文系学生のための生物学教材の改良(5)アントシアニンのpHに対する反応等、溶液の色の簡易計測法 利用統計を見る

ニンのpHに対する反応等、溶液の色の簡易計測法

著者

山岡 景行

雑誌名

東洋大学紀要. 自然科学篇

号

56

ページ

111-127

発行年

2012-03

URL

http://id.nii.ac.jp/1060/00005327/

Abstract

 By the biological experiments, it is sometimes needed to examine optics properties of

substances such as the absorbance at the specifi c wavelength, and various apparatus have been developed. However, it is diffi cult to measure the color of the solution rather than the absorbance or transmission. Absorbance spectra or transmission spectra of solutions were usually measured, and the numerical data were converted into the color space index systems (e.g. L*a*b, XYZ, HV/C and others) to express the color of the solution objectively. In the author's classrooms, students have to measure the color of the solutions by some experiments such as the coloration of anthocyanins by pH, metal complex synthesis of anthocyanins, and photosynthetic pigment analysis of seaweeds. The author let students use "the Munsell system color chart" to read a color of the solution in the test tube before. A color of the solution is 'the volume color', the measurement of the HV/C value is delicate. The widespread error of the HV/C values by students was recognized, and such situation should be avoided. The author had to establish a method to measure objectively the color of the solutions by a budget as fewer as possible. A 'three stimulation type' color leader CR-11 (Konica Minolta Sensing) was chosen to measure HV/C value. As a result of examination of optics properties of 3 types of cuvettes, a cuvette of 2mm light path made of borosilicate glass was chosen as a container for measurement of the color of solutions. An adapter was devised

文系学生のための生物学教材の改良

V：アントシアニンの pH に対する反応等、

溶液の色の簡易計測法

山 岡 景 行

Improvement of Biology Teaching-Materials for

the Departments of Humanity Students

V: Simple Measurement Method of the Color of Solutions

Such as pH-dependent Reaction of Anthocyanins

Kageyuki Y

＊）

東洋大学自然科学研究室，文学部中国哲学文学科気付〒 112-8606 東京都文京区白山 5-28-20

＊）

Natural Science Laboratory, Toyo University, c/o Department of Chinese Philosophy and Literature. 28-20, Hakusan 5, Bunkyo-ku, Tokyo 112-8606, Japan

for tightly holding a cuvette between the standard white calibration plate and the stabilizing plate of CR-11. A cuvette was fi lled with the solvent to calibrate CR-11, then the solvent was changed with a sample solution. The effectiveness of the method was evaluated by using CoCl2 solution and the methanol extract of the eggplant peel colored by pH.

Keywords: 溶液の HV/C 簡易計測法

はじめに

PYREX 製ヴァイアル入りの溶液となると、基本的には、いわゆる空間色（volume color）

であり、HV/C 値には更に大きな個人差が認められた。文系の学生実験とは言え不安定な 計測は避けるべきである。溶液の色を判定するためには、本来、吸収または透過スペクト ルを計測させるべきである。しかし、半年に 2 ∼ 3 回の実験のために測定原理や機器の操 作方法を理解させ、習熟させることは容易ではない。前報（山岡、2010）で、花被の反射 スペクトル計測に用いた簡単な分光光度計でさえ、制御用のノートパソコンも含めれば学 生実験のグループ数分の予算を直ちに獲得することは難しい。  可視光線域の反射光に基づいて HV/C 値を計測するハンディーな色票計の存在を知り、 デモ機を試し、予備的検証を行った結果、工夫次第では利用可能と考えた。価格もノート パソコン 1 台分程度であることから経常の機器備品予算要求をしたところ、幸にも 9 ∼ 10 の実験グループで同時使用できる台数を入手できることになり、本格的に使用法を検 討する必要を生じた。基本的には拡散反射光を計測する装置であり、学生が実験に使用す るガラス製のスクリュー栓ヴァイアルに入れた溶液の反応色をそのまま計測しようとすれ ば、反射光が不十分で、測定不能である。そこで、分光光度計用キューベットに入れ、背 景に然るべき反射板を置けば計測できると考え、試行錯誤の末に一定の方法に行き着いた。 小林（2011）は紅茶の色彩、特に白いカップに入れた紅茶について液層の透過光と反射光 の総合的検討をしている。この分野で全くの素人である筆者が試行錯誤してきた方法が、 あながち見当外れではないことに意を強くし、色票計を用いた anthocyanin の溶液の反応 色等を計測する方法の概容を記録しておくことにした。

