博士（医学）得地史郎 学位論文題名
T 細胞クローンを用いた実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE) における抗原反応性と脳炎誘発性解離現象の解析 学位論文内容の要旨
Ilま じ め に
実 験的ア レルギー 性脳脊 髄炎(experimental allergic encephalomyelitis
；EAE)は中枢 神経系の 自己免 疫性の脱 髄疾患 であり、 多発性硬 化症の動物モ デ ルとし て知られ ている。EAEは 中枢神経 髄輔構成蛋白であるミエリン塩基性 蛋 白(myelin basic protein；MBP)を 感受性の ある動物 に感作 するか、MBP反 応 性T細 胞ライ ン（多種 反応細 胞の混合 ）やT細胞ク ローン（ 単一細 胞由来）
を 移入す ることで 引き起こ すこと ができる 。しかも、MBPの脳炎活性を有する 部 分（起 炎決定基 ）に反応 するT細胞ラ インやクローンのみが起炎性を示す。
SJL/Jマウ スのMBPの起炎 決定基は モルモッ トMBPのアミノ 酸89番か ら101番ま で の部位 （以下MBP 89―101と 略）に存 在することが判明しており、この部位 と 反 応 す るT細 胞 が 脱 髄 性 脳 炎 を 誘 発 す る こ と も 実 証 さ れ て い る 。 と こ ろが 、 我 々が 樹 立 し たT細 胞 クロ ー ン の中 に 抗 原に 対 す る反 応 性 は 保 ちなが ら起炎性 が喪失し たT細胞クロ ーンが存在することが見いだされた。
こ の 起 炎性 の 喪 失を 解 析するこ とにより 抗原反 応性T細胞が どのよう な機構 で 脳内に 違し脳炎 と脱髄を 生ずる かを明確 にする ことが可 能と考 えられる。
そ こ で 、我 々 は 起炎 性 喪 失 機序 と し て抑 制 因 子、リ ンホカ インなど 種々の 因 子の解 析を行い 、細胞接 着分子 の発現に 差異を 見いだし たので 報告する。
II研 究 方 法
1．T細 胞 と 起 炎 性 ：SJL/Jマ ウ ス 由 来 のrdIBP特 異 反 応 性T細 胞 ク ロ ー ン 4b. 14aを 長期間in vitroで継代 するうち に、起 炎性を喪 失したも のが見いだ され、 これを4b. 14a/nと名 付けた 。新たにMBPをSJL/Jマウ スに免 疫後、合成 ペプチドlrIBP 89−101を抗原とし継代培養してT細胞ライン(YT−2）を得、それ を限界 希釈して 樹立し た起炎性 クロー ン(TNT−1）をも研究対象とした。各種T 細胞の抗原特異反応jま［3H]Thymidine uptakeにより測定し、脳炎誘発活性は，
抗 原刺 激 後 の幼 若化 したT細胞を マウスの 腹腔内 に移入し 、脳症(EAE)の発 症 の程度を6段階評価で判定した。
2.病 理 学 的 検 索 ：T細 胞 ク ロ ー ン 移 入 後8日 目 と12日 目 と の 脊髄 標 本 にて 検討し た。今回 新たに 作製した 抗MBP 89−101モノク口ーナル抗体(mAb)を用い た Avidin− Biotin法 に よ る 免 疫 組 織 学 的 染 色 標 本 も 検 索 し た 。 3,抑制因 子測定 ：4b. 14 a/n（非起炎 性T細 胞）に よる起炎 性T細 胞抑制因子 産生の 有無を調 べるため、4b. 14aのMBP 89−101に対する増殖反応に4b. 14a/n の 培 養 上 清 を 加 え た 。Controlと し て 、4b. 14aの 培 養 上 清 を 用 い た 。 