ダ 6窒
ゑ亨6窒
た 血 疑 中 の MeHis濃 度 を 測 定 し たo MeHis濃 度 の 測 定 法 は 、 第 3章幽第 2
節‑2(2)と 同 様 で あ るo
3.骨 格 筋 タ ン パ ク 質 の 合 成 速 度 測 定 方 法
温 度 変 化 に よ り 、 骨 格 筋 タ ン パ ク 質 の 合 成 速 度 に 変 化 が あ る か を 検 討 し た 。 合 成 速 度 の 算 出 法 等 は 、 第 3章 一 第 2節目 3と 同 様 で あ るO
4.血 禁 中 の 分 岐 鎖 ア ミ ノ 酸 濃 度 の 測 定 方 法
温 度 変 化 に よ り 、 血 築 中 の 分 岐 鎖 ア ミ ノ 酸 濃 度 が ど の よ う に 変 化 し て い る か を 検 討 し たO 血 築 中 の 分 岐 鎖 ア ミ ノ 酸 濃 度 の 定 量 は 第 3章 一 第 2節 ‑ 4と同様の方法で行った。
5.血 築 中 の イ ン ス リ ン 濃 度 の 測 定 方 法
温 度 変 化 に よ り 、 血 疑 中 の イ ン ス リ ン 濃 度 が ど の よ う に 変 化 す る か を 検 討した o 血竣中のインスリン濃度の測定は、第 3 章一第 2 節 ~5 と同様に 行 っ たO
6.ユピキチンリガーゼ、の遺伝子発現の検出
温 度 変 化 に よ り 、 筋 肉 中 の ユ ピ キ チ ン リ ガ ー ゼ (Atrogin‑l" MuRFl)
の 遺 伝 子 発 現 が ど の よ う に 変 化 す る か を 検 討 し た 。 遺 伝 子 発 現 の 検 出 は 、 第 5章 一 第 2節‑4と 同 様 に 行 っ たO
→￨鯛
トー ー 剖
4解
Fig.6蝿2解剖スケジューノレ
見亨6掌
7. S6K1の 検 出 方 法
タ ン パ ク 質 の 合 成 翻 訳 段 階 に 関 わ る 因 子 の 一 つ で あ る S6K1をウエス タ ン プ ロ ッ ト で 検 出 し たO
(1)試 料 の 調 製
本 実 験 で は 、 試 料 の 調 製 中 に S6K1が プ ロ テ ア ー ゼ に よ り 分 解 さ れ て し ま わ な い よ う に 、 ホ モ ジ ナ イ ズ 用 緩 衝 液 中 に プ ロ テ ア ー ゼ の 阻 害 剤 で あ る フェニルメチノレスルホニルフノレオリド (PMSF) を 加 え て ホ モ ジ ナ イ ズ し たo
ホ モ ジ ナ イ ズ 緩 衝 液 の 調 製 法 は 以 下 の 通 り で あ るO 他 の 試 薬 は 第 5章 一 第 2節‑5と同様である。
{試薬}
• PMSF溶 液 : フェニノレメチノレスルホニノレブノレオリド 1.74mgにエタノ ー ル を 100IlL加 え 溶 解 し たO
ホ モ ジ ナ イ ズ 用 保 存 液 HEPES( 同 仁 化 学 研 究 所 株 式 会 社 、 熊 本 ) 4.76g、EGTA(東京化成工業株式会社、東京) 0.761g、フッ化ナトリ
ウム 2.1g、 塩 化 カ リ ウ ム 7.46g、EDTA0.074g、
0
・グリセロリン酸ナ トリウム n水 和 物 10.8gに、純水を 900niL程度加えて溶解し、 pHを 7.4に調製した後、 1Lにし、 40Cで 保 存 し たOホ モ ジ ナ イ ズ 用 緩 衝 液 : ホ モ ジ ナ イ ズ 用 緩 衝 液 50mLあたり、 PMSF 溶 液 を 50μL、 ベ ン ズ ア ミ ジ ン 塩 酸 塩 n水 和 物 を 7.5 mg、0・パナジン 酸 ナ ト リ ウ ム を 4.6mg、 ジ チ オ ス レ イ ト ー ル 7.7mgを加え溶解し、ホ モ ジ ナ イ ズ 緩 衝 液 と し たO ホ モ ジ ナ イ ズ 用 緩 衝 液 は 、 実 験 直 前 に 調 製 し た。
[方法}
ラットの右脚の排腹筋の重量を測定し、 7倍 量 の 氷 冷 し た ホ モ ジ ナ イ ズ
ダδ若
緩 衝 液 を 加 え 、 ホ モ ジ ナ イ ザ ー (Kinematika GmbH Steinhofhalde Switzerland)を 用 い て 、 氷 冷 し な が ら 30秒 間 (10秒
x
3)ホ モ ジ ナ イ ズしたO この慮、濁液を 10，000X g、40Cで 10分 間 遠 心 分 離 し たO この上清 100 IlL に 2Xサンフ。ル緩衝液を 100μL加 え 、 混 和 後 、 ブ ロ ッ ク ヒ ー タ ー
(HDB‑1N、 ア ズ ワ ン 、 大 阪 ) で 1000Cで 5分間加熱じ、放冷後九回800Cでマ 保存した。
