九州大学学術情報リポジトリ
Kyushu University Institutional Repository
古細菌Thermoplasma volcaniumの全ゲノムDNAの塩基 配列の決定と情報科学的解析
川嶋, 剛
https://doi.org/10.11501/3180684
出版情報：Kyushu University, 2000, 博士（薬学）, 論文博士 バージョン：
権利関係：
古細菌Thermoplasma volcaniumの全ゲノムDNAの 塩基配列の決定と情報科学的解析
2000年
科学技術振興事業団
-eaωRno 一O『(い oE『O一ER28 回一EO O苫コ 052 6=oさ 3a
RoaωRosv、一wnω
一。
3旨
� N
ω
切
.占
。
生命工学工業技術研究所 分子生物部、 DNA情報研究室
嶋 岡t
， ••••• 且EE，F'
古細菌Thermoplasma volcaniumの全ゲノムDNAの 塩基配列の決定と情報科学的解析
2000年
科学技術振興事業団
生命工学工業技術研究所 分子生物部、 DNA情報研究室
} I [嶋 剛
日次
第1章 緒言
第2章 実験材料および方法 6
2-1 序論 6
2-2 T.νolcαIlWIn の培養 7
2-2-1 液体培地での培養 7
2・2・2 ゲルライトプレー卜での培養 8
2-3 パルスフィールドゲル電気泳動 9
2-3-1 サンプルプラグの調整 9
2-3-2 サンプルプラグ内ゲノムDNAの制限酵素による切断 10
2・3-3 パルスフィールドゲル電気泳動 11
11 11
勺乙
出出削州凶巾岡下ノ\+寸J44Jバ/J\ののん AA
N N N D DDムムムノノノア
ゲ 11ゲ
「L A『
A『
A斗.
勺ノ釘
「ノ臼
「ノ』
2-5 λライブラリー(1)の作成 14
2-5-1 λライブラリー(1)の作成 14
2-5-2 λフアージプラークからのPCRによるインサートDNAのI台幅 14
2-5-3 M13フアージを用いたサブクローンライフラリーの作成 15
2-5-4 M13サフクローンライブラリーの一本鎖DNAの調整
2-5-5 M13サブクローンライブラリーのインサ-トDNAのPCR
による増幅
2-6 DNAJ鼠法自己列 の決定
2-6-1 M13サフクローンの塩基配列の決定
2-6-2 人クローンの塩基配列の決定 2-6-3入コンティグの作成
2-7 BACライブラリーの付:þ_え
2-7-1 ゲノムDNAのlhnd III部分切断断片の精製
2-7-2 BACベクターの調整
2-7-3 BACライブラリーの作成
2-8人ライブラリー(II)の作成
Îりコスミドライブラリーの作成
2-10 全ゲノム1話基配列の決定
2-10- ]ギャップを埋めるクローンの選択 2-10-2ギャップを用めるためのPCR
2-10♂ギャップを理めるためのPCRにより得られたPCR産物の塩基配 判決Æ
ユ11 決定した全ゲノムjH基配的lの確認
17
18
19 19 19
20
21 21
ヌ2 25
26
27
28 28 31
32
32
2-12 全ゲノム塩基配列決定過程 の解析 34
2-13 シークエンス戦略と効率 の検討: 1段階法と2段階法 l5
2-14 塩基配列アッセンブル の難易度の検討 36
'2-15 シークエンス反応 の難易度 の 検討 36
2-16 T.v・olcαれWJn 全ORF の相同性検索 37
2-17 T.\ノolcanium 全ゲノムDNAの遺伝子同定 38
2-18 遺伝子の転写方向の同定と複製基点、の推定 40
2-19 電子伝達 系の推定 40
2-20 古細菌の高温への適応 42
第3章 結果および考察 43
ヌーl 遺伝的に均一な1'. '/olcaniwn ゲノムDNAの抽出 43
ヌー2 パルスフィールドゲル電気泳動によるゲノムサイズの推定 17
]-3人ファージプラークからのPCRによるインサートDNAの増幅 49
3-4 BACライフラリーの作成 49 3-11 Shannonのエントロビー 132
3-4-1 ゲノムDNAのHindIII部分切断断片の精製 ..+9
3-4-2 BACベクターの調整 50 3-12 全ゲノム ONAのí�基配列に対する相[nJ性 136
3-4-3 BACライブラリーーの作戎 50
3- 13 電子伝達系 170
1-号 DNAの塩基配列の決定 54
3-5-1 M1Jプアージを用いたサブクローンライブラリーの作成 54 3-] 4 古細菌の高温への適応 1 79
3-5-2 M13サブクローシの一本鎖DNAの調整 54 3-14-1 ゲノムDNAの塩基配布リにおける2塩基の組み代わせ t 79
3-5-3 M13サブクローンインサ-トDNAのPCRによる増幅 5 8 3-14-2 ゲノムDNAのG/C含量とOGT の問に相関はない 185
3-5-4 M 13サブクローンの塩基配列の決定 5 8 3-] 4-3 タンパク質をplで分類すると2群に分かれる 185
3-5-5 λクローンのインサートDNAの塩基配列の決定 59 3-14-4 代謝とOGTの関係 189
3-5-6 人コンティグの作成 70
第4章 総括 192
3-6 人ライブラリー (Il) とコスミ ドライブラリー 71
参考文献 196
コー7 未決定ゲノムDNA領域のDNAの塩基配列の決定 80
