris、200mMKCl、20mMメルカプトエタノール、 10mMCaC12 (pH 7.5) 基質用バッフア掴2: 100mM Tris、200mMKCl、20mMメノレカプトエタノール、 10mMEDTA (pH 7.5) [方法} アゾカゼイン 120mgに 10mLの基質用バッフア幽1、または基質用バッフア -2を加えて溶解したものを、試験管に 1mLずつ分注し、あらかじめ 250 CでプレインキュベーションしたO 酵素溶液は、排腹筋 100 mgに 40 イ音量のホモジネートバッファを加えて、氷冷しながら 30秒間ホモジナイズし調製したO 酵素溶液 1mLを基質溶液に加えて即座に混和し、 25 0 Cで 2時間インキュベーションしたO インキュベーション終了後、 20% TCA

(4)

ゑ亨 5震を 2mL加え、反応を停止させたo 4 0 C、4，000X gで 10分間遠心分離し、 366nmの吸光度を測定したO 排腹筋中のカノレパイン活性は、酵素溶液に含まれるタンパク質が、カルシウム依存的に分解する基質の量から評価し、カルシウム依存による吸光度の差 ( 基質用バッファ -1-基質用バッフア圃2)が 0.1のとき 1unitとして表したO (2) 粗酵素溶液中のタンパク質の定量酵素溶液のタンパク質濃度の測定は、 Lowry法変法 [91]により測定した。 {試薬}

.A

液 :2% (W/V)炭酸ナトリウム、 0.40/0 (W/V)水酸化ナトリウム、 0.16% (W/V)酒石酸ナトリウム、 1% (W/V) ドデシル硫酸ナトリウム

.B

液 :4% (W/V)硫酸銅五水和物

.

c

液 :A液 :B液 =100mL : 1mLで混合したO .D液 :2Nフェノール試薬を純水で 2倍に希釈したO ( 明記していない試薬は、試薬特級、和光純薬工業株式会社、大阪 ) {方法} 酵素溶液の希釈液 1mLに C液 3mLを加えてよく撹枠し、 15分間静置したO その後 D液 0.3 mLを吹き付けるように加え直ちに撹持し、さらに 30分間静置した後、 750 nmの吸光度を分光吸光光度計 V-530(日本分光株式会社、東京 ) で測定した。なお、盲検は純水、標準液にはタンパク質として牛血清アノレブミン (FractionV Powder Minimum 96% Signia、USA) を用いたO

(5)

ゑ亨 5震 3 プロテアソーム活性の測定方法プロ。テアソームの主要なべプチダーゼである、キモトリプシン様ペプチダーゼ活性を Aki ら [92] の方法を改良じて測定したO プロテアソームは基質特異性の非常に広い酵素であるが、 4 -メチルクマリノレ-7-アミド (MCA) と結合した高感度の合成基質 [93] を用いて酵素活性を測定したO ペプチドと結合した MCA は、ペプチド結合が切断されると、蛍光物質である 7醐アミノ-4 -メチノレクマリン (AMC) を遊離するO そこで、遊離した AMC の蛍光強度を測定することにより、酵素活性を測定したO [試薬] @ホモジネート用緩衝液 10m M Tris、1mMEDTA、5mMMgS04、250 m Mショ糖、 0.1

%

(W/V) Brij 35 (pH 7.4)

@合成基質 Succinyl-L同 Leucyl-L -Leucyl -L園 Valyl・L圃 Tyrosine

4-Methyl-Coumaryl-7・Amide (株式会社ペプチド研究所、大阪)

基質は、 10 m M になるようにジメチルスルホキシド (DMSO、生化学用 ) で溶解して冷凍保存したO 使用時に純水で 5 倍希釈し、 2 m Mで使用したO

・ 50μM 7-Amino-4・Methyl-Coum'arin (AMC) :.10 m M になるように

DMSOで溶解して冷凍保存しておき、使用時に純水 200倍希釈し、 50 μMに調製したO ・ 0.25 M トリス塩酸緩衝液 (pH8.0) 反応用緩衝液 :2.5mM ジチオスレイトーノレ 0.25M トリス塩酸緩衝液 (pH 8.0) 基質溶液 :2 m M の合成基質溶液を反応用緩衝液で 5倍希釈した。 10

%

(W/V) ドデシノレ硫酸ナトリウム (SDS) 0.1 M トリス塩酸緩衝液 (pH9.0)

(6)

第 5辛苦 {方法] 排腹筋約 100mgに 30倍量のホモジネート用緩衝液を加え、氷冷しながらポリトロンホモジナイザー (Kinematika GmbH Steinhofhalde、 Switzerland) で 30秒間ホモジナイズ ( ダイヤル 4) したO 次いで、氷冷しながら超音波ホモジナイザー

(GSD-

50型、株式会社エスエムテー、東京)で 10秒間の破砕 (Tuning6)を3回行なったO このホモジネート溶液をホモジネート用緩衝液で 15倍に希釈し、測定用の酵素溶液としたO 基質溶液 50μLに酵素溶液 50μLを加え、 37 ocで 10分間インキュベーションしたO インキュベーション終了後、直ちに 10

%

(W/V) SDS 0.1 m Lを加えて反応を停止させ、さらに 0.1M トリス塩酸緩衝液 (pH9.0) 2mLを加え、励起波長 380nm、蛍光波長 460nmにおける蛍光強度を分光蛍光光度計 (RF-5300 PC、島津製作所)を用いて測定したO なお盲検は、酵素溶液の代わりに純水を添加したものを用い、標準試料には 50μM AMCを用いたO 酵素溶液のタンパク質濃度は、原液のホモジネート溶液を 100倍希釈し、前述の 2.カノレパイン活性の測定方法 (2).粗酵素溶液中のタンパク質の定量と同様に測定したO 結果は、遊離した AMCの物質量で表した 4.ユピキチンリガーゼの遺伝子発現の検出筋肉組織の代表的なユピキチンリガーゼ、である Atrogin-1とMuRF1の遺伝子発現量をノーザンブロッティングにより検出したO

・ Total RNAの抽出 (Acid-guanidium -p he nol-chloroform法・ AGPC法) ノーザンブロッティングにより遺伝子発現量を測定するため、ラットから摘出した排腹筋から AGPC法 [94]により TotalRNAを抽出したoRNA

分解酵素 (RNase) による分解をさけるため、試薬の調製と TotalRNA

の抽出では、使用した試薬、チップは 121 oc、20分間のオートクレーブ処理を行ったものを使用したO

(7)

ダ

5 .