(2) SDS町PAGE
使 用 じ た 試 薬 は 第 5章 一 第 2節‑5と同様であるO
{方法}
分 離 ゲ ル は 7.50/0と な る よ う に し たo 7.5%の分離ゲルは、 A液 を 6m L、 C液 を 6mL、 純 水 を 12mL、10%APSを 90μL、TEMED30 ~L を撹持
して作成したO 濃縮ゲノレは 濃縮ゲノレ溶液 9 mLに 100loAPS 54ドL と TEMED 36μLを 加 え 撹 祥 し 作 成 し たOア プ ラ イ 量 は 1ウェルあたり 40μL
としたo そ の 他 の 条 件 等 は 第 5章 一 第 2節 ‑5と 同 様 に し て 行 っ たO
(3)タ ン ク 式 ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト
S6K1の 検 出 は 、 タ ン ク 式 の ウ エ ス タ ン プ ロ ッ ト を 用 い て 測 定 し たO 転 写 用 緩 衝 液 は 以 下 の も の を 用 い たO
[試薬]
・ 10 X 転写用緩衝液 (S6K1~ 4E‑BP1用):N シクロヘキシノレ倒3‑ア ミ ノ プ ロ パ ン ス ル ホ ン 酸 (CAPS) ( 向 仁 化 学 研 究 所 株 式 会 社 、 熊 本 ) 22.13g を純水に溶解し、 2MNaOH、で pHを 11.0に 調 整 し た 後 、 純 水 で lLと
し、 40Cで 保 存 し たO
・ブロッキング溶液:スキムミノレク粉末(生化学用)3gに TBS‑T100 m L を 加 え 溶 解 し たO
ダ 6J!f
・ S6K1用 一 次 抗 体 溶 液 : 抗 S6K1ポ リ ク ロ } ナ ル 抗 体 (Stressgen、 Canada) 80μLに TBS‑T20 mLを 加 え 、 溶 解 し たO
‑ 二 次 抗 体 : ベ ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 抗 RabbitIgG (Stressgen、Canada) 2μLに TBS‑Tを 20mL加 え 、 溶 解 し たO
そ の 他 の 試 薬 は 5章 一 第 2節‑5と同様であるO
{方法]
転写用緩衝液は、実験当日に、 10X転 写 用 緩 衝 液 (S6K1，4E‑BP1用) 400mL、 メ タ ノ ー ル 400mL、純水 3200mLを 混 合 し 、 使 用 す る 直 前 ま で どCに保存Lて お い たo PVDF膜はメタノーノレに 1分 以 上 浸 し 、 裏 返 し て さらに 1分 以 上 浸 し たO 純 水 で す す い で メ タ ノ ー ル を 洗 っ た 後 、 純 水 で 5 分 間 振 と う 、 さ ら に 転 写 用 緩 衝 液 中 で 10分 以 上 振 と う し 、 裏 返 し て さ ら
に 10分 以 上 振 と う し て お い たO 電 気 泳 動 が 終 わ っ た 後 、 速 や か に 分 離 ゲ ノレを取り出し、転写用緩衝液に浸し 15分 間 以 上 穏 や か に 振 と う し た 。 次 に 、 ブ ロ ッ テ ィ ン グ 装 置 の ゲ ル ホ ル ダ ー を 転 写 用 緩 衝 液 が 入 っ て い る 大 き め の パ ッ ト に 黒 色 が 下 に な る よ う に 開 い て 置 き 、 そ の 上 に ス ポ ン ジ シ ー ト を乗せたo さらにその上にろ紙、ゲル、 PVDF膜 、 ろ 紙 、 ス ポ ン ジ の1)買に 転写用緩衝液中で重ね、ゲノレホノレダーに挟んでタンク式のブロッティング 装 置 (BE‑350W型 、 バ イ オ ク ラ フ ト 株 式 会 社 ) に セ ッ ト し たO リアノレパ ワーBP‑4型 ( バ イ オ ク ラ フ ト 株 式 会 社 ) を 用 い て 50Vの 定 電 圧 で 45分 間 転 写 を 行 っ たO
転写後、 PVDF膜 を ブ ロ ッ キ ン グ 溶 液 (3%スキムミノレク溶液)に浸し、
室 温 で 一 晩 ブ ロ ッ キ ン グ し たO ブ ロ ッ キ ン グ が 終 了 し た 膜 を TBS‑Tで 5 分 間 X2回 振 と う し 、 転 写 用 緩 衝 液 が 膜 に 残 ら な い よ う し たO その後、
PVDF膜 を 一 次 抗 体 溶 液 と 1時 間 反 応 さ せ たO反応後、一次抗体を回収し、
TBS‑Tで 2回すすいだ後、 TBS‑Tで 5分間 X2凹振とうし、洗浄したO 次 に、二次抗体溶液を加え、 1時間反応させた。反応終了後、 TBS‑Tで2回