3-7-1. 未決定ゲノムDNA領域を埋める BACクローンの選択 80 論文目録 2] 1
3-7-2 犬決定庁、ノムDNA領I或をj埋める ためのPCR 95
J、- 7-き 未決定ゲノムDNA 領域を埋めるコスミドクローンの選択 102 謝辞 212
3-8 決定した全ゲノム塩基配列の確認、 110
3・9 ゲノム'-.の|司 ー遺伝子座のDNA塩基配列決定の重複度 120
3-10 DNA 1%;1;基配列のアッセンブルの難易度 128
第1章 緒言
本研究では、 古細菌において環境に適応して発現する遺伝子群を研究するこ とを目的として、 古細菌の1種、 Thermoplasma volcaniul11 の全ゲノム塩基配タIj を決定し、 ゲノムを情報科学的に解析した。
T.\ノolcanium は、 古細菌という分類群に属する(1)0 1960年代まで'1:.物の分
類は表現型(主として形態) を比較することによっておこなわれてきたが、1960 年代に入ると分子遺伝学の方法と概念が生物の系統関係の研究に導入されるこ ととなり、 タンパク質や核酸の一次配列を比較することによる生物の系統関係 の研究がさかんにおこなわれるようになった。 それにより、 これまで表現型を 比較することにより構築されていた系統関係が再検討された(2)。 イリノイ大 学のC. R.WoeseとG. E. Foxは、3種の真核生物の18SrRNA、 l種のオルガネラ (葉緑体)、 そして9種の細菌の16SrRNA の一次配列を比較した。 その結果、
独自の補酵素を持ち二酸化炭素を利用してメタン生成をおこなう メタン菌同士 は互いに近縁であるが、 他の細菌(真正細菌) とメタン菌との遺伝的距離は、
真正細菌と真核生物との遺伝的距離と同程度隔たってているということを明ら かにした。 この結果から、 Woese らは従来の 2分法、 すなわち、 細胞が明依な コンパートメント(核、 ミトコンドリアや葉緑体)に分かれている真級生物と、
このような コンパートメン卜を持たない原核生物という分類に変わって、 生物 界を真正細菌(eubacteria)、 真核生物(eukaryote)、 そして古細菌(archacbacteria) という3界(urkingdum)に分類することを提唱した(.3 )0 その後、 メタン悶だ けでなく塩濃度の高い環境を好む高度好塩関、 高温で酸性環境ドを好む好熱好 酸菌も古細菌に含まれることが明らかとなり(4)、 さらに、 山細菌は真正細菌 よりも真核生物に近縁であることが示された(5， 6)0 これらの知見を受けて、
現在は図1に示すような系統樹が広く受け入れられている(7)。
RNA合hえ(こ{動くDNA1衣存RNA 宍正細保i のよ う に 単純で な
最適't_行制度のfslL1もの
約 35
TFIIBに相同なタンパク質がTBP-DNA後合体に結 TBP-DNA復
これら の基本転写凶子は fJj i写真絞午
4
物転写開始位置が決定する(19) 。 古利l TATAボックスに村.� \1]する13 tiJJ，4rjíj
さら
この領域に 真核生物のTBPに相IrïJな
上の制御領域 もゲノムサイズが10!Jを超える高等宍十五ノj:_物に比べて知 古細菌と 真核生物の基本的
われわれヒトを含 め た宍 20塩基前後のAT に富む領域が存在する(19)0 TATA ボックスと
これらの肉子はそ ADP-
したがって占細的の基本転写の
ほとんとの古細菌が嫌気環境下でしか生存できないの j宣伝f発現に関わるゲノ
核生物の遺伝子の発現の調節機構を調べ るのに適していることを心している。
(26) 機構を解明することは 真絞生物の基本転写の機構を理解することにつながる。
ヒストン様タンパク質を持つ(9、10、11、12. 1]， 14)
なとの真核生物 に特 有 と 考えられて いたいくつか の特徴を持つ 。
真核生物ではRNAポリメラーゼ 11により転写されるよ邑伝子の5 ' 側、
また、 古細菌 のゲノ ム サイスは1
.
5X 10(】から3 X lO!出基対程度であり (EF-2)がジフテリ74ぷによりTATA結合タ ン パク質 (TBP)が結合し、
RNAポリメラーゼによってRNAが転写される(23)。
その遺伝ヂ数は1500から3000 (27)であることから、
そして、
いことが予想される。 古細医iゲノムのこの単純さは、
合成酵素が真正細菌よりもサフユニット数が多く、
のものと交換しでも正常に機能することから(25)、
な転写の機構は共通であると考えられている。
DNAがクロマチン様構造をとる(15， 16， 17)、
転写機構が真核生物に極めて近いこと、
菌 の遺伝子の 5' 側、 約 25 塩基上流には 、 (TFIIB)が結合し、
後のATに富む領域が存在する(20， 21)0
TFBと呼ばれている(24)。
3
ペプチド鎖伸長国子-2
が多い ことは注目に値する。
タンパク質が結合し (22)、
は、
リボシル化される(8)、
転写因子IIB いわれるこの領域に、
νo/cαI1lwn
古細菌は、
れぞれTBP、 塩基上流に 、
し\ (18)、
DNA 合体に 、
合し、
特に ム
。翠嬰川町出特同特川KJ笹川とり一日~♀山叩(ト)町駅hhedωυωO注
。寂'択のQ駄蕊一刻fH図
凶ω一の凶05E』ωZFH
レ，、....