{試薬}

.， Denaturing solution (801 D) 4Mグアニジンチオシアン酸塩、 0.5

%

N-lauroyl sarcosine (ICN) になるように純水に溶解し、 1Mクエン酸ナトリワム (pH7.0)溶液を 2.5 m L加え、純水で 100 mLにフィルアップしたO この溶液を 50 m L取り、使用時に 2圃メルカプトエタノールを 0.35mL加えたO ・ 2M酢酸ナトリウム (pH4.0) 水飽和フェノール : 粒状フェノール (Wako) を 500 Cで溶解し、当量の純水を加え混ぜたO 静置して上層の水を取り除いたO これを 2 度繰り返し、遮光し 40 Cで保存したO @クロロホノレム:イソアミノレアノレコーノレ (49:1)(v/v) • 2-フ。ロパノーノレ • 75%エタノール [方法] 排腹筋約 200mgに801Dを 2mL加え、氷冷しながらホモジナイズし、 2 m Lチューブ 2つに 800μLずつ移したO 次に、それぞれのチューブに 2M酢酸ナトリウム (pH4.0) 80μL、水飽和フェノーノレ 800μL、クロロホノレム:イソアミノレアノレコーノレ (49: 1) 160μLを加え、よくボルテックスした後、 4 ocで 15分間静置したO その後 4 oc、8，000gで 10分間遠心分離し、 RNAが溶解している上層 ( 水層 ) を新しい 2mlチューブに回収した(約 800μL)0 この際、下層 ( 有機層 ) および界面には DNAやタンパク質が溶解しているので、混入しないように注意した。上層に 2-プロパノール 800μLを加え、混合後 -20 oCで 10分以上静置したO その後 4 oc、 8，000 gで 10分間遠心分離し、上清を取り除き沈殿を得たo801 D を 300 μLを加え溶解し、 1.5mL容チューブに移した ( ここで 2つのチューブを 1つにする)0 2・プロパノーノレ 300μLを加えて混合後、 4 oC、8，000 gで 10分間遠心分離して上清を取り除き、沈殿を得たO 次に 75%エタノール

(8)

ダ

5 .

300μLを加え、混合後 4

o

c

、8，000 gで 5分間遠心分離し、上清を丁寧に取り除いたO 得られた沈殿をデシケータ内で約 2分間、真空乾燥し、残存するエタノーノレを取り除いた後、沈殿に 50μLの純水を加え溶解し、この液を TotalRNA溶液とし、泳動するまで-20

o

c

で保存したO .RNAの定量

Total RNA溶液に含まれる RNAの濃度を吸光光度計 (HITACHI U乞OOOA)で測定したo RNAは260nm、タンパク質は 280nmに吸収極大を持つO また、一本鎖の核酸の溶液では 40mg/mlの時に吸光度が 1.0 になる [94]。この事に基づき、 TotalRNA溶液を純水で 50倍希釈し、 260 nmと280nmの2波長を測定し、TotalRNA濃度と溶液の純度を調べたO @ ノーザンブロティングノーザ、ンブロティングとは、組織中で発現している特定の mRNAを、その cDNAを用いて検出する方法であるO その概要は、 TotalRNAを変性剤としてホルムアルデヒドを含むアガロースゲルを用いて、電気泳動にかけて RNAの大きさにより分離した後、メンブレンに転写するO 次に、メンブレン上の目的とする mRNAに標識された cDNAプローブをハイブリダイゼーション(結合)せるO 結合した cDNAをラジオアイソトープで標識されている場合はオートラジオグラフィ一等により、ジゴゲニン (DIG) などの非ラジオアイソトープで標識されている場合は化学発光法等により検出して、 mRNAレベルを測定するものであるO本研究では、電気泳動とメンブレンの作製を行った後 DIG標識した cDNAを用いてハイブリダイゼーションを行い、 DIG発光検出キットにより cDNAを検出して、 mRNAレベルを測定したO {試薬}

(9)

第5震 (同イ二化学)、 50mM酢酸ナトリウム、 10mMEDTAになるよう純水に溶解し、水酸化ナトリウムで pH7.0に調整した。 1210

C

、20分間オートクレーブし、遮、光して室温で保存したO @電気泳動用マスターミックス :1サンプノレにつき、ホルムアミド 10μL、ホルムアノレデヒド 3.5JlL、10XMOPS2.0μL、純水 4.5μLとなるように試薬をあらかじめ必要量混合したo @泳動用色素:Loading Buffer (ニッポンジーン、東京)lmL と 250mM EDTA4μLを混合したO • 20XSSC (pH 7.0) : 3M塩化ナトリウム、 300m Mクエン酸ナトリワムをいずれも最終濃度 333m Mになるように純水に溶解し、塩酸で pH7.0 に調整後フィルア、ツフ。したO

• 10 Xエチジウムブロマイド (EtBr)溶液 10mg/mL EtBr液 (Wako)

を純水で 10倍に希釈して、 1mg/mLとした。

10% SDS溶液 (pH7.2)

1Mリン酸ナトリウム (pH7.0) 50 m M NaOH"'10 m M NaCl ・ 100 m M Tris-HCl (pH 7.0-7.5)

・ High SDS Hybridization Buffer : SDS 7g、20X SSC 25ml、ブロッキング試薬(Roche) 2g、1M リン酸ナトリウム(pH7.0) 5ml、N-lauroyl sarcosine 0.1 g、純水 20m1をメディウムピンにとり、 121

o

C

、20分間オートクレーブし、ホノレムアミドを 50ml加え、混合したO

・ DIG標識された Atrogin-1・MuRF1・GAPDHプロープ :

rat Atrogin圃1

sense primer 5¥ATCCCTGAGTGGCATCGC回3'

antisense primer 5¥CTCTTCCACAGTAGCCGGT-3 ' rat MuRF1

sense primer 5¥GGACGGAAATGCTATGGAGAT-3 ' antisense primer 5¥AACGACCTCCAGACATGGA-3 '

(10)

ダ5震

rat GAPDH

sense primer 5'四ACCACAGTCCATGCCATCAC回3'

antisense primer 5'圃TCCACCACCCTGTTGCTGTA回3'

・ 2xSSC

+

0.1% SDS ・ O.lxSSC

+

0.1% SDS ・ Genius buffer 1 : 100 m Mマレイン酸、 150m M塩化ナトリウムになるように純水に溶解し、水酸化ナトリウムで pH7.5に調整した。・ Genius buffe

:

化ナトリウム、 50 m M塩化マグネシウムとなるように純水に溶解し、水酸化ナトリウムで pH9.5に調製したO ・ CDP-Star (12.5mM、Tropix) ・現像液:レンドーノレ (FujiFilm) ・停止液 :0.3% (v/v)酢酸 @ 定者液 : レンフィックス (.FujiFilm)

・ Stripping Buffer : 50%ホノレムアミド、 50m M Tris-HCl (pH8.0)、1% SDSになるように混合したO

[方法

1

・電気泳動用サンプノレの調整

1.5 m Lチューブに RNAを 10μg含む TotalRNA溶液を真空遠心乾燥ネ幾 (TAITECCENTRIFUGAL CONCENTRATOR VC-36S、ローター 36・A，

(11)

