博士（理学）從一直人 学′位論文題名
Studies on the〇rn（JE) locus of Drosopんila ananassae
［アナナスショウジョウバェの〇m (1E）遺伝子座の研究］
学位論文審査の要旨
自 然突 然変 異の多 くは トラ ンス ポゾン の挿 入に よっ てひき おこ され る，そ の 大部 分は ，調 節領域 や転 写領 域の 構造を 破壊 する こと によっ て遺 伝子 の機能 に 阻害 的な 効果 をおよ ばす ．し かし ながら ，卜 ラン スポ ゾンの 挿入 が， 近傍の 遺 伝子 の発 現を 活性化 する 突然 変異 の例が ぃく っか 知ら れてい る． 遺伝 学的な 解 析を する 上で ，この よう な突 然変 異は， 優性 で分 離が 容易で ある こと ，劣性 の 突然 変異 を起 こした 場合 は， 同義 遺伝子 の存 在や 致死 性のた めに 認識 しにく い 遺伝 子も 認識 し得る こと ，原 因と なる遺 伝子 をト ラン スポゾ ンタ ッギ ングで 比 較 的 容 易 に ク ロ ー ニ ン グ で き る こ と な ど の 利 点 が あ る ． ア ナナ ス シ ョ ウ ジ ョ ウ バ ェ に は， レト ロトラ ンス ポゾ ンtomの 挿入 が，近 傍 の遺 伝子 の発 現を複 眼原 基特 異的 に活性 化す るこ とに よって ，複 眼特 異的に 形態 異常 をおこ すと 考え られ ている 一群 の突 然変異Om（Optic morphology)があ る ． す くな く と も22遺 伝 子 座 のOm突 然変 異 が あ り ， そ れ ぞ れ が 遺伝 子 座に特 有 の 形 質 を 示 す ．Om突 然 変 異 体 で は ， 過 剰 ま た は 異 所 的 なOm遺 伝子 の 発 現 に よ っ て， 複 眼 の 分 化 が 撹 乱 さ れ る こと か ら ， そ れ ぞ れ のOm遺 伝子 は ，本来 な んら かの 分化 プロセ スに 携わ って いると 予想 され る． したが って ，く ね突然 変 異の 調査 から ，分化 プロ セス の遺 伝子支 配に 関す る知 見を得 るこ とが 期待で き る ． 本 研 究 で は ，Om突 然 変 異 の 中 で特 に ユ ニ ー ク な 形 質 を 持 つ 〇m(l別 突 然 変異 に注 目し て，原 因と なる 遺伝 子を同 定， 解析 し， その機 能を 探る ことを 目的 とし た．
第1章で は ，Om化 別 突 然 変 異 体 の外部 およ び内 部形 質を記 載し た． 他の遺
伝 子座 のOm突 然変 異 がす べて個眼 の減少をおこ すのに対し，Om(l別 突然変 異は複 眼が増大する 特異な形質を 示す．Om(l別突然変異体の複眼は，正常の 1．2〜1．7倍の個眼を持ち，背側後方にふくらんでいる．しかし，個眼の配列や，
個眼内部のパターン形成は基本的に正常である．複眼原基における個眼の分化 の様子を観察した結果，Om(l別突然変異体における個眼数の増加は，個眼分化 の頻度が高まったからではなく，分化に先だって上皮が過剰に増殖したためで あると示唆された．複眼の増大に加え，成虫の視覚中枢にも体積の増加が認め られたが，これは，個眼数の増加によって誘導された二次的な変化であると考 えられる．
第2章 で は ，Om(l馴 遺 伝 子 座 の 分 子 遺 伝 学 的 解 析 に つい て述 べ た．
Om(l馴突然変異体のゲノムライブラリーを，tomをプローブとしてスクリーニ ン グし ，Om(l別領 域と 思 われるもの をクローニング した．3つのOmn別突 然 変異系統は，すべてクローニングした領域内にtom挿入を持っており，ガンマ 線で誘発した復帰突然変異体は，この領域のゲノム構造に変化を起していた．
このこ とから，クロ ーニングした 領域がOm(l別突然変異に関係することが示 唆され た．一方，ノ ーザン解析に より，〇m(l別突然変異体のtom挿入点近傍 に2つの転写領域，tlおよびt2が見つかった．それらの複眼原基での発現を血 situハイブリダイゼイションで調べたところ，t2は，3つのOm(l馴突然変異系 統すべてで過剰発現していたが，tlを過剰発現していたのは1系統だけであった．