ー司 ‘、司 ・h司
5づミs2 0' u �
O ト
c �
._圃噌 h句、
ω ~凸トベ ω℃MNC050戸七己ト
‘〉
∞ωHMω=ω切符一'山
何一』ω芯史以。{(廿コ仏
ぴ3Q)
Eo三〉
。己宮 担
2C河川一円四
50ωω工どのとコ凶
∞一句EE〈
』。ぢ司』司ロ同叩お 内問問H muh 』mw ぷ居 間同 g d岡山 ど 司 何一』ω相ω 何日出
に対して、 嫌気環境下はもちろん、 酸素が存在する好気環境下でも生存が可能 な古細関である(1)。 したがって、 他のほとんどの古細菌には見られ ない、 酸 素の存在の有無による発現遺伝子の差が存在することが予想され、 転写ネット ワークの研究対象として好適である。
ゲノム解析計画の進展に伴って、 すでにいくつかの生物の全ゲノムDNA塩
基配列が決定され、 報告されている(27)0 その なかには6 種の古細菌が含まれ る(12，28，29，30，31，32)。 古細菌に分類される生物の多くは、 最適生育温度が 高く、 全ゲノムDNAの塩基配列が決定された6種 の古細菌の内、1種を除いて
取適生育温度が850C以仁の超好熱古細菌である。 また本研究の開始時に全ゲノ ム DNAのj軍基配列決定 の対照と なっていた古細菌も最適生育温度が800C以上 である超好熱古細菌が多かった。 これらの高温環境下に適応した古細菌を対照 にゲノム解析をおこ なう目的は耐熱性の機構の解明にある。 しかし ながら、 高 温環境に適応した生物のゲノム解析だけでは高温適応の機構 の解明は困難であ る。 本研究対照であるT.νolcan.iul11 は、 最適生育温度が 600Cであり、 中度好 熱菌に属する(])。 したがってT. volc仰iumの全ゲノムDNAの塩基配列は、
すでに全ゲノムDNAの塩基配列が決定されている超好熱古細菌と比較するこ とにより、 高温環境への適応機構に関して新しい知見を得るために適している。
本研究ではT.\ノolcaniumの全ゲノムDNAの塩基配列を決定した。 全ゲノム DNA 境基配列の決定の過程で得られた配列決定に関 する方法論も検討した。 さ らにゲノムDNA塩基配列を情報科学 的に解析し、遺伝子を同定し、T. volcaniwn が嫌気/好気両環境下でどのように生息するかを考察した。 また古細菌の高温 への適応機構について考察した。
なお、 本研究は、 兵庫区科大学、 山本義弘博士、 大阪大学微生物病研究所、
牧肘耕:博仁、 第一薬科大学、 荒牧弘範博士、 東北大学、 布柴達男博士、 広島 大学、 河本(建↑卓上の5大学のメンバーにより構成される共同研究グループ、 お
4
よび、 目立計測エンジニアリング(株)テクノリサーチセンタ一、 不三家(株) バイオサイエンス研究所、 雫酒造(株)遺伝子解析センターの3企業との共同 研究によりおこ なった。
5
第2章 実験材料および方法
2・1 序論
1995年、 Thc Institutc for Gcno mic Research (TIGR)に所属するJ. C.Yenterら
のグループは、 ホールゲノムショットガン法と呼ばれ るDNAの塩基配列決定 法を開発した。 それ以 前のゲノムDNA塩基配列は、 制限酵素を利用してゲノ ムの制 限酵泉地凶を作成 し、 λ、 コスミ ドなとのクロ -ニングシステムを用い て作成したケノ ミッククローンライブラリーを整列化し、 個々のクローンのI畠
)!t配 列を決 定する、 いわゆる整 列化クローン法で決定されてきた。 これ に対し てホールゲノムショットガン法は、 ゲノムの制限酵素地図やクローンライブラ リーを作成せず、 ゲノムDNAを直接I.6-2.0kbpのDNAに断片化し、 この断片 の塩基配列を決定し並べていく方法である。 Venter らのグループは、 この方法 で真正細菌のl種、 HaemophilllS lnj7uenzae RDの全 ゲノム ]，83 0，13 7bpのDNA
出基配列を決定した(33 )0 ホールゲノムショットガン法は、DNA塩基配列決 定の実験をはじめるまでの予備実験がほとんど必要ないことから、 迅速にDNA
出基配列データが得られるという利点がある。それゆえ、 以後TIGRのグルー プを�j 1 心として真正細菌のみならず、 真核生物のゲノム塩基配列決定にも適用 されるよう になった(34，35)。
しかし、ホールゲノムショットガン法にも短所がある。それは、全ゲノムDNA 梅本配ダIJを決定するために、{[ð]々の膨大なDNAの塩基配列 を正確につなぎあ わせなければならず 、 そのための DNA塩基配列アッセンブルソフトウェアが 必安である。 しかしながら、 従来 -般的に使用されていた ソフトウェアでは性 位がイ;卜分なため、TIGRでは専川のアッセンブルソフトウェアを開発した(33)0 ホールゲノムショットガン法を行なうためには、 これと同程度のソフトウェア
6
が必要であるが、 入手、 開発が閃難である。
整列化クローン法、 ホールゲノムショットガン法 以 外の DNAの l1t� jよ 配 タIj 決