4. リンホ カイン 活性：TNF‑a，lymphotoxin (LT)，Interferon（IFN)，IL―2 活性測 定は各種T細 胞の抗原 刺激後24，48時間細 胞の培 養上清を 用いていずれ もbioassayで 求めた。 最初に総TNF (TNF‑ロ とLTの総 量）活性 をL929細胞を用 いたcytotoxicity assayで調ぺ 、次にLT活 性を抗mouse TNFーa抗体をcoating し たproteinAーSepharoseでTNF‑aを吸着 除去した サンプ ルを用い て同様に 測 定した 。TNF‑ロ活 性は総TNF活性 値とLT活性値との差から求めた。IFN活性；ま L929細 胞とvesicular stomatitis virusを 用いたcytopathic effect (CPE) reduction assayで測定した。IL−2活性｜まCTLL−2細胞（IL−2dependent)ならび にHT−2細胞（ILー2and IL−4dependent)の[3H]Thymidine uptakeにより求めた。
5． 接 着 分 子 の 解 析 ： リ ン パ 球の 接 着 分 子で あ るCD2とLFA−1ぱ(CDlla)と LFA−1ロ(CD18)の発現の程度は抗原刺激後72時間の4b. 14a/nと4b. 14aとを、そ れ ぞ れ の 抗 マ ウ ス 特 異 抗 体 を 用い てFACScanサ イ ト メー タ ー で解 析 し た。
11I結 果
4b. 14aは腹 腔内 投与 後7日 から、TNT−1は9日か｀ら重 症EAEを発症したが 4b. 14a/nは全くEAEを発症せず 、また大量投与しても発症しなかった。EAEの 病理像では、4b. 14a移入後の脊髄には血管周囲性に著明な 単核細胞浸潤と抗 MBP 89−101 mAbによる免疫染色で炎症病巣のMBP陽性myelinの消失（脱髄）が 見られたが、4b. 14a/nでは細胞浸潤は全く見られず，MBP陽性の髄鞘も保たれ ていた。また、起炎決定基であるMBP 89ー101に対する4b. 14 a/nの抗原特異反 応は4b．14aやTNT−1と同程度保たれていた。非起炎性細胞による抑制因子につ いては、4b. 14 a/n培養上清はdose dependentに4b. 14aのMBP 89−101に対する 増殖反応を抑制したが、4b. 14a培養上清にも同様の抑制活 性を認め、抑制因 子は関与していないと考えられ た。リンホカイン活性では4b. 14a/nの培養上 清中のTNF‑a活性は高値を示したが、これは4b．14 a/n由来 ではなく抗原刺激 時にフイーダー細胞として加え た脾細胞由来と考えられた。LT，IFN，IL―2活 性で は 両者 に明 らか な差はな かった。接着分子発現の程度では、LFAー1ぱと CD2の発現量に差；まなかったが、4b．14 a/nのLFA−1ロの発現量は4b. 14aより明 ら か に 低 下 し て お り 、 こ の 低 下 傾 向 は コ ン ス タ ン ト に 再 現 さ れ た 。
1V考 察
T細 胞 性 組 織 障 害 の 中 で 、 起 炎 決 定 基 に 反 応 す るT細 胞 ク ロ ーン が必 ず し も起 炎性 を有 して いな いという現譲に遭遇した。抑 制因子や検索した範囲 の り ン ホカ イン 活性 など には 差異 がな かっ たが 、T細 胞上 の接 着分 子(LFA‑
1ロ）の発現量には常に低下が観察された 。EAEを発症するためには、エフェク タ ーT細 胞が 中枢 神経 に侵 入しなければならない。EAEは免疫系の様々な複雑 な 細胞 相互 作用 や繊 細な 調節機構の総和として誘起さ れ、多方面からの解析 が 重要 と考 えら れる が、 今回の解析で接着分子低発現 によるhoming能や血液 脳 関門 の透 過性 の欠 如が 脳 炎誘 発能 の障 害の1つ の要 因になっていると推測 された。