tlおよびt2のcDNAを，それぞれH sp70 (heat shock protein 70)遺伝子のプロ モーターにっなぎ，キイロショウジョウバェに導入し，ヒートショックするか，
またはプロモーター上流に組み込んだtom LTR (long terminal repeat)によって 発現を誘導すると，t2 cDNAを導入された形質転換体でのみ，個眼の増加がみ ら れ た ． 以 上 の こ と か らt2がOm(l別 遺 伝 子 で あ る と 同 定 さ れ た ． 〇m(l馴cDNAの塩基配列から推定される遺伝子産物は，530残基または464 残基で分子量約55 kDaの，今までに知られていなぃタンパクであった．．このタ ンパクは，全体的には親水性だが，膜貫通ドメインと推定される2つの顕著な疎 水性領域を持つ．推定される細胞外ドメインは，スレオニン／セリンに富んで お り， 細 胞間 コ ミュ ニ ケイシ ョンに関わる膜 夕ンパクにみ られる糖鎖付 加 (O‑glycosylation)部分と類似している．一方，細胞内ドメインは，グルタミン
に 富 む ドメ イ ン と ， 数 カ 所の 顕 著 な 塩 基 性 アミ ノ 酸クラ スタ ーをも つ．
第3章では，〇m(l助遺伝子の発現領域の調査と，過剰発現／発現抑制の効 果について述べた．
〇m(l別遺伝子の機能が必要とされる組織や器官を推定するために，胚と 成虫器官の原基に注目して，〇m(l助の転写産物とタンパクの空間的分布を，そ れぞれ，血situハイブリダイゼイションと免疫染色で調べた．抗Om(lE)抗体 は，cDNA配列の一部を大腸菌内で発現させて得られたタンパクを抗原として 作成した．胞胚期以降の胚と3齢幼虫の成虫原基において，Om(l別の転写産物 とタンパクは，すべての細胞に均一に検出された，3齢幼虫の中枢神経系では，
Om(l鬪転写産物は，表層全体に検出されたが，その中で特に視葉板（成虫視覚 中枢の第一神経節）の前駆細胞に，きわめて顕著な発現が認められた．一方，
抗Om(lE)抗体は，表層よりもニューロパイルに強く反応した．これは，神経細 胞 で 発 現し たOm(lE)夕 ン パク が ， 軸 索 に 集 積す る ことを しめ してい る．
Om(l馴遺伝子産物の生理的機能を推定するため，キイロショウジョウパ エの形質転換体をつかって，H・叩7Dプロモーターの支配下で〇mn馴遺伝子の 人為的過剰発現をおこし，その影響を観察した．〇m化別遺伝子の過剰発現を，
3齢幼虫期初期に誘導すると，背板の形態形成に異常が起こり，3齢幼虫期後期 から蛹期初期に誘導すると，感覚剛毛が過剰に生じた．逆に，〔）mn馴遺伝子の 活 性 を 抑制 す る た め に ，Cねn別 の ア ン チ セ ンスRNAを，H印7Dプロモ ータ ーの支配下で，3齢幼虫期後期から蛹期初期に過剰発現させたところ，感覚剛毛 の形成が阻害された．
以上の結果から，Om(l馴遺伝子は，胚発生期や成虫発生期に，広い役割 を持つことが示唆された．予想されるOm(l馴遺伝子産物のおもな機能は，未 分化細胞の増殖の促進，視葉板の初期分化への関与，外部感覚器官の分化への 関与である．これらの機能は，Om(l別遺伝子産物が，細胞間の情報交換に関与 する膜夕ンパクであるとぃう予想と矛盾しなぃ．
学位論文審査の要旨 主 査 教 授 堀 浩 副 査 教 授 吉 田 廸 弘 副査 助教授 木村正人
学 位 論 文 題 名
Studies on the Orn ( 1 E) locus of Drosophila ananassae
［ ア ナ ナ ス ショ ウ ジ ョウ バ ェの 〇m (1E） 遺伝 子 座 の研 究 ］
ア ナ ナス シ ョウ ジョウ バェには 、動く遺 伝子tomの挿 入により近 傍遺伝子 の発現が 複眼原基 特異的に 、しかも 異所的に活 性化する ことによ って、複 眼形態異常が起ると 考え ら れ る一 群 の突 然 変 異Omが知 ら れ てい る 。これ らの遺伝子 は、本来 何らかの 細 胞分化過 程に関与 している ものであり 、それら の本来の 機能を知 ることは分化の分子 機構の研 究にとっ て極めて 重要である と考えら れる。