定法としては、 ゲノムDNAの塩基配列の一部を決定し、 決 定した部分に対応 するプライマーを合成して、 その断片に続く出基配タIJを次々と決定していくブ ライマーウオーキング法(36)や、 1つのクローンを端からlïlJって、 段附的な 長さのクローンを作成し、 未決定の領域を、 そのクローンをもとに決定してゆ くne sted de le tion法(37) があるが、 いずれも'だ験版作が煩*でIJ寺!日jがかかる。
本研究では、 λクローンの整列化ライブラリーを基準とし、 それに別のλ、
コスミド、BACライブラリーとPCRをイ井用し、T. vo/canium の全ゲノムのDNA の塩基配列を決定した。 λクローンのインサ-トDNAの塩 基 配 列 決 定の高辿 化にはPCRを活用し、 ゲノムDNA塩基配列の決定を高速化することに成功 し た。
2・2 T. volcaniumの培養
2・2・1 液体倍地での培養
T νo/caniul11の菌株は、 珂化学研究所微生物系統保存施設にJapan coJJe c tion of micro organism (JCM) のnumber 957] として登録されているものを購入した。
I宮地は0.2g硫酸アンモニウム、 0.5g硫椴マグネシウム、 O.25g J品化力ルシ ウム一二水和物、3 .0g 1)ン酸て水素カリウムを800mlの減附蒸留木に的解し、ION 抗酸を加え ることでpHを1.6に調整した。 用地に滅的蒸留水をJJIIえて890ml
とし、 高圧蒸気滅菌機(トミ-高圧蒸気滅菌機ES-215)をmし1て1210C、 20分、
滅菌したものを崎地1 とした。 室温まで温度を ドげた培地l に、 10% (w/v)グル コースを100ml� 10% (w/v)イーストエクストラクト(Difco) を 10ml、 それぞれ
7
無菌的に加えたものを倍地2とした。 培地2の終濃度は0.02% (w/v) 硫酸アン モニウム、 0.0 5% (w/v) 硫酸マグネシウム、 0.025% (w/v)塩化カルシウム二水 和物、 0.3% (w/v)リン酸三水素カリウム、 1%グルコース、 0.1%イーストエク ストラク卜である (38)。
嫌気出主主の培地は、 培地2に硫黄粉末を4g/Lの割合で 無菌的に混合したもの を、 乾熱滅菌機(サンヨーコンべクシヨンオーブンMOV-212F (U))で1900C、
10時間、 乾熱滅菌した密閉可能な ガラス瓶に入れ、 窒素ガスを充填したのち密 閉したものを使用した。
好気的条件下の関は、 アルミホイルで蓋をした三角フラスコ内で、 600C、 常 圧で培養した。嫌気条件下の菌は、 窒素ガスを充填した密封ガラス瓶内で、600C、
常圧にて培養した (39)。 乾燥菌体が封入されているガラスアンプルは、 70%エ タノールを浸透させたペーパータオルで拭き、 乾熱滅菌したヤスリで切り開封 した。 乾燥菌体はイース卜エクストラク卜の濃度を培地 2の半分に調整した培 地1mlで怒濁した後、 全量を4mlの同じ培地に移した。 植菌した倍地は、 600C で 3 - 5口静置して前培養した。 菌の増殖は、 培地の濁度が上昇することを目視 することで確認した。 前培養液1mlを培地2の100mlに無菌的に加えること で継代した。嫌気培養は嫌気的かつ無菌的に継代した。本培養は、600C、 100rpm でおこ なった。
2・2・2 ゲルライトプレートでの培養
ゲルライト粉末(和光純薬工業)は、 I青地lに10% になるように加え、 高圧 蒸気滅的機で1210C、 20分減I笥した。 滅菌後、 約600C (手で3秒くらい触るこ とができる程度)にjE度をドげた後、 グルコースとイーストエクストラク卜を 加えてI吉I山2と16]f柔のキfihX:とした。 滅菌シャーレ ( 90mm X 1 5mm ) に溶液25ml
8
を無菌的に流し込み硬化させたものをゲルライトプレートとした。 好況I白菜液 を菌体数1 x 10)になるように培地2で希釈し、 ゲルライトプレート夫lfüにf育英 液を均一に塗布し植菌した。 通常、 菌体数は培養液を段階的に希釈したものを 寒天培地等に播き、 得られたコロニー数から計算によって求める。 しかし T νolcanÎlll11はコロニーを形成させるのが困難であったため、 的(本数はI市?を液の
定量を取り、 顕微鏡下で改良型ノイパウエル血球計数盤をmいて数えること により求めた(1)。 植菌したゲルライトプレートは、 好気的条{午ドで600Cの'1任制 槽に静置して培養した。
2-3 パルスフィールドゲル電気泳動
2・3・1 サンプルプラグの調整
使用した菌は、1L の培養液から集菌した。培養開始から48時間経過し、 540nm における吸光度が0.2を こえた ことを確認して集菌した。 菌体は速心機(へやツ
クマンAvanti J25， JLAI0，500 ローター )を用いて 5，000巾m 、 7分、 40Cで遠心