ダ 5震電気泳動用マスターミックス 20μLに沈殿を溶解した。 55

o

c

、15分間インキュベ } ションして変性させた後、直ちに氷中で 2分間冷却したO 泳動前に泳動用色素 2μLを添加し、泳動用サンプルとしたO ・ 1.2%アガロースグノレの作成、および電気泳動 Agarose S (ニッポンジーン) 0.48g、10XMOPS4mL、純水 34mLを混合した後、電子レンジで数分間加熱してアガロースを完全に溶解したO 60

o

c

程度まで冷却し、 10Xエチジワムブロマイド溶液 2μL、ホルムアルデピド 2.'2 mLを添加し室温で回めたO 泳動は緩衝液 (1XMOPS)を用い、 100ボルトで電気泳動を行った。泳動用色素中の 2種類の色素がゲルを 3等分したら泳動を終了した。 @トランスファー電気泳動終了後、ゲ、ノレの余分な部分を切りはずして、純水で、 5分間 X2 回振とうしたO次に 50m M NaO'H-10 m M NaClで 15分間振とうした後、ゲ、ルを純水ですすぎ、 100niM Tris園HCl (pH 7.0・7.5) で 15分間振とうしたO その後 10X SSCで 30分間振とうしたO この間にメンブレン ( HybondTM-N+、 amersham pharmacia-biotech) とろ紙 (FILTER PAPER、ADVANTEC) をゲルの大きさにカットし、メンブレンを純水で 10分間振とうした後に 10X SSCで 10分間接とうした。ブロッティングバッファーには 10X SSCを用い、ゲメレとメンブレンを密着させ、ブロテイング台を組み立て (Fig. 5回2) 10時間以上静置 Lトランスブア}したO トランスファー終了後、メンブレンを 2XSSCに浸し、UVライトにて RNA がメンブレンにトランスファーしているかを確認したO 次に、メンブレンを室温で十分に乾燥させた後 U VCrosslinkerを用いて、 U Vを照射し(表面 0.15J/cm2_X₂_、裏面 ₀_.₁_5J/cm2

x

₁₎ _{メンブレンに転写された} _RNA_を固定したO

(12)

五亨5震重し ←ーガラス披メンブレンゲル +ーガラス板ろ紙2枚 (25cm x 12cm) ←-10 xSSCが入った容器 Fig.5・2 トランスファーの概略図 ( ノーザンプロット ) @ ハイブリダイゼーション RNAを固定したメンブレンを 2XSSCで再び湿らせ、予め 50

o

c

に加温しておいた HighSDS Hybridization Bufferに浸して、 50

o

c

、2時間インキュベーシ、ヨンしたO その後 Bufferを捨て、予め 68

o

c

、10分間変性させたハイブリダイゼーションバッファー (DIG標識プロープ 200ng程度加えた HighSDS Hybridization Buffer) 中に浸し、 50

o

c

で一晩インキュベーションしたO ハイブリダーゼーション終了後、ハイブリダイゼー

ションバッファーは再利用できるため回収し、メンブレンを 2

x

SSC + 0.1% SDSで室温 15分 X2回振とうし、続いて 0.1

x

SSC+ 0.1% SDSで 68

r

2

に

で

5

分間振とうした後、

CDP-Star

を

Geniusb

u

f

e

r

3

で

400

倍に希釈した溶液にメンブレンを浸したO メンブレンの水気をきりピエールにパッキングし、

x

-線フィノレム

(Hyperf

i

l

m

，

amersham Pharmacia b

i

o

t

e

c

h

)

に感光させて現像したO 検出が終了したメンブレンは純水で洗浄し、

2XSSC

でパッキングし、保存したo @ストリッピングプローブを替えて再度検出を行う場合、メンブレンに結合しているプロープを剥離する必要があるため、メンブレンを純水で洗浄後、予め

68 o

c

に加温しておいた

S

t

r

i

p

i

n

gB

u

f

e

r

に浸して、

68

0

C

、

30

分

X2

回インキュベーションした。その後純水、続いて

2XSSC

で洗浄し、プレハイブリダイゼーションから行ったO

Atrogin -

1

と

MuRF1

の遺伝子発現の結果は、内部標準として

GAPDH

を用いて補正じ、無タンパク質

(PF)

摂食群の値を

100

としたときの相対値で表したO

"5.

LC3

の検出方法

オートファジーのマーカータンパク質である

LC3

の発現を測定し、オートファジーを評価した。

(14)

第 5震 (1)電気泳動用試料の調製 [試薬] @ ホモジナイズ用緩衝液 :0.25 M スクロース-1m M EDTA (pH 7.4) ・ 2

x

サンフ。ル緩衝液:0.5Mトリスアミノメタン (pH6.8) 2 mL、グリセローノレ 2mL、10%SDS'2mL、2-メルカプトエタノーノレ 0.2mL、4% ブロモフェノーノレブルーエタノール溶液 0.4m L、純水 1.4mLを混合したo {方法] 排腹筋約 100 mgに 10倍量のホモジナイズ用緩衝液を加え、氷冷しながら 30秒間ホモジナイズし、 40 C、3，800gで 3Q分間遠心分離したO 上清を除き、再び 10倍量のホモジナイズ用緩衝液を加え洗浄したO この洗浄行為を 3回繰り返した。この沈殿に筋肉と等量の 2Xサンフ。ノレ緩衝液を加え混合し、ブロックヒーターで 1000 Cで 5分間加熱し、放冷後-800 Cで保存したO (2) SDS-PAGE {試薬] @分離ゲ、ル用緩衝液 (A液): SDS 2.0g、Tris 90.9gをとり、純水を加えて溶解し、 1MHClで pHを 8;8に合わせた後、 500mLにしたO @ 濃縮ゲル用緩衝液 (B液): SDS 2.0g、Tris 30.3gをとり、純水を加えて溶解し、 1MHClで pHを 6.8に合わせた後、 500mLにしたO ・ 30% (W/V)アクリノレアミド混合液 (C液) 40% Acrylamide PAGE (Pharmacia Biotech、Sweden) 366 m Lにメチレンピスアクリルアミドを 4g加え、純水で 500mLにしたo

(15)

度加えて撹祥し、純水で 200mLにしたO " N，N，N，Nにテトラメチレンジアミン (TEMED) 10% (W/V)過硫酸アンモニウム (APS)， ?プロパノーノレ第5震 10X電気泳動用緩衝液 :Tris 30.3g、グリシン t44.1g、SDS 10gに純水を加えて溶解し 1Lにした。電気泳動用緩衝液 :10X電気泳動用緩衝液を純水で 10倍になるように希釈して使用したO [方法} ガラスプレートとシリコ‘ンパッキン、コームをメタノールで拭いた後、ガラスプレートの周囲をシリコンパッキンでシールし、左右をクリップで固定してゲ、ル版を組み立てたO 分離ゲルは 15%となるようにし、一枚のゲルあたり A液 2mL、C液を 4mL、純水を 2mL、10%APS 30μL、TEMED 10μLを加えて撹持し作成したO ゲ、ル版の聞に気淘が入らないようにゲルを入れ、 8分目まで注ぎ入れた ( コームを入れたときに 1cm空きができるくらし、 )0さらに 2・プロパノーノレを重層し、室温で 30分ほど静置して重合させたO分離ゲノレが重合した後、重層していた 2胸プロパノーノレを取り除き、 ? プロパノールの臭いが消えるまで純水で洗浄し、ろ紙で余分な水分を吸い取ったO 一枚のゲメレあたり、濃縮ゲ、/レ溶液 3mLに 10%APS 18ドL と TEMED 12μLを加え撹持し、濃縮ゲ、ル溶液を作成したO 濃縮ゲ、ノレ溶液を分離ゲルの上に静かに注ぎ込み、気泡が入らないようにコームを差し込み、室温で 30分間ほど静置したO 濃縮ゲ、ノレが固まっているのを確認した後、ゲ、ル板のクリップとシリコンパッキン、コームを外したO ゲ、ノレ板を内部泳動槽にセットし、ワェルを電気泳動用緩衝液で洗った後、内部泳動槽を外部泳動槽にセットし、両泳動槽に電気泳動用緩衝液を注ぎ入れ、 (1)で調製したサンプノレを 1 ウェルに 10μLずつアプライし、リアノレパワーBP“5型(バイオクラフト株式会社、