材料と方法

材料

 色を持つテスト用溶液として CoCl2 1M 水溶液とその 1/2、1/4、1/8 希釈液を使用した。

Anthocyanin の抽出素材はナス（Solanum melongena）の果皮乾燥粉末である。山岡（2008）

の方法で 50％ methanol 抽出を行い、3,000rpm で 3 分間遠心した上澄液を素抽出液とした。 0.5ml の素抽出液を 2.5ml の Briton-Robinson buffer に加えて pH を 2 ∼ 12 に調整した（山 岡、2007、2008）。

測定機器等

測定方法等

結果と考察

1. 測定条件の検討

試料の交換をするとすれば、使い勝手の観点からはやや難がある。2mm 以上のキューベッ トではこの問題はなかった。 （2）カラーリーダー用白色校正板の反射スペクトル  CR-11 は、基本的に反射光の HV/C を計測する装置であり、装置 1 台毎に通し番号を付 した固有の白色校正板を備えている。そこで、CR-11 用白色校正板の反射特性を検証した。  図 3 は前報（山岡、2010）で使用した Gigahelz Optik 製の標準反射板 BN-R98 と CR-11 用白色校正板の反射スペクトルをスコープモードで比較した結果である。BN-R98 は公称 400-800nm を 98％反射することになっている。CR-11 用白色校正板は概して強い反射があ り、Gigahelz Optik の標準反射板 BN-R98 を基準とすると 300nm で約 160％、400nm で約 190％、500 ∼ 800nm で約 240％の反射光が観測された。CR-11 の白色標準板の表面は光 沢があるので、いわゆる鏡面反射（山岡、2010）の影響があると思われるが、可視光域を 扱う CR-11 で試料を入れたキューベットの反射板として使用するためには十分な反射特 性を備えていることが確認できた。 図2 分光光度計用キューベッ ト 3 種の透過特性 光源のスペクトルを基準とし て、純水を満たした各キュー ベットの透過スペクトルを求め た。凡例はキューベットの光路 長 を 示 し、10mm は 石 英 製、 2mm と 1mm は PYREX 製であ る。光路長に合わせてキュー ベットホルダーのコリメーター レンズを交換し、調整した。 図3  カ ラ ー リ ー ダ ー CR-11 用白色校正板の反射特性 CR-11 用白色校正板の反射特性 を Gigahertz Optik 社製標準反 射板 BN-R98 と、USB2000 のス コープモードで積分時間を同一 にして比較した結果を示す。

図4 キューベットの種類と 光路長による反射特性の比較 CR-11 用白色校正板のスペクト ル を white reference と し た と き の、 純 水 を 充 填 し た 3 種 キューベットの反射スペクト ルを示す。各キューベットは、 純水を充填し、反射スペクト ルを計測した。反射スペクト ルは、アダプター（図 1）によ り各キューベットを CR-11 用 白色校正板に密着させ、分光 光度計 USB2000 の反射プロー ブをキューベット面に対して 直角にセットして計測した。 表1 光路長を異にするキューベットを介して CR-11 で計測した基準色票（1998）の HV/C 値