することにより沈澱させた。 遠心上清を除いた菌休沈澱は、 0.1容のイース卜 エクストラク卜を除いた培地 2 に再懸濁し、 同様に遠心することにより洗浄し た。 さらに0.1容の0.0 5Mエチレンジアミン-N、 N、 N'、 N' ーテトラ酢阪 ナトリウム塩二水和物(EDTAと略)pH5.5 と0.1科の0.]25M EDTA pH5.5 で 連続して菌を洗浄した。 洗浄した間体は、 500μiのO.125M EDTA pH5.5に対し て穏やかに懸濁した。 菌の怒濁液は、 500Cの1.6% InCertアガロース(FMC) 500 μlと すばやく、 穏やかに混合した。 混合液は、 10mm x 5mm X 1.5mm のディ
スポーザブルプラグモールド(バイオラド)にすばやく 流し込み、 40Cで硬化 させた。 この操作でゲルプラグは12-13個作成することができた。 硬化したゲ
9
ルプラグは、 プラグモールドか ら付属専用器具で押し出した。 作成したすべて のケルプラグは、30mlの0.5M EDTA pH9.5， 1 % N-ラウリルザルコシン，lmg/ml
Proteinasc K (Proteinase 浴液)に入れ、 穏やかに振濯しながら 370Cで保温し てタンハク伐を|添いた。 Protcinase 溶液は 1時間毎に新鮮なものに換え、 そ れ
を3 Q1J k.�り返した 後、 穏やかに娠をtしながら370Cで48時間保温した。
Protcinasc 治液処理の後、 ゲルプラグはlmM フェニルメチルスルフォニルフ ロリド (PMSFと略)を含む30mlの10mM トリスー塩酸、pH8.0 、 ImM EDTA、
pH8.0 (TEと略)に移して、穏やかに振蛍しながら40C、 1時間処理してProteinase
kを失活主せた。 その後、30mlのTE pH8.0 中で40Cで穏やかに振湿して洗 浄した。 TE pH8.0はl 附悶毎に新鮮なものと交換し、 4時間振溢した。 得られ たゲルプラグは、 パルスフィールドゲル電気泳動のためのサンプルプラグとし て、40Cで保作した(40)。
2-3-3 パルスフィールドゲル電気泳動
2-3-2 サンプルプラグ内ゲノムDNAの制限酵素による切断
パルスフィールドゲル電気泳動に は、 CHEF-DR パルスフィールドゲル'心
気泳動システム(パイオラド)を用いた。 泳動川ゲルは、 I向純度アガロース() \
イオラド)を使用した。 アガ口一スは0.5X TBE 200mlにl 切(w/v)になるよう に 加えた。 アガロース溶液は電子レンジで加熱融解とさせた。 ア力口ースゲルは、
加熱融解させたアガロース溶液をゲルキヤステングスタンド(こ流し込み、 サン プルウェル作成用コームをヶ-ルキャステングスタンドの所定の川町に\'Lて、 主
;品で硬化させることで作成した。 泳動用ゲルが硬化した後、 ゲルのウェルに制 限酵素切断したゲノムDNAを含むサンプルプラグを差し込んだ。 サンプルプ ラグは、 別に溶かしたアガロース を上から流して包坦した。 サンプルプラゲを 包埋したゲルは、 2Lの0 .5 xTBE を満たした泳動槽のr�万一定の位目にI没附した。
通常の泳動は140C、6V/cm 、18時間、 極性切り梓えの時間間隔は60秒から105 秒へ直線的に移行するよう設定して おこなった(ramp 60-105)。 泳動終f後、 ゲ ル を10μg/mlのエチジウムブロマイド溶液にi/�すことでDNAを染色した。
染色したゲルに、紫外線を照射しDNAのバンドを口J視化して写兵に娠影した。
(史川するrHiJI民酵素の]X反応用緩衝j夜1mlにサンプルプラグを浸して、370C、
30分llHF3やかに振出させてサンプルプラグを制限酵素反応用緩衝液で平衡化し たυ fえ比，�LI� lì�に新鮮なiM限醇素の 1X反応用緩衝液200μlを加えて、 制限酵素
を5・10U加えて3rc -1晩反応させた。 反応停止は、500μlの1% N-ラウリルザ ルコシンを含む0.5MEDTA pHS.Oを加え、10分放置することでおこなった。
以応後のゲルプラゲは、 ImlのTE pH8.0を加えて 40Cで1時間、穏、やかに撹 t'I:することで洗浄した。 洗浄後、 ゲルプラグは、 0. 5X卜リスーホウ酸/EDTA 低位行政(TBEとIH品、10 X {米ι;'(ii夜lL中、 トリス108g， ホウ酸55g、0.5M EDTA pH8.0 4(011) 11111 を加えて40CでI H寺問、 穏やかに撹作することで平衡化した0 0.5 XTBEで平衡化したゲルプラゲはサンプルとして使用した(40)。
2-4 ゲノムDNAの抽出
2・4-1ゲノムDNAの抽出(1)
菌の培養液は、 使用する前に、 540nl11に おける吸光度が0.2を，tiiえたことを 確認した。 菌は、 培養液を50mlコニカルチューフに分注し、 述IC， \杉並(べツク マン GSl5R、 C0650ロータ-) を用いて 5，000rpm 、7分、 40Cで遠心するこ
ハU J J
とにより沈澱 させた。 遠心じ青を 除いた菌体 沈澱は、 10ml の洗浄液(0.02%(w/v) 硫酸アンモニウム、 0.05% (w/v)硫酸マグネシウム、 0.025% (w/v) 塩化カルシ
