博 士 （ 理 学 ） 高 道 学
学 位 論 文 題 名
Study of Ice Growth Inhibitory Ability of Isoforms of Type II 工 Antifreeze Protein
(III 型不凍タンパク質異性体の氷結晶成長抑制能に関する研究）
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
緒言
AFP(antifreeze protein:不凍タンパク質）は、0℃以下の低温環境に生息する生物から発見され た、氷結晶に結合し氷成長を阻害することによって、溶液（血液・組織液）の凝固点を降下するタン パク 質で ある 。AFPに よ る凝固点降下はモル凝 固点降下と比較して、低濃 度域において数百倍大 きいこと（モル濃度比）、氷結晶の形状を修飾すること、また、融点降下を伴わない（熱ヒステリシス現 象： thermal hysteresis)という点で大きく異なる。
様々な生物種（魚、昆 虫、植物、菌、藻類）からAFPが発見されているが、そのアミノ酸配列、立 体構 造は 実に 多 様で あり 、魚類由来AFPだけで も五つの構造型，に分類さ れる(I〜IV型と不凍糖 タンパク質）。魚や昆虫AFP.を中心とした立体構造解析と変異実験により、それぞれ特徴的な氷結 晶と の結 合部 位 、結 合モ デルが示されており 、異なる構造型のAFP問の相 違が明らかになってき てい る。 一方 、AFPは 生 体内で同じ構造型の複 数種類の異性体として発現 されているが、それら 同 構 造 型 の 異 性 体 間 の 不 凍 機 能 の 相 違 、 ま た 複 数 種 発 現 の 役 割 は わ か っ て い な い 。 IIi型AFPは 、 ゲ ン ゲ 科 の 魚 類 が 発 現 し て い る 約7kDaの球 状タ ンパ ク 質で あり 、氷 結晶 面 {1010）と相補的な氷結晶 結合面を有する。生体内で は複数種類の異性体として発現されており、
それ らは イオ ン 交換 カラ ムと の吸 着 性か らニ つの グループ(SP異性体とQAE異性体）に分類され る。 またSP、QAE異性 体 間の 一次 配列 の相 同 性は 約55％で ある 。 オス モメ ーターを用いた凝固 点測 定に より 、SP異 性体 は単 独で は 全く 凝固 点を 降 下で きな ぃこ と、 ま たQAE異性体存在下で は 凝 固 点 降 下 に 寄 与 す る こ と か ら、SP異 性 体とQAE異 性 体の 共同 的な 凝 固点 降下 能が 示唆 さ れた。
本 研究 では 、SP、QAE異性 体間 の不 凍機 能 の相 違、 また その 共 同的 ぬ不 凍機能のメカニズム の解明を目的とし て、氷結晶観察から直接的に 氷結晶成長抑制能を解析し た。解析には、市販の 顕 微 鏡 、 温 度 制 御 装 置 と 、 独 自 に 設 計 し た サ ン プ ル 冷 却 容 器 を 組 み 合 わ せ た 装 置(Photo system)を用 いた 。当 該 装置 は水 溶液 中に 微 小な 氷結晶卜20pm)を作成し 、その融解、凝固を観 察し、融点と凝固 点を測定する装置である。不 凍活性は、駐報論文に倣い 、熱ヒステリシス活性 (TH活性＝1融点（ZD―凝固点（めDで評価した。
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結果と考察
In型AFPのQAE異 性 体 は 、 最 も 研 究 例 の 多 いAFPの ー っ で あ る 。 本 研 究 で は ま ず 、 この QAE異 性 体 のTH活 性 の 解 析 を 行 い 、QAE異 性 体 のTH活 性 が 氷 結 晶 の 冷 却 時 間 に 依 存 し て 高まることを明らかにした。その時間経過による上昇度は、冷却温度が低いほど、また氷結晶の大 きさが 小さい ほど増加 した。 またQAE異性体とGFP(green fluorescent protein)との融合タンパ ク質溶 液中の 氷結晶表 面では 、時間 経過と 共に氷 結晶表 面の螢 光強度 が増加し たこと から、TH 活性 の 上 昇 は氷 結 晶表面 でのAFP濃 度の増 加によ るもの だと示 唆され た。以 上の実 験結果を 踏 まえ、 熱ヒス テリシス 現象中 に生じ る突状 の氷結 晶面(convex ice surface)にQAE異性体が結合 するモデルを発表した。