 CR-11 で色を読み取るためには照射光が反射してこなければならない。そこで、分光光 度計 USB2000 の反射スペクトル測定用のプローブと CR-11 用白色校正板の間に純水を満 たしたキューベットを挟み、キューベットの光路長の影響を検討した。  図 4 は、RC-11 用白色校正板を white reference とした時の、純水を満たした光路長 10mm、2mm、1mm のキューベットを介した白色校正板反射からの反射スペクトルを比 較した結果である。光路長 10mm のキューベトは 250nm から 850nm の波長域全域で反射 率が 25％程度という結果であった。可視光域に限れば光路長 1mm のキューベットはほぼ 95％の反射率を示し、2mm ではおよそ 80％であった。したがって、この観点からは可視 光域に限れば光路長 1mm のキューベットが好ましいことになる。 （4）キューベットを介した Munsell 基準色票の測定結果  キューベットの光路長が CR-11 の測定結果に及ぼす影響を知るために、基準色票（1998） を通常の使用法で直接読んだ結果と、CR-11 により純水を満たした光路長 1mm、2mm お よび 10mm のキューベットを CR-11 の測定器安定板に密着固定して計測した結果を表 1 に示す。なお、キューベットは栓付ではないので漏水から基準色票を護るために開口部を 金属粘着テープでシールして用いた。  表 1 に HV/C 基準色票 20 色相簡略版に収録されている 653 色から無彩色（neutral color）の N1 ∼ N9.5 の 10 種、色相 5R、5PR、5PB、10PB の内から明度と彩度が相対的 に高い 19 色を選び、公称値と CR-11 の読みを比較した結果を示す。表中、"No cuvette" の列は CR-11 の定法にしたがって読んだ値を、列見出し "1"、"2"、"10" の列は純水を満た した各光路長（mm）のキューベットを介して読んだ値を示す。各キューベットを用いる 場合の白色校正は、純水を満たしたキューベットを介して行った。迷光を避けるめに、計 測は暗室内で行った。  表中、基準色票の公称値と測定値が一致しなかったケースを bold face で示す。測定結 果は、手元の 1 台の測定器と 1 冊の基準色票を用いた結果である。"No cuvette" 列で不一 致が生じた原因が基準色票の印刷誤差と CR-11 の計測誤差のいずれに起因するか知るた めには数台の CR-11 と複数冊の基準色票を用いた計測結果を比較するべきではあろうが、 本報の目的がキューベットに入れた溶液の CR-11 による色計測法の確立にあるので、誤 差の要因の追究は控えた。ただし、比較的隔たりが大きかった色相 5R の幾つかの色につ いて、3 種の光路長のキューベットを介した反射スペクトルを、キューベットを介さず直 接測定した反射スペクトルと比較した（図 5）。その結果については後述する。  表 1 の "No cuvette 列は基準色票の公称値と CR-11 の定法による測定値が一致すること を期待して念のため行った計測であるが、無彩色の N4 から N8 は 0.5 ずつ明るく計測され、 色相 5R、5RP、5PB、10PB では明度が高いケース、または比較的明度が低くて彩度が高 いケースで公称値と測定結果が一致しない傾向が認められた。  光路長 1mm のキューベットを使用した場合は、キューベットを介さない CR-11 の通常 の使用法による計測結果と大きな差は認められなかった。  光路長 2mm のキューベットでも、1mm のものよりやや不一致のケースが多い程度で あり、液体容器として使用したときの「フィルター」として不適切とまでは言えなかった。

 光路長 10mm のキューベットは N1 が暗すぎて計測不能あったことから、明度や彩度が 低い場合の計測には全く向かなかった。  表 1 の測定結果についてメーカーから概略以下の様な助言を頂いた（私信）。コニカミ ノルタセンシングの了解の下に概略を引用する（要約文責、著者）：（1）セルを介すことに より光量が落ち明度が下がる傾向が認められる、（2）色相 5R ではセルを介すと色彩値 XYZ のバランスが変化しやすく色相が変化しうる、（3）色相 PB は色相 5R よりも反射スペ 図5 キューベットを介した基準色票色相 5R 数色の反射スペクトルに及ぼす光路長の影響

表 1 の色相 5R から 6 種の色の反射スペクトルを分光光度計 USB2000 で直接計測した場合（No cuvette） と純水を満たした光路長 1mm、2mm、10mm の 3 種のキューベットを介して計測した反射スペクトルを 示す。（A）公称値 5R9/1、（B）5R9/2、（C）5R8/4、（D）5R7/8、（E）5R5/12、（F）"5R4/15 ∼ "。図中の青、緑、 赤上向き矢印はヒト錐体細胞の色素の吸収ピーク 426、530 および 557nm を示す。なお、CIE の三原色は 435.8、546.3 および 700.0nm である。反射スペクトルの白色校正は純水を入れた各キューベットを介して 行った。HV/C 基準色票の印刷面が鏡面反射を持つので、標準反射板 BN-R98-D2 （Gigahertz-Optik） を white reference に用いると色票の反射率の計測値が 100％を超えてしまうため、CR-11 用白色校正板を校 正に用いた。