ウム二水和物 、 0.3% (w/v) リン 酸二水素カリウム、 pH1.6) で菌体を再懸濁 し、 5，OOOrpm 、 7 分、 40Cで遠心して集関した後、 細胞懸濁液 1(0.5Mトリス 一塩般 (pH8.0)、 0.2MEDTA、 0.46M水酸 化ナトリウム) 1.85mlを加えて穏 やかに懸濁した。 関懸濁液 に RNase混合液(50% グリセロール、 0.02M塩化
ナトリウム、 O.OOlMEDTA、 0.05Mトリスー塩酸(pH 7.5)、 1mg/ml RNase A ) 50
μlを加えて穏やかに撹件し、550C、15分保温 してRNAを分解した。 RNAを 分解した試料に Protease mÎxture ( 0.05M卜リス一塩酸( pH8.0)、 0.005M塩化
カルシウム、 20mg/ml Proteinase K )を 25μi 加えてお。C、 1時間保温 して タ ンパク質を分解し、 500μl のSalt-out mixture (810 101)を加えて穏やかに撹持
した。 完全に混合した後、 氷中、 10分静置した。 遠心機を用いて9，500中m、 10 分、 40C で遠心し、 ゲノムDNA以外の爽雑物を沈澱として除いた。 爽雑物を
除いた上清に、 100%エタノール 8m! と 2m!のTEpH8.0を加えて穏やかに混 合してゲノムDNAを析出させた。 析出したゲノムDNAは、 ディスポループ で巻取った。 巻取ったゲノムDNAは、 1m!の-200C 70%エタノール中で2-3 [r!]穏やかに振ることにより脱塩し、 風乾 の後、 1m! のTE pH 8.0を加えて、 40C -11免かけて治解した。 得られた溶液は、 ゲノムDNA 溶液(1) として実験に用 いた(39)。
2-4・2 ゲノムDNAの抽出(1I)
l判はゲノムDNAの抽出(1)の方法と全く同様に集菌した。
述心1�消を除いた肉体沈澱 に、 細胞懸濁液II(50mMトリスー塩酸(pH8.0)、
50mM EDTA、 20o/c スクロース) 6mlを加えて、 穏やかに懸濁した。 懸濁した
12
菌は、 600μiの1%ドデシル硫般ナトリウム(SDS と時)を加えて、 隠やかに 完全に混合し、 室温で15分放置することで溶菌した。 溶解した凶行kに、 1('� 8・
ヒドロ キシキノリンを含むTE飽和フェノール(フェノール溶液)を 3ml jJ[]え て、 穏やかに完全に混合した(フェノール抽出)。 続いて、 クロロフォルムと
イソアミルアルコールの混合比が24 : 1の溶液(CIAA と略)を 3m! b[lえて、1111 転振漫機 により室温で1時間、 穏やかに撹件した( クロロフオルム川ilDo 1 回目のフェノール抽出とクロロフォルム抽出が終わったサンプルは、述心機(ベ ツクマン GS15R 、 C0650 ロータ-)を用いて 9ヲ500叩m、5分、 宅温で遠心して 水相と有機 溶媒相へ分離した。 上層 である水層は分取した。 抽出しきれなかっ たDNAを回収するために、 水相を別の滅菌コニカルチューブに移した後の有
機 溶媒相 に 2m!のTE pH8.0を加えて穏やかに撹枠した後、 遠心してTE相を
回収し、 先に回収した水相 とあわせた。 こうして得られた試料溶液に、3m!の フェノール溶液と3mlの C1AAを合わせた溶液(P/C と略)を加えて穏やかに 撹枠した(フェノールーク口口フォルム摘出)。 その後、 試料溶液を 遠心して水 相を分離、 分取した。 フェノールークロロフオルム抽出は、 3回くり返した。 フ エノ-)レーク口口フォルム抽出後、 ク口口フォルム抽出をおこなった。 試料;容液 を遠心し分離した水相をDNA溶液として分取した。DNAは、600μlの3M酢
酸ナトリウム と15mlエタノールを加えて穏やかに転倒混合して析出させた。
析出 したDNAは、 ディスポループで巻取った。 巻取ったDNAは、1m!の-200C 70%エタノール中で 2-3 回穏やかに振ることにより脱塩した。 脱塩した DNA は、 風乾の後 2.5m!のTEpH 8.0を加えて、 40Cで A晩かけて治解 した。 DNA 溶;夜に 5μlのRNaseA (10mg/ml)、5μiの1%SDS、5μlのProteinase K (20mg/ml)
を加えて3rc、 1時間{呆温ーすることにより 、 混入したRNA とタンハク質をうJ 解した。RNAを分解した試料溶液を フェノール.ク口口フォルムでl同抽出し、
ク口口フオルムでl回抽出した。 71<.相は 遠心により分離した。DNAは、 0.1倍
J 3
容の 3M酢酸ナト リウム と2.5 倍寄のエタノールを加えて穏やかに転倒混合 することで析出させた。 析出 したDNAは遠心機(トミ-MX150 、 TMPl1 口ー タ ー)を用いて15，000中m，5分、 40Cで遠心することにより沈澱させた。 沈澱さ
せた DNA は1m1の-2 00C 70%エタノール を加えて2-3回転倒させて洗浄 脱塩した。脱出したDNAは、室温で約5分風乾した。風乾したDNAは500μlの TE pH8.0 を加えて40Cで -晩かけて溶解した。得られた 溶液は、 ゲノムDNA 溶 液(I1)として実験に用いた。