Vま と め
実験的ア レルギー 性脳脊 髄炎(EAE)におけ る抗原決定基に反応するT細胞ク 口 ー ン の 起 炎 性 喪 失 機 序 を 解 析 し て 次 の 結 果 が 得 ら れ た 。
1． ミ エ リン 塩 基 性 蛋白 お よ びそ の 起 炎決 定 基 に反 応 するT細 胞クロー ン (4b. 14a/n)は臨 床 的 にも 病理 学的に も脳炎誘 発能カを 喪失し ていた。
2.起 炎 性 保 持 T細 胞 ク 口 ー ン と 比 較 し て 起 炎 性 喪 失T細 胞 ク 口 ー ン (4b. 14a/n)には抑制因子の存在や検索した範囲のりンホカインに差が無か っ た が 、 接 着 分 子(LFAー1B） に お い て 発現 量 の 低下 が 観 察さ れ た 。 3. EAE発 症 に はT細 胞 ク 口ー ン が 起 炎決 定 基 に反 応 し 、か つ 細 胞接 着 分 子を保持していることが重要と考えられた。
学位論文審査の要旨
学位論文題名
T細 胞クロー ンを用 いた実験 的アレ ルギ一性 脳脊髄炎 （EAE） に お け る 抗 原 反 応 性 と 脳 炎 誘 発 性 解 離 現 象 の 解 析
は じ め に
実験 的アレル ギ一性 脳脊髄炎(experimental allergic encephalomyelitis
；EAE)は 中枢神経 系の自 己免疫性 の脱髄疾患である。EAEは中枢神経髄鞘構成 蛋白 であるミ エリン塩 基性蛋 白(MBP)を 感受性 のある動 物に感作するか、MBP 反応 性T細 胞ライン やT細胞クロ ーンを移 入する ことで引 き起こすことができ る。 しかも、MBPの脳炎活性を有する部分（起炎決定基）に反応するT細胞ライ ンやクローンのみが起炎性を示す。SルノJマウスの起炎決定基はモルモットMBP のアミノ酸89番から101番までの部位(MBP 89−101）に存在することが判明して おり 、この部 位と反応 するT細胞が 脱髄性脳炎を誘発する。ところが、我々が 樹立 したT細胞クロ ーンの 中に抗原 に対する反応性は保ちながら起炎性が喪失 したT細胞 クローン が存在 すること が見いだされた。そこで、この起炎性喪失 機序として抑制因子の関与、、リンホカイン産生の欠失、細胞接着分子の発現の 変化に基づくと仮定し、この3点について解析を行った。
方 法
Sル ノJマ ウス由来 のMBP特異反応 性T細胞ク口 一ン4b．14aと、 このク口一ン を長期間in vitroで継代するうちに、起炎性を喪失したもの4b. 14 a/nと、新た に樹立 した起炎 性クロ ーンTNT―1と の3クローンを研究対象とした。各種T細胞 の抗原特異反応は［3H]Thymidine uptakeにより測定し、脳炎誘発活性は，抗原刺 激後の 幼若化T細胞を マウス の腹腔内 に移入し、脳症(EAE)の臨床的重症度の判 定を行い脊髄H．E標本ならびに新たに作製した抗MBP 89―101モノクローナル抗体 (mAb)を 用いたABC法に よる免疫 組織学 的染色標本にて病理学的検索も行った。
抑制因子産生の有無は、4b. 14a/nの培養上清を4b. 14aのMBP 89―101に対する増殖 反応に加えて調べた。 TNF‑ゼ，lymphotoxin (LT)，Interferon（IFN)，IL−2活性測 定は各種T細胞の培養上清を用いて、最初に総TNF活性をL929細胞を用いたcytoー
郎敬 彦 和 邦 嶋木 林 長吉 小 授授 授 教 教教 助 査査 査 主副 副