がある、（4）色相 R は長波長に立ち上がりがある反射スペクトルであり、傾きのシフトに よっては Y 方向への変化が大きくなる、などが考えられると言うことであった。CR-11 は 三刺激値タイプであり、メーカーの助言から類推すれば CIE XYZ 表色系の色彩値 XYZ に 基づき、HV/C 値を算出しているであろうから波長 435.8nm、546.3nm、700.0nm の反射 特 性 か ら 三 刺 激 値 を 求 め て い る は ず で あ る。CIE （Commission Internationale de

l'Éclairage: 国際照明委員会）は 1931 年以来、「標準的なヒトの色感覚」に近い混色系の光

の色刺激の数値表現システム、すなわち CIE 表色系の制定作業をしてきている。一方、 ヒ ト 錐 体 細 胞 の 色 素 の 吸 収 ピ ー ク は、S タ イ プ（ 青 ） で 426nm、M タ イ プ（ 緑 ） は

530nm、L タイプ（赤）は多形性があり 552 と 557nm であることが知られている（例えば、 Vos and Walraven, 1971: Nathans et al., 1986; Walraven and Werner, 1991; Merbs and Nathans, 1992; Winderickx et al., 1992; Walraven, J., 2001）。

 筆者も、基準色票の 5R の幾つかの色の反射スペクトルを、光路長を異にする、純水を 満たしたキューベットを介して計測した場合と、キューベットを介さない場合の反射スペ クトルを比較していたので（図 5）、メーカーの助言を参考に結果を検討した。なお、各 グラフの青、緑、赤の上向き矢印は、概略、ヒト錐体細胞の S、M、及び L 細胞の色素の 吸収ピークの波長を示す。  表 1 で色相の読みに大きな違いが認められた公称 HV/C 値 5R9/1（図 5A）および 5R9/2（図 5B）は、光路長 10mm のキューベットを介した場合に反射率が著しく低下す るが、ヒト錐体細胞の感度ピーク波長における反射率の総体的な比率が 1mm と 2mm の 光路長のキューベットを介した場合やキューベットを介さない場合とほぼ一致するので、 光路長 10mm のキューベットを介した場合でも「明度が低下」するが色相は変化しない と推定される。しかし、表 1 に示す実際の計測結果では、色相の変化が認められた。  表 1 では殆ど差が認められなかった色 5R8/4（図 5C）と 5R7/8（図 5D）の反射スペク トルは、表 1 から予測される以上に大きな差が認められた。  表 1 では殆ど差が認められなかった色 5R5/12 の反射スペクトルも大きな差が認められ た（図 5E）。  表 1 で "5R4/15 ∼ " は使用した 3 種のキューベット全てで彩度が一段階低く計られたが、 色相と明度への影響は認められなかった。図 5F に示す反射スペクトルは 3 タイプの錐体 の感度ピークの波長近辺の反射率にはほぼ一定の比率の差異が認められた。換言すれば、 図 5F で認められた反射率の差異が表 1 の明度差に反映しなかったことになるが、CIE の 434.8、546.3、700nm で比較するとキューベットの有無および光路長で一定の差異が認め られた。  以上の結果、CR-11 で計測した結果（表 1）と、反射スペクトル（図 5）は完全に矛盾 するものではないが、単純な関係ではないことが解った。反射スペクトルの結果から言え ることは、光路長 10mm のキューベットは光エネルギーが大きく低下するだけでなく、 スペクトルのパターンにも影響し得るので本報の使用目的には不向きである。光路長 1mm のキューベットは、比較的影響が少なく、次いで 2mm のキューベットも使用不能 なほどの光エネルギーの低下は認められず、スペクトルのパターンにも多少影響するが決

