IRUCAA@TDC : Expression of matrix metalloproteinase-１ and connexin-４３ in oral cancer cell lines

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Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/

Title

Expression of matrix metalloproteinase-１ and

connexin-４３ in oral cancer cell lines

Author(s)

原, 有沙

Journal

歯科学報, 113(4): 470-471

URL

http://hdl.handle.net/10130/3197

Right

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論文内容の要旨１．研究目的口腔癌のおよそ９０％は扁平上皮癌である。癌細胞は周囲の細胞外基質を分解して浸潤し，局所ならびに全身へ影響を与える。癌細胞の性格を把握するために培養法を用いて多くの研究がなされているが，通常は二次元培養での検索が殆どである。癌細胞の生物学的特徴とも言える浸潤増殖態度を反映させるためには三次元的培養法が必要で，その一つにⅠ型コラーゲンゲルを用いた培養法がある。しかしながら，口腔扁平上皮癌（oral squamous cell carcinoma：OSCC）細胞を三次元的に培養した際の浸潤増殖機構は不明な点が多い。本研究の目的は，Ⅰ型コラーゲンゲル上で OSCC 細胞を培養し，三次元的細胞の挙動を形態学的に観察するとともに，免疫組織化学的ならびに分子生物学的に検索し浸潤増殖関連分子の動態を把握することである。

２．研究方法

実験群にはBSC-OF（human basaloid squamous cell carcinoma-mouth floor）およびHSC-４（human squamous cell carcinoma）を用い，３７℃，５％CO２の条件下で培養した。対照として HOK（human oral keratinocytes）を

同条件で培養した。Ⅰ型コラーゲン溶液を培養皿に注入し，３７℃で１０分間静置してゲル化させた後，各細胞を５×１０４

cells/ml の濃度で播種した。形態学的観察のためには，培養３，５，７日後にホルマリン固定し，蛍光染色ならびにヘマトキシリン・エオジン染色を行った。同じく培養３，５，７日後に RNA を抽出し，細胞外基質の分解を担う matrix metalloproteinase（MMP）-１およびギャップ結合を構成する connexin の遺伝子発現を定量的リアルタイム PCR 法にて検索した。タンパクレベルの検索のためには，培養７日後の試料を用いて MMP-１ならびに connexin-４３の免疫組織化学的染色を行った。３．研究成績および考察試料断面像の観察より，３日では各細胞はコラーゲンゲル上に一層配列していた。５日では BSC-OF は細胞層の厚さを増し，HSC-４はコラーゲンゲル内へ楔状に浸潤していた。７日では BSC-OF はコラーゲンゲルを圧排しながら外向性に増殖し，HSC-４は５日例よりも深部へと浸潤していた。観察期間中，HOK の基質内への浸潤は認められなかった。定量的リアルタイム PCR の結果から，MMP-１ mRNA は５日，７日において HSC-４で他群と比べ有意に高い発現を示した。Connexin mRNA の発現は３日，５日，７日において BSC-OF

で他群と比較して有意に高い値を示した（＊_P ＜０．０５，＊＊_P ＜０．０１）。免疫組織化学的染色の結果から，MMP-１氏名（本籍）はらありさ

原

有

沙

（神奈川県）学位の種類博士（歯学）学位記番号第１９７７号（甲第１２１８号）学位授与の日付平成２５年３月３１日学位授与の要件学位規則第４条第１項該当

学位論文題目 Expression of matrix metalloproteinase-１ and connexin-４３ in oral cancer cell lines

掲載雑誌名 Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, Medicine, and Pathology http : //dx.doi.org/１０.１０１６/j.ajoms.２０１３.０４.００３２０１３年４月論文審査委員（主査）阿部伸一教授（副査）井上孝教授柴原孝彦教授東俊文教授野村武史講師歯科学報 Vol．１１３，No．４（２０１３）４７０ ―１２２―

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は HOK，BSC-OF の細胞質に弱陽性で，HSC-４の細胞質に陽性であった。Connexin-４３は全ての細胞の細胞膜および細胞質に陽性で，特に BSC-OF で強陽性を示した。

Basaloid squamous cell carcinoma（BSCC）は OSCC の一亜型で，組織破壊性が強い腫瘍とされている。しかしながら，本研究において BSC-OF は浸潤性に乏しく外向性に発育した。BSCC の予後は通常の OSCC よりも不良とする報告と，同程度とする報告がある。このことから，従来浸潤性が高いと考えられていた BSCC に低浸潤型が存在する可能性が示唆され，BSC-OF はこれに相当すると考えられた。MMP-１は内向性に発育する HSC-４で高発現しており，HSC-４の浸潤に関与することが示唆された。ギャップ結合は，細胞間接着のみならずセカンドメッセンジャーを通過させることで細胞増殖に重要な役割を果たしている。本研究では外向型の BSC-OF で connexin-４３の過剰発現が認められ，connexin-４３はギャップ結合を増加させることで BSC-OF の増殖に関与したと考えられた。４．結論 BSC-OF における MMP-１の低発現および connexin-４３の過剰発現は外築性増殖をもたらし，HSC-４における MMP-１の過剰発現は浸潤を引き起こしたと考えられた。論文審査の要旨本論文はⅠ型コラーゲンゲル上で口腔扁平上皮癌細胞を培養し，形態学的観察ならびに浸潤増殖に関わる遺伝子群である MMP-１，connexin-４３の発現解析を行ったものである。その結果，従来悪性度が高いと考えられていた basaloid squamous cell carcinoma の cell line である BSC-OF は浸潤性に乏しく外向性に発育し，高分化型 squamous cell carcinoma の cell line である HSC-４は浸潤性発育を示した。そして，外向型の BSC-OF では MMP-１の発現が低く connexin-４３の過剰発現が認められること，内向型の HSC-４では MMP-１の過剰発現が認められることを明らかとした。本審査委員会は平成２４年７月２５日に行われ，まず原有沙大学院生より論文概要が提示された後，各審査委員より本論文に対し次のような質問がなされた。１）対照群の設定について，２）cell line の選択に関して，３）癌細胞の浸潤様式について，４）本研究の臨床応用，などであったが概ね妥当な解答が得られた。その他に，論文内容に適した表題への変更の検討，材料および方法の記載に対する補足，付図の修正，考察の追加等，修正すべき点が指摘され訂正が行われた。その結果，本研究で得られた知見は歯学の発展に寄与するところ大であり，学位授与に値するものと判定した。歯科学報 Vol．１１３，No．４（２０１３）４７１ ―１２３―