(16)

第5辛苦東京)を用いて、一枚のゲルあたり 20mAの定電流で、約 1時間電気泳動を行ったO (3)セミドライ式ウエスタンプロット {試薬} @ セミドライ式転写用緩衝液 :Tris 1.5g、グリシン 7.2g、SDSO.lgを純水で溶解し、 500mLにした。 10 X TBS : Tris 12.11g、塩化ナトリウム 29.23g、EDTA3.72gを純水で溶解し、濃塩酸を用いて pHを 7.2に合わせて、 1Lにしたo ・ TBS-T.: 10 X TBSを 100mLとり、純水で 1Lにして撹持した。さらに、ポリオキシエチレン (20) ソノレピタンモノラウレートを 1mL加えよく撹持したO ブロッキング溶液 : スキムミルク粉末 ( 生化学用 )5gに TBS-T100 mL を加え撹持したO @ 一次抗体溶液 :TBS-T 10 mLに、抗 LC3B抗体 (Cell Signaling Technology、USA) 10μLとBSA(グロプリンフリー、生化学用).0.5g

を加えて撹持して調整したo

二次抗体溶液:ペノレオキシダーゼ標識抗 RabbitIgG (Stressgen、

Canada) 1μLに TBS-Tを 10m L加え、溶解したO

ECL試薬 :ECL 1液 (AmershamPharmacia Biotech) 1 m Lと ECL2

液 (AmershamPharmacia Biotech)

1

m Lを加え混和したO 現像液:レンドーノレ (FujiFilm、東京)

停止液 (3%酢酸) :酢酸 300mLを純水で 10mLにし、ポリタンクに保存した。

(17)

見亨 5若

{方法}

電気泳動終了直後のゲ、ノレをゲル板から外して、ゲルの大きさを測定し、セミドライ式転写用緩衝液に

20

分以上浸したo

PVDF

膜

(Hybond-P

、

Amersham Biosciences

、

UK)

をゲノレと同じ犬きさにきりメタノーノレに

1

分以上浸し、さらに裏返して I分以上浸したO 純水で

PVDF

膜を洗い、メタノールを洗い流した後、セミドライ式転写用緩衝液に

10

分程度浸し、裏返してさらに

10

分程度浸したO 次に転写用ろ紙

(

AmershamB

i

o

s

c

i

e

n

c

e

s

)

に

5

分間露光させたO その後、現像液にフィルムを浸しバンドが浮き出てくるまで浸け、パンド

(18)

見亨 5i/f が見えたら停止液に数秒浸け、定着液に

5

分間浸して現像を行なったO 最後に、水道水で十分にフィルムを洗浄した後、これを一晩かけて風乾じた。結果は、無タンパク質

(

P

F

)

摂食群の値を 100としたときの相対値で表した 6 統計処理本実験で測定して得られたデータの計算および整理には、 Microsoftの Excel2003を使用したO また、結果は平均値と標準誤差で示したO 異なる群間で有意差があるかどうかを検討するために、 GraphPad Instat Software Ver.2.03 (USA)を使用し、 Student

t

-

t

e

s

t

によって有意差判定をした。

(19)

第 5掌

第

3 節結果

(1)カノレパイン活性カルパイン活性は 2群間で有意な差はみられなかった。したがって、ロイシン添加食

(

L

e

u

)

の摂食により、カノレパイン活性の抑制が起こっていないと考えられる。 (Fig. 5-3) (2)プロテアソーム活性代表的なプロテアソーム活性であるキモトリプシン様活性は、 2群間で有意な差はみられなかった。したがって、ロイシン添加食

(

L

e

u

)

の摂食により、プロテアソーム活性の抑制は起こっていないと考えられる (Fig.5-4)。ここまでの結果から、カノレパインとプロテアソームの酵素活性に差が無いことから、残る分解系であるリソソーム系が無タンパク質食摂食時におけるロイシンの継続摂取による筋原線維タンパク質の分解抑制に関わっていることが示唆される。しかし、プロテアソーム系は酵素活性ではなくユピキチン化が重要な働きを担っているという報告があるため [95]、代表的ユピキチンリガーゼ、である Atrogin-lと MuRF1の遺伝子発現を測定し、より詳細にプロテアソーム系の関与を調べた。

(20)

ダ 5震 40 n u n u n M A u n u n L 内 L 4 1 4 1 室内官官制豊島田田一立与金官官時五時乱事。

。

Leu PF Fig. 5・3無タンパク質食 (PF)よあるいはロイシン添加食 (Leu)を 1週間摂食させたときの、カルパイン活性の変化値は、平均土標準誤差 (n=5) nuoO マ g 円 O R J v a

件

。

内

4 4 E n u n u n u n u n u n u n u n u n u 官官官官官昆回詰 O 宮口 } 金一﹀一言。

g

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o

t

。

Leu PF 無タンパク質食 (PF)、あるいはロイシン添加食 (Leu)を1週間摂食 Fig.5・0・させたときの、プロテアソーム活性の結果イ直は、平均土標準誤差 .(n=5)

(21)

第 5辛苦 (3)ユピキチンリガーゼの遺伝子発現ユピキチン鮒プロテアソーム系の概略を Fig.5圃5に示した。ユピキチンヴ。ロテアソーム系は、分解される基質にユピキチンが結合し、それを認識した

268

プロテアソームが分解を行うという系である。このとき律速であるのはユピキチン化であると考えられており、特にユピキンリガーゼ (E3)が重要な働きを担っているとされている O そこで\本研究では代表的なユピキチンリガーゼである Atrogin~l と MuRFlの遺伝子発現を測定した。 Atrogin-lの遺伝子発現は、ロイシン添加食 (Leu)の摂食により有意に上昇した (Fig. 5-6)0 また、 MuRFlもLeuの摂食により上昇する傾向がみられた

(

P

=

O

.