見亨6震
す す い だ 後 、 新 し い TBS‑Tで初回は 15分間振とうし、その後、 5分おき に 4回 TBS‑Tを交換したO 洗 浄 後 、 膜 全 体 に 均 ー に な る よ う に ECL試 薬 2mLを加え、 1分間反応させた。 1分 後 、 膜 を 取 り 出 し 、 プ ラ ス チ ッ ク 板 の 上 に 膜 を お き 、 そ の 上 に 塩 化 ピ ニ ル 樹 脂 製 の フ ィ ル ム を か ぶ せ た 。 こ れ を 暗 室 で ECL 専 用 感 光 フ ィ ノ レ ム (Hyperfilm;ECL、Amersham Biosciences)に3分 間 露 光 さ せ たO その後、フィルムを現像液に 90秒間、
停 止 液 に 60秒 間 定 着 液 に 5分 間 浸 し て 現 像 を 行 い 、 最 後 に 水 道 水 で 十 分 に フ ィ ル ム を 洗 浄 し た 後 こ れ を 一 晩 か け て 風 乾 し たO
8. 4E‑BP1の 検 出 方 法
タ ン パ ク 質 合 成 の 翻 訳 段 階 に 関 わ る 因 子 の 一 つ で あ る 4E‑BP1をウエス タ ン プ ロ ッ ト で 検 出 し たO
(1)試 料 の 調 製
S6K1の 調 製 法 と 同 様 に 、 ホ モ ジ ナ イ ズ 用 緩 衝 液 中 に PMSF溶 液 を 加 え て ホ モ ジ ナ イ ズ し たO 使 用 し た 試 薬 は 前 述 し た S6K1と同様であるO
{方法}
ラットの右脚の緋腹筋の重量を測定し、 7倍 量 の 氷 冷 し た ホ モ ジ ナ イ ズ 緩 衝 液 を 加 え 、 ホ モ ジ ナ イ ザ ー (KinematikaGmbH Steinhofhalde、 Switzerland) を 用 い て 、 氷 冷 し な が ら 30秒 間 ホ モ ジ ナ イ ズ (10秒
x
3)したO この懸濁液を 10，000X g、40Cで 10分 間 遠 心 分 離 し 、 上 清 200μL を ブ ロ ッ ク ヒ ー タ ー で 1000C、10分間加熱し、放冷した後 10，000X g、40C で 30分 間 遠 心 分 離 し 、 こ の 上 清 100μLに 2Xサンフ。ノレ緩衝液を 100μL 加え、混和後O ブ ロ ッ ク ヒ ー タ ー (HDB‑1N、アズワジ、大阪)で 1000C、 5分間加熱し、放冷後、 ‑800Cで保存した。
ダ 6窒
(2) SDS圃PAGE
使 用 し た 試 薬 は 第 5章 一 第 2節‑5と 同 様 で あ るO
[方法}
分 離 ゲ ル は 15%と な る よ う に し たo 15%の分離ゲ、ノレは、 A液 を 6mL、C 液 を 12m L、 純 水 を 6mL、10%APSを 90μL、TEMED30μLを 撹 持 し て 作 成 し たO濃縮ゲノレは、濃縮ゲ、ル溶液 9mLに 10%APS54μLとTEMED 36μLを 加 え 撹 持 し 作 成 し たOア プ ラ イ 量 は 1ウェノレあたり 40μLとした。
その他の条件等は、第 5 章一第 2 節 ~5 と同様にして行った。
(3)タ ン ク 式 ウ エ ス タ ン プ ロ ッ ト
使 用 し た 試 薬 は 、 一 次 抗 体 の 試 薬 を 除 い て 、 前 述 し た S6K1の 測 定 法 と 同 様 で あ るo ウ エ ス タ ン プ ロ ッ ト お よ び 、 転 写 後 の 二 次 抗 体 に よ る 検 出 方 法 も S6K1と 同 様 で あ るO
[試薬]
・ 4E‑BP1用 一 次 抗 体 溶 液 : 抗4E‑BP1ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 (SantaCruz Biochem、USA)2'5μLに TBS‑T20 mLを 加 え 溶 解 し たo
9.統 計 処 理
本 実 験 で 測 定 し て 得 ら れ た デ ー ダ の 計 算 お よ び 整 理 に は 、 Microsoftの Exce12003を 使 用 し たO ま た 、 結 果 は 平 均 値 と 標 準 誤 差 で 示 し たO 異 な る 群 聞 で 、 有 意 差 が あ る か ど う か を 検 討 す る た め に 、 GraphPad Instat Software Ver.2.03 (USA)を 使 用 し " Student t‑'testに よ っ て 有 意 差 判 定 を し たO
去す6辛苦