申 請 者は 、 他の 多 く のOm突 然変 異 が個 眼 の 減少を引 き起こすの に対し、 個眼の増 加 を も た ら す 極 め て ユ ニー ク な 特徴 を 示すOm（1E） に注 目 して 、 そ の原 因 遺伝 子 の同定、 構造及び 機能解析 を試みた。
まず第一 に、対立 遺伝子系 統の個眼数 、配列な どの電子 顕微鏡観 察およぴ複眼原基 における 個眼分化 の形態的 観察から、 個眼数の 増加は本 来個眼以 外の細胞に分化すぺ き細胞を 個眼分化 に転用し た結果によ るもので はなく、 未分化の 上皮細胞を過剰に増 殖させた 結果によ ると推定 した。
次 に 、 変 異 系 統 の グ ノ ム ラ イブ ラ リー よ りOm（1E） と 思わ れ る 領域 を クロ ー ニ ング し た 。三 つ の対 立 遺 伝子 系 統全 て こ の領 域内 にt om挿入を持 っており 、ガンマ 線で誘発 した復帰 突然変異 体ではゲノ ム構造に 変化が見 られた。 また、この領域には 挿入 し たtomの 近 傍に ニ つ の転 写 領域 （tlお よ ぴt2） が存 在 し てお り 、そ れ らの複 眼原 基 に おけ る 発現 を 調 べた と ころ 、t2は 三 っの対 立遺伝子系 統全てで 過剰に発 現 し て い た が 、tlを 過 剰 発 現 し てい た のは 一 系 統の み であ っ た 。さ ら に 、tlおよ ぴ
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t2cDNAをHsp遺 伝 子 のプ ロ モ ー タ ー に っ な ぎ 、 キ イロ シ ョ ウ ジ ョウバ ェに 導 入 し、 熱ショ ックするか、プロモータ一上流に組み込んだtom LTRにより発現を 誘 導す ると、t2を 導入 した ときの み個 眼の 増加が認められた。以上よりt2がOm
（1E）遺伝子であると結論された。
次 に 、cDNAの 構 造 解 析 を 行 い 、 推 定 さ れ る遺 伝 子 産 物 が530ま た は464残 基 から なる分 子量約55kDaの未知の蛋白であり、全体として親水性であるが、膜 貫通ドメインと思われるニつの疎水性領域を持っこと、推定される細胞外領域はスレ オニン／セリンに富み、細胞間情報伝達に関わる膜蛋白にみられる糖付加部分と類似 していること、細胞内部分はグルタミンに富む部分と塩基性アミノ酸クラスターを持 つことを明らかにした。
更にこの遺伝子の生理的機能を推定するために、胚と成虫原基における転写産物と 蛋白の分布をin situ hybridization及び免疫染色により調べ、胚と三令幼虫の成 虫原基では全ての細胞で発現しているが、三令幼虫の中枢神経系では特に視葉板の前 駆細胞に極めて顕著な発現が見られることを明らかにした。更にキイロショウジョウ バェを用いた形質転換実験により、Om（1E）の過剰発現を三令幼虫で誘起すると 背板形成の異常や過剰な感覚剛毛が誘発されること、それとは逆にアンチセンスRN Aを 発 現 さ せ る と 感 覚 剛 毛 の 形 成 阻 害 が 起 こ る こ と を 見 出 し た 。 以上の結果から、Om（1E）遺伝子は未分化細胞の増殖促進、視葉板や外部感覚 器の分化などに関与していることが想定されるが、これは遺伝子産物が細胞間の情報 交換に関わる膜蛋白であるとの想定と矛盾しない。
本論文の内容は、外国の学術誌に発表された参考論文と共に未知の遺伝子の機能に 関する極めて興味あるものであり、高く評価きれる。よって審査員一同は申請者が博 士 （ 理 学 ） の 学 位 を う く る に 十 分 な 資 質 を 有 す る も の と 認 め た 。
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