1

4 )

(Fig. 5-7)0 したがって、 Leuの摂食によりユピキチンリガーゼ、の遺伝子発現が減少しないことから、ロイシンの継続摂取による分解抑制に、ユピキチン幽プロテアソ }ム系の関与は少ないと考えられる。 (4) LC3の発現オートファジー"リソソーム系の概略図をFig.5-8に示した。この分解系は、分解されるタンパク質が固まれてオートファゴソームが形成され、そこにリソソームが結合しカテプシンにより分解される系である。この分解系の律速段階はオートファゴソームが形成される段階である。本研究では、オ}トファゴソームのマ}カータンパクである LC3の変化を検討し、その活性型である LC3-I1の発現を測定して、オートファジー-リソソーム系を評価した。

LC3-I1 の発現は、ロイシン添加食 (Leu) の摂食により顕著に減少した (Fig~ 5-9)0 したがって、ロイシンの継続摂取による分解抑制に、オートフアジ}サソソーム系が関与していることが考えられる。

(22)

-

L

t

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j

鵠ご鴇

.

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防叫幣碗の茶ム y アテロフンチキレ﹂昌伸りだ υ

g

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ぷ宇5語字

(23)

見亨5辛苦 n υ 凸 U n u n u a u a u { 比且恥 OJC nunυ の υ n U A U 凸 υ 白 u n U 8 日 τ q d q ' h d E 。話器工程︽ φ F a 口一宮お︽

。

PF Leu 無タンパク質食 (PF)ょあるいはロイシン添加食 (Leu)を 1週間摂食 Fig.5・6 させたときの、 Atrogin~l の遺伝子発現の変化値は、平均士標準誤差 (n=5)oPF群に対する有意差 * : p<O.05 内 u n u n u n u n u o o a u d 斗勾 ' h n υ { 比

n

z

o

J

小 } O 宮崎﹄耳口内地︽ φ

正区

3 署 80 60 40 20 Leu PF

。

無タンパク質食 (PF)、あるいはロイシン添加食 (Leu)を1週間摂食 Fig.5・7 させたときの、

MuRFl

の遺伝子発現の変化値は、平均±標準誤差 (n=5)

。

(24)

Phagophor告 Fig.5-8 オートファジー"リソソーム系の概略図 140

t

t120 o 5100 z o 的

8

_晶画盟国民 80 60

。

40 h吋 τ 陣吋 8 2 0 」

。

PF Leu 第:5辛苦 Autophago事。間患 A日tophagolysosome Fig.5・9 無タンパク質食 (PF)、あるいはロイシン添加食 (Leu)を1週間摂食させたときの、 LC3-I1発現の変化値は、平均土標準誤差 (n=4-引o PF群に対する有意差 *: p<O.05

(25)

ダ 54f

第 4節考察

筋原線維タンパク質の分解は、まずカルパインが筋原線維の

Z

帯のタイチンを切断し、ミオシンフィラメントとアクチンフィラメントを遊離し、次にユピキチンm プロテアソーム系によりさらに小さいペプチドにまで分解し、オートファジーサソソーム系によってアミノ酸にまで分解されるというメカニズムが考えられている (Fig.5圃

1 )

0

本章では、本論文の 3章でみられた、ロイシンの継続的な摂取による筋原線維タンパク質の分解抑制が、どのような作用機序で起こるのかを解明することを目的とし、各タンパク質分解系の変化を調べた。カノレパインは、カノレシウムにより活性化され、カルシウムの濃度によってそれぞれ感受性が異なる μ闘力ノレパインと m剛カルパインが存在する [5610また、細胞内にはカルパインの内因性のインヒピターであるカルパスタチンが存在し、カノレパ'インはカルシウムイオンとカノレパスタチンにより活性が調節されている [57]。カルパインの基質特異性は非常に高く、カゼインの他、細胞骨格タンパク質、膜タンパク質を主に分解すると考えられている [58]。骨格筋に関しては、筋原線維タンパク質を構成する、サルコメアを区切っている

Z

帯のタイチンの分解に関与していることが知られている [59-61]。カルパイン活性はインヒピターや、低分子基質などを用いて評価する方法があるが、本実験では、排腹筋中の活性をアゾカゼインを基質として測定し評価した。その結果、ロイシン添加食の摂食によりカルパイン活性が減少する傾向はみられなかった。したがって、ロイシンの摂食による分解抑制にカルパインはあまり関与しないことが示唆された。しかし先に述べたとおり、カノレパインは、カノレシウムの濃度によって感受性が異なる μ闘カルパインと m-カルパインが存在しているので、これらを区別して検討しなければならない。 Nakashimaら [96] は、ヒヨコにロイシンを経口投与して、筋原線維タンパク質の分解速度が減少することを示し、さらに筋肉中のm圃カノレパインの遺伝子発現が減少することを報告している。また、 Duら [97]は、カノレパインがインヒピターであるカノレパスタチンにより強く制御されていることを報告しており、本実験の測定項目だけでは、ロイシンによる筋原線維タンパク質の分解抑制に、カノレパインが全く関与しないとは断言で

(26)

ダ 5震きず、カルシウムの濃度の違いや、遺伝子発現、インヒピターの関与について、より詳細な検討を必要とする。プロテアソーム系は、 ATP依存的にユピキチン化したタンパク質を分解する 268 プロテアソームによる分解と、ATP非依存的に分解する 208プロテアソームによる分解に分けられる。 268プロテアソームは、 208プロテアソームの両端に制御サブユニットが結合したもので、この結合には ATPを必要とする。この経路の第 1段階は、基質になるタンパク質にユピキチンが結合することから始まる。次に、タンパク質と結合したユピキチンがポリユピキチン化し、このポリユピキチンを268プロテアソームの制御サブユニットが認識して、 ATP依存的に分解する。このとき、ユピキチン化に必要で、あるユピキチン活性化酵素 (ubiquitin-activatingenzyme El)、ユピキチン結合酵素 (ubiquitin.conjugating enzyme E2)、ユピキチンリガ} ゼ (ubiquitinligase E3)が働き、タンパク質と結合したユピキチンがポリユピキチン化する (Fig.5-5)0 本章では、排腹筋中のプロテアソームのキモトリプシシ様活性と、筋肉の代表的なユピキチンリガーゼである Atrogin-lとMuRFlの遺伝子発現をノーザンプロットにより測定して評価した。キモトリプシン様活性は、ロイシン添加食の摂食により減少する傾向はみられなかった。さらに、 Atrogin-lと MuRFlの遺伝子発現もロイシン添加食の摂食により、減少する傾向はみられなかった。むしろ Atrogin-lでは有意に、 M1iRFlでは有意な差ではないものの、ロイシン添加食の摂食により遺伝子発現が上昇する結果が得られた。筋原線維タンパク質の分解速度は、ロイシン添加食の摂食により減少していたので(第3章 Fig.3帽2 (A))、プロテアソーム活性およびユピキチンリガーゼの遺伝子発現の結果とは異なっている。すなわちロイシン添加食の摂取は、ユピキチンリガーゼ、の遺伝子発現とは独立して分解速度を抑制していると考えられる。本章で、ロイシ・ン添加食の摂食によりユピキチンリガーゼの遺伝子発現が上昇した理由は不明で、あるo Frostら [98]はラットに、骨格筋タンパク質の顕著な分解が認められる敗血症を誘導させ、筋肉中のAtrogin-l"MuRFlの遺伝子発現が顕著に上昇することを示している。一方、 Varyら [99]の報告では、ラットにアノレコーノレを摂取させることにより、筋肉中のAtrogin-lとMuRFlの遺伝子発現が増加することを示している、一方、その