SP異性体 は氷結晶をバイピラミダ´レ形状（六方両錘体）に修飾する点ではQAE異性体と同様で あづた が、QAE異 性体と異なり氷結晶成長を止めることができず、氷結晶はバイピラミダル形状を 維持し たまま 成長を続 けた。SP異性体 の濃度 に依存 して氷 結晶成 長速度 は低下 したが 、高濃度 (5.OmlVDまた 僅かな 過冷却で あって も氷結 晶成長 が制止 する事 ができ ずTH活性 は見ら れなかっ た。
SP異 性体 とQAE異 性体 混 合 液 中の 氷 結 晶 は、QAE異 性 体単 独 の 場 合と 同 様 に 、バ イ ピ ラ ミ ダル 氷 結 晶 の成 長 が 抑 制さ れ 、TH活 性 を 示した 。また 総濃度 換算で 、混合 液のTH活 性は混 合 比に よ ら ず(EQAEコノ[SP]=O.01100)、QAE単独のTH活性と 同等の 値を示 した。 っまりQAE異性 体存在下では、SP異性体はQAE異性体と同程度にTH活性に寄与した。
本 論 文 で は 氷 結 晶 観 察 か ら 、 なぜSP異性 体 がTH活 性 に 寄 与で き る か を考 察 す る 。QAE異 性 体によって成長抑制されたバイピラミダル氷結晶は、その凝固点（ゐにおいてバイピラミッドの頂点 から突 発且つ 迅速な氷 成長(burst ice growth)を開 始する 。これはバイピラミッドの頂点がQAE 異性体 による 氷成長抑 制が最 も弱い 箇所である事を意味している。SP異性体はそもそも氷成長を 止め ら れ な いが 、 頂点か らのburst ice growthに限 れば、QAE異性体 と同程 度に抑 制でき る事 がわか った。 以上からSP異性 体は、QAE異性体 の氷成 長抑制の 弱点であるバイピラミッド頂点の 抑制に加わることで、TH活性に寄与できると考えられる。
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学 位論文審査の要旨 主査
副査 副査 副査 副査
教授 教授 教授 教授 准教授
津田 河野 佐々木 川端 相沢
栄 敬一 直樹 和重 智康
学位論文題名
Study of Ice Growth Inhibitory Ability of Isoforms of TypeIIIAntifreeze Protein
(ni 型 不 凍 夕 ン パ ク質 異性 体の 氷結 晶成 長抑 制能 に関 する 研究 ）
不凍タンパク質(Antifreeze protein: AFP) は、摂氏0 度以下の低温環境に生息す る生物から発見された「氷結晶に結合してその成長を抑制する事によって凝固点を 降 下さ せる 生体 物質」である。これまでの研究によってAFP は複数の構造型に分 類され、さらに各構造型の範疇において異なるAFP 異性体群に細分類されている。
し かし 、AFP 異性 体間の不棟機能の差異やそれらがもたらす協同的な不凍効果に 関する知見は十分に得られていない。本論文は、精密な氷結晶観察技術（溶液中の 微小な氷の単結晶を観察し氷成長抑制能を調べる手法）を用いることによって、世 界 の 多 く の 科 学 者 が 研 究 対 象 に し て い るIII 型 AFP の QAE 異性 体と SP 異 性体 の 不棟機能の差異を見いだすと共に、これらニつの異性体がもたらす協同的な不凍機 能について解析したものである。本論文において、著者は特に氷結晶観察装置の独 自構築を行っている。市販の顕微鏡と温度制御装置に対して冷却器部分を組み合わ せることによって氷結晶形状の温度依存性を極めて高い精度で観測する装置の開 発に成功している。これは世界的にも開発例の少ないものであり、国内では初めて と 言え る。 著者 は、 この装 置を 用い てIII 型 AFP 異性体の活性測定実験を粘り強 く 繰り 返し 行っ た。その結果としてQAE 異性体と氷結晶との新たな結合様式を見 出 し、 さら にQAE 異性 体と SP 異 性体 がも たら す協 同的な 氷結 晶成 長抑 制機 能を 明 ら か に し て 、 III 型 AFP に 関 す る 多 く の 新 し い 知 見 を 得 た と 言 え る 。 こ れら を要 するに、著者はAFP 分子の構造と機能に関する多くの新しい知見を 得たものであり、生物科学の研究分野に対して貢献するところ大なるものがある。
よって本学位論文の著者は、北海道大学博士（理学）の学位を授与される資格があ るものと認める。
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