定的とは言えなかった。 （5）CoCl2水溶液を充塡したキューベットを介した反射光のHV/C 測定値の評価  （5）-1 CoCl2水溶液のHV/C 測定値  ここまでは、CR-11 で溶液の色を計測するための容器としての分光光度計用キューベッ トの利用の可能性について基礎データを得る検討であった。光路長 1mm または 2mm の キューベットを然るべき白色反射板に密着させ、色彩を持つ溶液を満たしてカラーリーダ の照明光がキューベットのガラスの壁と溶液層を透過し、反射板で反射して再度のキュー ベットの壁と溶液層を透過して受光部に達する光がどの様な特性を持ちうるか、検討する ことにした。  一定の色を持つテスト用溶液として、anthocyanin の酸性時の発色に類似する赤に近い 色彩の CoCl2水溶液を選んだ。安直ながら、学生実験で anthocyanin の金属錯体形成実験 に用いる（山岡、2008）からである。1M 水溶液を基に 1/2M、1/4M、1/8M 液を用意し（図 6）、外形 18mm・容量 3ml の PYREX 製スクリュー栓ヴァイアル、および光路長 1mm と 2mm のキューベットに入れて基準色票により筆者が HV/C 値を記録した上で（図 6 付表 上 3 行）、光路長 1mm と 2mm のキューベットに入れて HV/C 計測用アダプター（図 1） を用いて CR-11 で HV/C 値を読んだ（図 6 付表下 2 行）。さらに、CoCl2水溶液の透過ス ペクトルと吸収スペクトルを分光光度計 USB2000 で計測した（図 7）。透過スペクトルは 専用のキューベットホルダーと光路長 10mm の石英キューベットで計測した。反射スペ クトルは HV/C 計測用アダプター（図 1）を応用し、CR-11 に代えて USB2000 の反射プロー ブ R400-7-UV-VIS を、マニピュレータで水平かつ校正板に直角に保持するとともに、最も 強い反射光が得られる位置にセットし、暗室内で計測した。いずれの場合も、計測に先立 ち、純水を満たした各々のキューベットを white reference として校正を行い、各濃度の CoCl2水溶液の反射スペクトルを計測した。  図 6 のスクリュー栓ヴァイアルに入れた CoCl2溶液の色は、いわゆる空間色であり、表 面色である基準色票と直接比較することは本来、困難である。白磁のカップに注いだ紅茶 の色の計測（小林、2011）をヒントに、CR-11 用白色校正板を背景に、直射光線を避けた 自然光照明下で HV/C を読んだ結果が図 6 付表第 1 行のデータであり、筆者の感覚的に は満足できる計測結果であった。第 2・3 行は光路長 1mm と 2mm のキューベットに入れ、 CR-11 用白色校正板を背景にして読んだ結果であり、当然ながら、光路長が短くなる分、 明度が上がったが、彩度は低下する傾向があり、1/8M まで希釈すると色相もパープルを 帯びた。  図 6 付表の第 4・5 行は白色校正板を背景に光路長 1mm と 2mm のキューベトに入れて CR-11 で読んだ結果である。光路長 1mm のキューベットに入れた場合、2mm より 2 倍薄 くなるのでそれに応じて明るくなるはずである。事実、総体的に明度も彩度も高く、また 色相も RP になる傾向が認められた。1/8M まで希釈した場合に人の目でパープル掛かる こと認めること関連する可能性がある。  これ等の結果からすると、単純に光路長が短ければ良い分けではなく、この観点からは 光路長 1mm のキューベットより 2mm のものの方が本報の目的に合う、と言える。

 （5）-2 CoCl2水溶液の透過スペクトルと反射スペクトル  図 7A に CoCl2水溶液の透過スペクトルを光路長 10mm の石英製キューベットで計測し た結果を示す。波長 511nm を吸収ピークとする 450-550nm の吸収バンドが明瞭であり、 350-400nm を透過すると共に、550-850nm を良く透過するが、600nm に透過度の小さな肩 があり、基本的に色相 R から RP の透過スペクトルを示した。  次いで反射スペクトルを比較した。通常、比色による濃度測定には吸光度を計測するべ きであろうが、CR-11 は内蔵の照明光源からの光がキューベットの 2 枚の PYREX 板と、 その間に挟まれた溶液を透過して反射板に到達し、再度 PYREX 板と溶液を透過して帰っ てきた反射光を計測するはずだからである。図 7B は光路長 2mm の、図 7C は光路長 1mm の PYREX 製キューベットによる反射スペクトルである。得られた反射スペクトル は可視光全域に於いて図 7A の透過スペクトルとほぼ一致し、光路長と CoCl2の濃度に応 じた反射率の変化が認められた。  光路長 1mm のキューベットは、当然のことながら光路長 2mm のものより色としても 淡くならざるを得ず、反射率が総体として高く、HV/C では明度・彩度が高くなることが 図6 CoCl2溶液の HV/C 値を肉眼と CR-11 で読み取った結果 外径 18mm・容量 3ml の PYREX 製スクリュー栓ヴァイアルに所定濃度の CoCl2水溶液を準備した。モル 濃度をスクリュー栓に示す。付表はそれぞれの濃度の水溶液の HV/C 値一覧である。第 1 ∼第 3 行は直射 日光を避けた自然光下で基準色票を用いて筆者が読んだ値であり、第 4 行と第 5 行は CR-11 で読んだ結果 である。第 1 行はヴァイアルに入れた状態で、第 2 行と第 3 行は光路長 1mm と 2mm のキューベットに 入れた状態で、白色校正板を背景として密着させて読んだ。第 4 行と第 5 行は光路長 1mm と 2mm のキュー ベットに入れ、CR-11 で計測した。CR-11 で計測する場合はアダプター（図 1）を用いて、キューベット の一側面を白色校正板に密着させ、反対側面に CR-11 の測定部の安定板を密着し、迷光を避けるために暗 室内で計測した。CR-11 の白色校正は、純水で満たしたキューベットを介して行った。なお、学生実験室 を想定して窓を遮光して薄暗くした場合と天井の蛍光灯を点灯した場合で、読みを比較したが、結果は左 右されなかった（データ不提示）。