toxicity assayで、次にLT活性を抗mouse TNF‑a抗体を用いてTNF‑ロを吸着除去 して同様に測 定した。TNF‑a活性は総TNF活性値とLT活性値との差から求めた。
IFN活性はL929細胞とvesicular stomatitis virusを用いたcytopathic effect reduction assayで測定した。IL―2活性はCTLL−2細胞ならびにHTー2細胞のCsH]
Thymidine uptakeにより求めた。接 着分子の解析では、CD2とLFA−1a(CDlla) とLFA−1ロ(CD18）の発現の程度を抗原刺激後72時間の4b. 14 a/nと4b. 14aとを、そ れ ぞ れ の 抗 マ ウ ス 特 異 抗 体 を 用 い てFACScanサ イ ト メー 夕― で解 析し た。
結 果
4b. 14aとTNT―1は重症EAEを発症したが、4b. 14 a/nは全くEAEを発症せず、また 大量投与して も発症しなかった。病理学的検索では、4b. 14aでは著明な単核細胞 浸潤と抗MBP 89―101 mAbによる免疫染色で炎症病巣のMBP陽性myelinの消失（脱 髄）が見られ たが、4b. 14a/nでは細胞浸 潤は全く見られず，髄鞘も保たれてい た。また、MBP 89−101に対する4b. 14 a/nの抗原特異反応は4b. 14aやTNT−1と同程 度保たれてい た。非起炎性細胞による抑制因子にっいては、4b. 14 a/n培養上清 中にはdose dependentの抑制活性を認めたが、4b. 14a培養上清にも同様の抑制 活性を認めた 。リンホカイン活性では4b. 14 a/nの培養上清中の牌細胞由来と考 えられるTNF‑ば活性は高値を示したが、LT，IFN．IL−2活性では両者に明らかな 差 はな かっ た。接着分子発現の程度では、LFA−laとCD2の発現量に差はなかっ たが、4b. 14a/nのLFA−1Bの発現量は4b. 14aより明らかに低下しており、この低 下傾向はコンスタントに再現された。
考察と結語
起 炎 決 定 基 に 反 応す るT細胞 クロ ―ン が 必ず しも 起炎 性を 有し てい ない と い う現 象に 遭遇した。抑制因子や検索した範囲 のりンホカイン活性などには差 異がぬかった が、T細胞上の接着分子(LFA−1B）の発現量には常に低下が観察さ れ た。EAEを発症す るためには、エフェクタ−T細胞が中枢神経に侵入しなけれ ばならない。EAEは免疫系の様々な複雑な 細胞相互作用や繊細な調節機構の総和 と して 誘起 され、多方面からの解析が重要と考 えられるが、今回の解析で接着 分 子低 発現 によるhoming能や血液脳関門の透過 性の欠如が脳炎誘発能の障害の 1つ の 要 因 に ナ ょ って いる と推 測さ れ、EAE発 症に はT細 胞ク ロ― ンが 起炎 決 定 基に 反応 し、 かっ 細胞 接 着分 子を 保持 して いる こと が重 要と 考えられた。
口頭 発表 に当たり、吉木教授、小林教授、上 出教授より脱髄性脳炎発症機構 に おけ る細 胞接着装置の役割、リンパ球、血管 内皮に介在する他の細胞接着因 子、LFA―1声 反応性低下の解釈とその意義、非起炎性T細胞クローンの生体内局 在 、投 与部 位による検討などの質問がなされた が、発表者は概ね適切ぬ回答を な した もの と思われた。また、吉木教授、小林 教授には個別に審査を頂き、そ れ ぞれ 合格 と判定された。以上、本研究は免疫 反応性を有しているが起炎性を 失 ったT細胞 クロ ーン を多 方面 から 解析し、脱 髄性脳炎発症機構に関するーつ の 要 因 を 示 し た も の で あ り 、 学 位 論 文 に 値 す る も の と 判 断 さ れ た 。