2・5 人ライブラリー(1)の作成
2・5-1 λライブラリー(1)の作成
人 ライ ブラリー(1)は、 ゲノム DNA(1)を使用して、 兵庫医科大学、 山本 義弘博士、 大阪大学微生物病研究所、 牧野耕三博士、 第一薬科大学、 荒牧弘範 博上、 東北大学、 布柴達男博士、 広島大学、 河本健博士の5大学のメンバーに
より構成される共同研究グループの作製し、 整列化 したものを使用した。
2・5-2 λフアージプラークからのPCRによるインサ-トDNAの増幅
λライブラリーをプレーテイングし、 得られたプ ラークを滅菌パスツールピ ペットで拾い、 100μlのTE pH8. 0に懸濁し40Cで保存した(フアージPCR鋳
)�Ino PCRのプライマーは、 λEMBL3左右両アームの配列の一部、 Primer1 ，
5'-ACA GTC GGT GGT CCG GCA GTA CAA TGG ATT ACC-3' とPrimer2 ; 5'
GCA ACC TGC ACC GTA TTG AGC GCA AGA ATC AGC-3'を用いた(41)0 PCR は、 フアージPCR î寿型を5μl 、 プライマー各10pmol/μlをlμi、 dNTP各4mM、
14
LA-Taq 2 .5U (宝酒造)、 総量50μlの反応系で940C、 5分に続いて、 9誌で、 10
秒、 690C、 15分を30 サイクルおこない、 72 0C、 7分の反応の徒、(史日!するま
で 40Cで保存した。
2・5・3 M13フアージを用いたサプクローンライブラリーの作成
人クローンのインサ-卜 DNA は、 人フアージブラークから総hl50μ!の系 でPCRにより増幅した。 増幅したインサ-卜DNA溶液150μI (PCR溶液3本 分)を、 1% アガロース 、 1 xTBEを用い、 ミユービッドゲル電気泳動憎(ア
ドバンス)にて電気泳動し、 インサ-トDNA のバンドを含むゲルを切り出し た。 切り出した ゲルは透析チューブ(スペクトラム 、 MWCD6，000-8、0(0)に人 れ、 ミユーピツド ゲル電気泳動槽にて0.5 xTBEで100V、 1 l時間電気泳動して 増幅したDNAをゲルから溶出した。 溶出したDNAは、 P/C 1-出出、 エタノール 沈澱の後、500μlのTE pH8.0に溶解した。 これを人クローンの インサー卜DNA として、 サブクローン ライ ブラリーの作成に用いた。
入クローンの インサ-卜 DNA の500μlを1.5m1 チューフに入れ、 超音j皮切 断機(BRANSON SON1FIER 250) でマイクロチップを用いて、 最高山力で氷jこ
で1分超音波切断した。 切断したクローンDNAは、 P/C 抽出、 エタノール沈澱 の後 、 乾燥させた。 乾燥したDNAは、 総量2 0μlの系で10UのT4ボリヌクレ
オチドキナ-ゼと4UのDNAポリメラーゼクレノ-断片を加えて370C、 30分 処理し、5' 突出末端の平滑化と末端をリン間変化 した。 処珂後の DNA は、 P/C 抽出、 エタノール沈澱の後、 乾燥した。 乾燥したDNAは、 3' 突出末端の、!えi1't
化の ため、 1 0μlの系で0. 25mM dNTP存在ドで10UのT4DNAポリメラーゼを 加え、 3rc、 5分 保温した。 処理後のDNAは、 P/C抽出、 エタノール沈澱の後 乾燥した。 乾燥したDNAは、 2 7μlのTEpH8.0で溶解し、 3μlのIOXゲルロ
15
ーデイング用緩衝液(0.2 5� ブロムフェノール ブルー 、0.2 5%キシレンシアノ ール EF、30% グリセロール)を加え、 ピペティング して混合した。 このDNA は6%ポリアクリルアミドゲル(7cmX 7cm X 0. 1cm)を用い1 xT BE 、 1 50V、 1
H寺問、 1hÃ?永動した。 泳動終了後10μg/mlのエチ ジウムブロマイド でゲル中の DNAを染色した。 365nm の紫外線照射下で、滅菌外科手術用メス で約ト2kbp
のDNA断片を含むゲル を切り出した。 切り出したゲルは 1. 5ml チュー ブ に入 れ、滅関爪楊枝ですり潰した。 すり潰したゲル に、 400μiの DNA 溶出用緩衝 液(0. 5M酢酸アンモニウム、 10mM酢酸マグネシウム、 1mM EDTA pH8.0 、0.1%
SDS )を加えてDNAを3 rcで一晩溶出した (42)。 溶出液は1 5，000中m 、 40C、
5分遠心の後、P/Ct由出、 エタノール沈澱の後、 乾燥した。
ク口一二ング用ベクターは以下のようにして調整した。 ベクタ-M1 3mp19RF DNA (43)は宝酒造から購入した。M13mp19RFDNAを制限酵素SmaIで切断し、
環状DNAを直鎖状にした後、P/C 抽出、エタノール沈澱 し、滅菌水に懸濁した。
懸濁した DNAは仔牛/ド腸アルカリフォスファターゼ 10Uを加えて370C、 1時 間保温して5'末端を脱リン酸化した。 5'末端を脱リン酸化したベクターは、 P/C 抽出、 エタノール沈j殿、 乾燥した後、 30μl のTE pH8.0 に溶解し、 -20 0Cに保 存した。