予測されるので、色の計測という観点から光路長 2mm のキューベットが有利と考えるこ とができる。  分光光度計用キューベットに溶液を入れ、CR-11 用白色校正板に密着させて計測する反 射光は、照明光がキューベットの PYREX の壁を透過し、溶液を透過し、再度キューベッ トの PYREX の壁を透過して白色校正板で反射し、再びキューベト壁と溶液とキューベッ ト壁を透過して分光光度計のセンサーに導かれることになる。この様な光の経路は白磁の 図7 CoCl2水溶液の透過スペクトルと 反射スペクトル （A）透過スペクトル、（B）光路長 2mm の キューベットに充塡した反射スペクト ル、（C）光路長 1mm キューベットに充塡 した反射スペクトル。透過スペクトルは 分光光度計 USB2000 により、キューベッ トホルダー（CUV-UV）、光路長 10mm の 石英キューベットを用いて計測した。反 射スペクトルは反射プローブ R400-7-UV-VIS と CR-11 用白色校正板の間に図 1 に 示すアダプターを用いて光路長 1mm お よ び 2mm の PYREX 製 キ ュ ー ベ ッ ト を セットして計測した。いずれの場合も、 それぞれのキューベットに純水を満たし て white reference とした。CoCl2水溶液

の濃度は、各グラフの凡例に示すとおり

カップに入れた紅茶の見かけの分光反射スペクトルが紅茶液の透過スペクトルと見まがう 程の類似性を示すこと（小林、2011）が参考になる。つまり、本報における「見かけの反 射スペクトル」は溶液の透過スペクトルを計測していることと同義、と考えて差し支えな いであろう。  使用した PYREX キューベットの何れがより好ましいか検討するために、青領域の 400nm、CoCl2溶液の吸収ピーク 511nm、および透過・吸収スペクトルの肩が認められる 600nm の各波長（図 7 参照）で、光路長 10mm の石英製キューベットを用いて計測した 図8 CoCl2水溶液のキューベットによ る透過率と反射率の比較 （A）400nm の透過率および反射率の比較、 （B）511nm（吸収ピーク）の透過率およ び反射率の比較、（C）600nm の透過率お よ び 反 射 率 の 比 較。 △： 光 路 長 10mm キューベットを用いた場合の透過率；○： 光路長 2mm のキューベットを用いた場 合の反射率；●：光路長 1mm のキュー ベットを用いた場合の反射率。図中の曲 線は累乗近似曲線である。

透過率と、光路長 1mm および 2mm の PYREX 製キューベットを用いた反射率を比較した （図 8）。図から明らかな様に、希釈するにつれて 400nm と 600nm では透過率が上がると 共にキューベットの光路長による差が接近もしくは消失するのに対し、511nm では希釈 により透過率は上がるものの差が広がる傾向が認められた。即ち、透過スペクトルでは希 釈するにつれて色相が RP にずれる傾向が認められた。しかし、光路長 1mm と 2mm を 用いた場合、肉眼的、および CR-11 の計測（図 6）では 1/8M でそのことが認められたこ とになる。何れの波長においても光路長 2mm のキューベットを用いた場合が 1mm の キューベットを用いた場合より、光路長 10mm のキューベットを用いた透過率に近い値 が得られた。  以上の検討結果から、結論的には光路長 1mm または 2mm のキューベットに溶液を入れ、 CR-11 用白色校正板を反射板として「見かけの反射光」を計測することは不可能ではない ことになる。ただし、光路長 1mm では光の往復でトータル、ほんの 2mm の溶液層を計 ることになり、色が淡くなりすぎる場合があり得ること、さらに毛管現象を加味すると、 溶液を注入するにしても、排液して洗浄する上でも学生にとって扱いが難しくなることか ら、光路長 2mm のキューベトを用いることが好ましい、と考えられる。