(27)

ダ 5寧とき骨格筋タンパク質の分解速度は変化しないことを示しており、ユピキチンリガーゼの遺伝子発現と分解速度の結果が、一致しないことがあることを示した。したがって、分解速度とユピキチンリガーゼの遺伝子発現は、必ずしも同様の変化をしないと考えられる。プロテアソーム系の律速段階は、標的となるタンパク質にユピキチンが結合する段階と考えられているため [95]、ユピキチンが結合したタンパク質を測定することでプロテアソーム系を評価できると考えられる。菅原 [67]は・、ユピキチン化タンパク質量をウエスタンブロットにより測定し、ロイシンの摂食で、ユピキチン化タンパク質量が減少しないことを示した。したがって、ロイシンの摂食によりキモトリプシン様活性が減少しないこと、ユピキチンリガーゼの遺伝子発現が減少しないことから、ロイシンの継続摂取による分解抑制に、ユビ、キチンfフ。ロテアソーム系の関与は少ないと考えられるO したがって、ユピキチンリガーゼは本章の研究のように低栄養状態ではなく、激しい異化状態を示す病態などにおいて重要な働きを担っていると考えられるO また、本章の結果で、ロイシンの投与で Atrogin回1の遺伝子発現は5倍程度に上昇したのに対して、MuRF1はそれほど大きな変化をしなかった。 Frost[98]は、敗血症のラットに1G F-bindingprotein -3を投与し、 Atrogin-1の遺伝子発現は顕著に減少するが、 MuRF1の発現には変化がないことを示している。したがって、この 2つのユピキチンリガーゼは異なる動きを示すことがあり、それぞれ違う働きをしている可能性が考えられる。一方、本章の結果とは異なり Combaretら [100]は、一晩絶食させたラットに 5%のロイシンが含まれた食餌を摂食させ、長指伸筋中のタンパク質のユピキチン化が阻害されることを示している。かつ、プロテアソーム系に依存する骨格筋タンパク質分解も限害されることを示し、ロイシンによる分解抑制はプロテアソーム系の関与が強いことを示唆した。本章で用いたラットは、 Combaretらが使用しているラット (8月齢、 22月齢)よりも若く、ロイシンによる分解抑制効果のメカニズムは齢により異なっている可能性が考えられる。ユピキチン化には、ユピキチンリガーゼだけでなく、ユピキチン活性化酵素 (E1)、ユピキチン結合酵素 (E2)が必要で、ある。ロイシンにより E2が阻害され、かっ、プロテアソームのサブユニットであるC2の発現量が減少するという報告もある [64]ので、ユピキチンヴ。ロテアソー

(28)

ダ 5ifi ム系を正確に評価するためには、これらを総合的に解析する必要があると考えられる。本研究では、カルパインとプロテアソームの関与が少ないことから、ロイシンの摂取による筋原線維タンパク質の分解抑制には、リソソーム系が強く関わっていることが示唆される。

K

a

d

o

w

a

k

i

ら

[

1

0

1 ]

は、肝臓において、リソソーム系によるタンパク質分解がロイシンによって調節されていることを示しており、筋肉においても同様にロイシンにより調節されている可能性がある。リソソーム系は、細胞内の小器官であるリソソーム内の酵素、カテプシンによって分解される系であり、小胞体に由来する二重膜が、細胞構成成分を取り込み、オートファゴソームを形成し、次いで、オートファゴソーム内の酸性化が起こり、さらに、カテプシンなどを含むリソソ}ムがオートファゴソームと融合し、オートリソソームとなり、タンパク質を分解する系である

(

F

i

g

.

5

・

8 )

0

長寿命タンパク質はリソソーム系の分解経路で分解されるといわれており

[

5

5 ]

、筋原線維タンパク質のように代謝速度の遅いタンパク質はリソソーム系により分解される可能性がある》この過程における律速段階はオートファゴソームを形成する段階である

[

6

2 ]

。また、オートファゴソーム形成に関わるタンパク質として、

Apg8p

の

mammalian

ホモログである

l

i

g

h

tc

h

a

i

n

3 (

L

C

3 )

が知られている

[

1

0

2 ]

0LC3

には同一遺伝子に由来し分子量の異なる二つのフォーム

LC3

圃

1(

1

8 k

D

a

)

、

LC3

・

I

I(

1

6 k

D

a

)

が存在する。

LC3-1

と

L

C

3 -

I

は細胞内分布が異なり、前者が

1

0

，

0

0 0g

超遠心の上滑に回収されるのに対し、後者は沈殿に現れる。細胞分商法と免疫電子顕微鏡法により、

I

に転換され、オートファゴソーム膜に結合する。

LC3-1

から

LC3

嗣 Eへの転換がどのようなものかは、はっきりしていない

[

1

0

3 ]

0LC3

は脳細胞で同定され

[

1

0

4 ]

、肝細胞などごく一部の細胞でしか見つかっていなかったが、骨格筋においても

LC3

の存在が発見され

[

1

0

1 ]

、

LC3

が骨格筋においてオートファジーのマーカーとなることが示唆された。

Y

o

s

h

i

m

o

r

i[

1

0

3 ]

は、筋肉中に存在する

LC3

・Hの量を測定することでオートファゴソーム形成を定量的に追えることを示唆し、オートファジーのマー

1

の発現は顕著に減少した。したがって、本論文の

3

章でみられた、ロイシンによる筋原線維タンパク質の分解抑制効果は、オートファジー-リソソーム系を阻害したことによるものと考えられる。 Mordierら [105]は、マウスの

C2C12

筋管細胞を用いた実験より、ロイシンによる分解抑制に、プロテアソーム系は関与しないことを示し、リソソーム系が強く関わっていることを報告しており、本章の実験結果を支持している。以上から、カノレパインとプロテアソームの酵素活性、ユピキチンリガーゼである Atrogin-1、MuRF1の遺伝子発現が、ロイシン添加食の摂食により減少しないことカ瓦ら、低栄養状態におけるロイシンの摂取による筋原線維タンパク質の分解抑制に、カルパインとユピキチン圃フ。ロテアソーム系の関与は少ないと考えられる。一方、オートファジーのマーカ)タンパクである

LC3

の活性型の

L

C

3 -

I

1

の発現が、ロイシ，ン添加食の摂取により顕著に減少したことから、ロイシンによる分解抑制には、オートファジーサソソーム系の制御が重要な働きを担っていると考えられる。本章で測定した