2.  ナス果皮素抽出物の anthocyanin の pH に対する反応の HV/C 値の測定

結果

 図 9 は buffer にナス果皮 methanol 素抽出液を加えて撹拌後、約 30 分経過した反応色 で あ る。 ナ ス（Solanum melongene） の 果 皮 は nasunine を 含 み（Noda et al., 2000），

delphinidin が母核であることが知られており（矢原・橋本，2004）、Willstätter （1966）が 明らかにした様に酸性条件下では安定した赤を発色し、中性から塩基性条件下では青味を 帯び、強塩基性条件下では黄色を発色する（山岡、2007）。  ナス果皮の anthocyanin （おそらく大部分は nasunine）が pH2 から 12 で発色した溶液 の透過スペクトルと反射スペクトルを比較した。透過スペクトルは光路長 10mm の石英 キューベットで通常のキューベットホルダーを用いて、反射スペクトルは光路長 2mm の PYREX 製キューベットで図 1 のアダプターと白色校正板と OceanOptics の反射プローブ を用いて計測した。  図 10A に透過スペクトルを示す。pH2 の強酸性条件下で色相 7.5RP と読まれた様に（図 図10  ナ ス 果 皮 methanol 抽 出液の透過スペクトルと反射 スペクトルに対する pH の影響 （A）透過スペクトル、（B）反射 スペクトル。透過スペクトル と 反 射 ス ペ ク ト ル の 計 測 は、 基本的に CoCl2水溶液の場合 （図 7）と同様であり、透過ス ペクトルは光路長 10mm の石 英キューベット、反射スペク ト ル は 光 路 長 2mm の PYREX 製 キ ュ ー ベ ッ ト を 用 い た。 White reference は、 所 定 の buffer 2.5ml に 50 ％ methanol 0.5ml を混合した液を満たした キューベットを用いた。

9）、600nm 前後に急激な立ち上がりを示し、長波長側をほぼ 100％透過するだけではなく 440nm に 20％の透過ピークを示す単純な赤ではなく、色相 RP に相当するスペクトルを 示した。  pH4 では 550 ∼ 650nm にかけて 30 ∼ 50％の透過率を示すがそれより長波長の赤領域 は 60 ∼ 90％の緩やかな上昇を示し、赤成分が減少すると共に緑成分が増加し、一方で短 波長側は 480nm に 33％のピークを持つ透過が見られ、やや青領域が増加した。  pH6 では 550nm より長波長側、特に 650 ∼ 700nm にかけて 20％ほど pH4 よりやや高 い透過率を示すものの 550nm 以下では pH4 より 10％程度ながら低い透過率を示した。  pH8 では、pH6 の透過率を全域で 20 ∼ 30％減少するスペクトルを示し、三刺激値が Y にずれると想像されたが、図 9 で HV/C 値の色相が Y にシフトし、明度が低下している ことと符合した。  pH10 では 500 ∼ 650nm で約 10％の透過率で、500nm 以下は急速に低下し 420nm で透 過率ゼロになる一方で、650 ∼ 750nm に掛けて 70％台に透過率が上昇し、850nm までは 80％程度まで緩やかに上昇するスペクトルを示した。  pH12 はヒトの肉眼観察でも明らかな様に色相 Y の傾向が強く、また相対的に明度が低 くいが（図 9）、透過スペクトルでは 550 ∼ 700nm にかけて pH10 に比較して高い透過率 を示したが、450nm でほぼ 0％、700nm で 60％となるほぼ直線状のスペクトルを示し、 全体として黄味が強まるであろうことを示した。  図 10B に示す反射スペクトルは、図 10A の透過スペクトルとパターンが総体的に良く 一致するが、550nm 前後の反射率が相対的に高く、特に短波長側、440 ∼ 480nm の反射ピー クの値が明瞭に高くなった。キューベットそのものの透過率や白色校正板反射率のスペク トルからは、短波長側がなぜこの様な振る舞いをするかは説明が容易ではないが、透過光 のみで計測した場合と、「見かけの反射率」で計測した場合の溶液の特性によるとしか考 えられない。原因は現時点では不明である。

結論

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