LC3

は、肝臓で、の変化についてはいくつかの報告があるが、筋肉での

LC3

の変化を調べた例は非常に少なく、この実験結果はきわめて重要な知見である。

(30)

五亨6若

第

6 章

低温状態における骨格筋タンパク質の合成と

分解の変化

第

1 節目的

前章までの結果より、ロイシンの継続的な摂取により、オートファジーが阻害され筋原線維タンパク質の分解を抑制し、無タンパク質摂食時における筋重量の減少を抑えられることが示されたO しかし、骨格筋タンパク質の合成に関しては、ロイシンの継続摂取により上昇するという結果は得られなかったO 骨格筋の量は骨格筋タンパク質の分解だけではなく、合成とのバランスにより決まっている [36]。したがって筋萎縮をより効率的に改善、予防するためには、分解を抑制するだけではなく、合成も促進する必要があると考えられるO 骨格筋タンノミク質の合成を活性化させる因子として、インスリンや成長ホルモンなどが知られているO インスリンは細胞膜上の insulin receptor (IR) に結合し、 insulin receptor substrate -( IR8 )、 phosphatidyl inositol圃3咽kinase(PI3-K)、proteinkin

.

a

seB (PKB)、mammaliantarget

of rapamycin (mTOR)を経由して、ータンパク質合成のシグナノレ伝達物質である p70 86 kinase-1 (86Kl)と、翻訳開始因子である eukaryotic initiation factor 4E (eIF-4E) を阻害している eIF-4E-bindingprotein-1 (4E圃BP1) を活性化し [73]、骨格筋タンパク質合成を活性化させることが知られている (Fig.6・1)。 Yoshizawaら [45・47]は、ロイシンの摂取により、骨格筋タンパク質の合成が促進することを示しているO ロイシンはインスリンの分泌を促進することが知られているが [106，107]、インスリンの分泌が起こらない 1型糖尿病のラットにロイシンを与えても、骨格筋タンパク質合成のシグナノレが活性化する [108] ことより、ロイシンはインスリンとは独立して、骨格筋タンパク質合成を促進していると考えられる (Fig.6・1)0 しかし、こ

(31)

ゑ亨6ft の合成促進の効果は、長時間の絶食の後にロイシンを大量摂取したことによる結果であり、本研究で行ったような通常の自由摂食においては、同様の効果は得られないことを示した。また、分岐鎖アミノ酸代謝の最初の段階は、共通の酵素が関与しているため、ロイシンの摂取は、他の分岐鎖アミノ酸であるバリン、イソロイシンの血中濃度を減少させることが知られている [85]。そのため、ロイシン単独の大量摂取はアミノ酸アンバランスを引き起ニし、インバランスを起こす可能性があるo したがって、人間に応用することはリスクが高いと示唆されるO そこで、本章では食事因子以外で骨格筋タンパク質の合成を促進できないかを検討したo'Lehrら[109]は、マウスを低温状態 (6 0 C)で飼育すると、褐色脂肪組織において uncouplingprotein-1 (UCP・1) の発現が上昇するが、同時に 4E旬BP1の発現量 ( 遺伝子発現、タンパク ) が減少することを報告している0.4E-BP1は翻訳開始因子である eIF-4Eを負に制御しているも-のなので、 4E-BP1が減少することにより、タンパク質の合成が促進する可能性があるo しかし、筋組織においての変化は不明であるため、同様の効果が筋肉内でもみられるかは不明であるO 本章では低温状態によって褐色脂肪組織と同様に筋組織においても 4E-BP1が減少することを期待し、実験を行ったO なお、本章の研究は岩手大学 21世紀 COEプログラム「熱鋼生命システム相関学拠点創生Jの一環として行ったものであるO

(32)

A 亀 h e h 喝ゐ '

•

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-••

-e 第6震 Fig.6・1インスリン、あるいはロイシンによるタンパク質合成活性のシグナルの概略

.

" .. - q "e ".IIlr .. .‘.，..，

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骨噺時期 1 t

1

購

i

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(33)

ダ 6窒

第

2 節方法

1.動物実験実験動物として 4 週齢の Wistar 系雄ラット (60~80g 、日本エスエノレシー株式会社:浜松)10匹を用いた。ラットは個別のステンレスケージに入れ、湿度 50+10%、午前 6時から午後 6時までの 12時間明暗サイクノレで飼育したO 水は水道水を自由飲水させたO 飼料は固形飼料 (日本クレア株式会社)を与えた己最初の 3日間は室温 220 Cで飼育して、この時点でほぼ体重が等しくなるように 3群に分けて、 3匹を屠殺解剖した。次の 2 日間は 100 Cで飼育し、 4匹を屠殺解剖したO さらに 3日間 22 0 Cで飼育して、残りの 3匹を屠殺解剖した (Fig.6・

2 )

0

解剖日は、ケタラール(三共エール薬品株式会社、東京)とセラクタール

(Baye

士、ドイツ)を 100: 16の割合で混合し、体重 100gあたり 188μL腹腔内投与してラッドを麻酔した。麻酔が効いてきたら、骨格筋タンパク質の合成速度を測定するために、体重 100gあたり 50μmolのL幽[2H5]・フェニルアラニン (28.4mg/mL) を尾静脈より投与したo L-[2H5]・フsエニルアラニンの投与 30'"'-'40分後、開腹して下大静脈からヘパリン処理した注射器で採血し、屠殺した。即座に長指伸筋、ヒラメ筋、足底筋、排腹筋を摘出したO 摘出した全ての筋肉の重量を測定し、排腹筋は合成速度の測定、ユピキチンリガーゼ、の遺伝子発現、 S6K，.1 4E-BP1の測定に使用したO 血液は、 3，000X g、4

o

t

r

o

g

i

n

-

l

" MuRFl)

の遺伝子発現がどのように変化するかを検討した。遺伝子発現の検出は、第 5章一第 2節-4と同様に行ったO

→￨鯛

トーー剖 4

解

Fig.6

蝿

2

解剖スケジューノレ

(35)

見亨6掌 7. S6K1の検出方法タンパク質の合成翻訳段階に関わる因子の一つである S6K1をウエスタンプロットで検出したO (1)試料の調製本実験では、試料の調製中に S6K1がプロテアーゼにより分解されてしまわないように、ホモジナイズ用緩衝液中にプロテアーゼの阻害剤であるフェニルメチノレスルホニルフノレオリド (PMSF) を加えてホモジナイズしたo ホモジナイズ緩衝液の調製法は以下の通りであるO 他の試薬は第 5章一第

2

節

-5

と同様である。 {試薬} • PMSF溶液 : フェニノレメチノレスルホニノレブノレオリド 1.74mgにエタノールを 100IlL加え溶解したO ホモジナイズ用保存液 HEPES( 同仁化学研究所株式会社、熊本 ) 4.76g、EGTA(東京化成工業株式会社、東京) 0.761g、フッ化ナトリウム 2.1g、塩化カリウム 7.46g、EDTA0.074g、

0

・グリセロリン酸ナトリウム n水和物 10.8gに、純水を 900niL程度加えて溶解し、 pHを 7.4に調製した後、 1Lにし、 40 Cで保存したO ホモジナイズ用緩衝液 : ホモジナイズ用緩衝液 50mLあたり、 PMSF 溶液を 50μL、ベンズアミジン塩酸塩 n水和物を 7.5 mg、0・パナジン酸ナトリウムを 4.6mg、ジチオスレイトール 7.7mgを加え溶解し、ホモジナイズ緩衝液としたO ホモジナイズ用緩衝液は、実験直前に調製した。 [方法} ラットの右脚の排腹筋の重量を測定し、 7倍量の氷冷したホモジナイズ

(36)

ダδ若緩衝液を加え、ホモジナイザー (Kinematika GmbH Steinhofhalde Switzerland)を用いて、氷冷しながら 30秒間 (10秒

x

3)ホモジナイズしたO この慮、濁液を 10

，

000X g、4 0 Cで 10分間遠心分離したO この上清 100 IlL に 2Xサンフ。ル緩衝液を 100μL加え、混和後、ブロックヒーター (HDB-1N、アズワン、大阪 ) で 1000 Cで 5分間加熱じ、放冷後九回800 Cでマ保存した。 (2) SDS町PAGE 使用じた試薬は第 5章一第 2節-5と同様であるO {方法} 分離ゲルは 7.50/0となるようにしたo 7.5%の分離ゲルは、 A液を 6m L、 C液を 6mL、純水を 12mL、10%APSを 90μL、TEMED30 ~L を撹持して作成したO 濃縮ゲノレは濃縮ゲノレ溶液 9 mLに 100loAPS 54ドL と TEMED 36μLを加え撹祥し作成したOアプライ量は 1ウェルあたり 40μL としたo その他の条件等は第 5章一第 2節 -5と同様にして行ったO (3)タンク式ウエスタンブロット S6K1の検出は、タンク式のウエスタンプロットを用いて測定したO 転写用緩衝液は以下のものを用いたO [試薬] ・ 10 X 転写用緩衝液 (S6K1~ 4E-BP1用):N シクロヘキシノレ倒3-アミノプロパンスルホン酸 (CAPS) ( 向仁化学研究所株式会社、熊本 ) 22.13g を純水に溶解し、 2MNaOH、で pHを 11.0に調整した後、純水で lLとし、 40 Cで保存したO ・ブロッキング溶液:スキムミノレク粉末(生化学用)3gに TBS-T100 m L を加え溶解したO

(37)

ダ 6J!f

・ S6K1用一次抗体溶液 : 抗 S6K1ポリクロ } ナル抗体 (Stressgen、

Canada) 80μLに TBS-T20 mLを加え、溶解したO

- 二次抗体 : ベルオキシダーゼ標識抗 RabbitIgG (Stressgen、Canada) 2μLに TBS-Tを 20mL加え、溶解したO その他の試薬は 5章一第 2節-5と同様であるO {方法] 転写用緩衝液は、実験当日に、 10X転写用緩衝液 (S6K1，4E-BP1用) 400mL、メタノール 400mL、純水 3200mLを混合し、使用する直前までどCに保存Lておいたo PVDF膜はメタノーノレに 1分以上浸し、裏返してさらに 1分以上浸したO 純水ですすいでメタノールを洗った後、純水で 5 分間振とう、さらに転写用緩衝液中で 10分以上振とうし、裏返してさらに 10分以上振とうしておいたO 電気泳動が終わった後、速やかに分離ゲノレを取り出し、転写用緩衝液に浸し 15分間以上穏やかに振とうした。次に、ブロッティング装置のゲルホルダーを転写用緩衝液が入っている大きめのパットに黒色が下になるように開いて置き、その上にスポンジシートを乗せたo さらにその上にろ紙、ゲル、 PVDF膜、ろ紙、スポンジの1)買に転写用緩衝液中で重ね、ゲノレホノレダーに挟んでタンク式のブロッティング装置 (BE-350W型、バイオクラフト株式会社 ) にセットしたO リアノレパワーBP-4型 ( バイオクラフト株式会社 ) を用いて 50Vの定電圧で 45分間転写を行ったO 転写後、 PVDF膜をブロッキング溶液 (3%スキムミノレク溶液)に浸し、室温で一晩ブロッキングしたO ブロッキングが終了した膜を TBS-Tで 5 分間 X2回振とうし、転写用緩衝液が膜に残らないようしたO その後、 PVDF膜を一次抗体溶液と 1時間反応させたO反応後、一次抗体を回収し、 TBS-Tで 2回すすいだ後、 TBS-Tで 5分間 X2凹振とうし、洗浄したO 次に、二次抗体溶液を加え、 1時間反応させた。反応終了後、 TBS-Tで2回

(38)

見亨6震

すすいだ後、新しい TBS-Tで初回は 15分間振とうし、その後、 5分おきに 4回 TBS-Tを交換したO 洗浄後、膜全体に均ーになるように ECL試薬

2mLを加え、 1分間反応させた。 1分後、膜を取り出し、プラスチック板の上に膜をおき、その上に塩化ピニル樹脂製のフィルムをかぶせた。これを暗室で ECL 専用感光フィノレム (Hyperfilm;ECL、Amersham Biosciences)に3分間露光させたO その後、フィルムを現像液に 90秒間、停止液に 60秒間定着液に 5分間浸して現像を行い、最後に水道水で十分にフィルムを洗浄した後これを一晩かけて風乾したO 8. 4E-BP1の検出方法タンパク質合成の翻訳段階に関わる因子の一つである 4E-BP1をウエスタンプロットで検出したO (1)試料の調製 S6K1の調製法と同様に、ホモジナイズ用緩衝液中に PMSF溶液を加えてホモジナイズしたO 使用した試薬は前述した S6K1と同様であるO {方法} ラットの右脚の緋腹筋の重量を測定し、 7倍量の氷冷したホモジナイズ緩衝液を加え、ホモジナイザー (KinematikaGmbH Steinhofhalde、 Switzerland) を用いて、氷冷しながら 30秒間ホモジナイズ (10秒

x

3) したO この懸濁液を 10，000X g、4 0 Cで 10分間遠心分離し、上清 200μL をブロックヒーターで 1000 C、10分間加熱し、放冷した後 10，000X g、40 C で 30分間遠心分離し、この上清 100μLに 2Xサンフ。ノレ緩衝液を 100μL 加え、混和後O ブロックヒーター (HDB-1N、アズワジ、大阪)で 100 0 C、 5分間加熱し、放冷後、 -800 Cで保存した。

ペプチド(アミノ 酸 残 基 7~8 個 )

第

5章

ロ イ シ ン の 摂 食 に よ る 筋 原 線 維 タ ン パ ク 質 分 解

抑 制 メ カ ニ ズ ム の 検 討

第

1

節 目 的

5

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ペプチド(アミノ酸残基 7~8 個 )

ロイシンの摂食による筋原線維タンパク質分解

抑制メカニズムの検討

節目的