ベクターと約1-2kbp のDNA断片のライゲーシヨンは、総量10μ!の系で、350U のT4DNAリガーゼ(宝酒造)を用いて160Cで2日間反応 した。 反応後、P/C
抽出、 エタノール沈澱の後乾燥し10μ!の滅菌水に溶解したものをライゲーシ ヨン反応液とした。M13サブクローンライ ブラリーの形質転換には、 大腸 菌TG1
(42)もしくはJMI09 (4 3)を用いた。 -80 0Cで保存したエレク卜ロポレーシヨン Jijの菌液 50μlにライゲーション反応液lμlを加えて穏やかに 混合し電極間距 離O.lcmのエレクトロボレーション 用キユベット(バイオラド)に移した。DNA はジーンパルサ-(バイオラド)を用い、 1.8KeV、2 5μF、 100 Qの設定で大腸
16
菌 にエレクトロポレーション した。 パルス終fの後、 的液にI引jEな限りすばや
く 7 50μlの SOC用地( 1Lにパクト-卜リプトン20g、 イーストエクストラク 卜 5g、 塩化ナトリウム0.5g、 lN水酸化ナトリウム 1ml 、 1Mグルコース20011 を含む)を加えた。 SOC培地を加えた菌液 100μlを、 300Cで .A免市長したI笥 液 200μl に加えて混合した。菌の混合液は、3rcで1時間保温した後10μl、100 μlをそれぞれ3mlのイソプロピル-1-チオ-β-0-ガラクトシド ( I PTGと
略)を0.02 5mM、 5-ブロモ-4-クロロ- 3-インドリル- β-Dーガラクト シド(X-galと略) を32μg/mlの濃度で含むLBIトップアガー に加えて沼合し、
LB アガープレートの上に均一に広げて同め、 3rc、 一晩保温した。 翌日、 フ レート上に生育した白プ ラーク を、M13サブクローンライフラリーとした。 な
お、 1LのLB培地の組成は、トリプトン 10g、イース卜エクストラク卜 5g 、 出 化ナトリウム5g、 1Nの水酸化ナトリウム1m]である。 lLの LBIトップアガー
の 組成はLB培地lLにパクトアガ-7g である。 LBアガープレートは、lLの LB 培地 に パクトアガ-15gを溶解したも の 2 5m!を、 滅菌シャーレ ( 90mm X
1 5mm ) に無菌的に流し込み固化させたもの である。
2・5・4 M13サプクローンライブラリーの一本鎖DNAの調整
300Cで一晩培養したTGlを2XYT培地(lL中にパクトー卜リプトンl句、
イーストエクストラク卜 l旬、 塩化ナトリウム5gを含む、 pH 7.0) (42) で100 倍に希釈し、 2mlX 9 6穴の 培養ブロックに1mlづっ分注した。(Jフラーケ96 {!�j を滅関爪楊枝でっついて菌培養液に移し、 振盗培養機(タイテックマイクロ ミ キサーTAITEC-E36) で370C、 5-6時間活養した。t育英後、 フロックごと40C
4，500中m 、 30 分遠心 し、 上清をM13 フアージ液として同収した。 M13 ファー ジ液からM1 3サブクローンの 一本鎖DNA を、キアゲンM13 prepキット を用
17
いて、 説明書に従って精製した。必要に応じて、M13サブクローンの一本鎖DNA 溶液を 1μi取り、 0.7%アガロース ゲル電気泳動によって濃度やインサートサ
イスを確認した。 得られた 一本鎖 DNA溶液は、 シークエンス反応をおこなう まで・200Cで保存した。
2・5・5 M13サプクローンライブラリーのインサ-トDNAのPCRによる
増幅
300Cで 1免培養したJMI09をLB 泊地で100倍希釈し、 96穴マ イクロタイタ ープレートに150μiずつ分注し、 自プラーク96個を滅菌爪楊枝でつついて96 六マ イクロタイタープレートに分注した菌培養液に移し、 娠差益培養機で 370C、
5-6時間情養した。 培養後、 96ピンレプリカプレーター(シゲマ ) で約1μlを
PCR 反応液 に移し、PCR でインサ-ト DNA を増幅した。PCRは総容量25μl でおこなった。プライマ ーはLR-3 primer; 5にTCC GGC TCG TAT GTT GTG TGG A-3'とLF-3 primer ; デーGTG CTG C A A GGC G AT TAA GTT GG-3'を各4 pmol，
EX-T，叫0.5U (宝酒造)を加え、 950C、 3分の後、 950C、 20秒、550C、 l分、700C、
2分を 30 サイクル反応し、 700C、 2分間反応した後40Cで保存した。 プライマ -DNAと足質dNTP は、 PCR産物精製用キット( アマシャムフアルマシア) を川い、{史Jn説明書に従って除去した。 必要に応じて、PCR産物を3μl取り、
0.7勺 アガロースゲル電気泳動によって濃度やインサ-トサイズを確認した。
何られたPC'R産物は、 シークエンス反応をおこなうまで-200Cで保存した。
18
2-6 DNA塩基配列の決定
2・6・1 M13サプクローンの塩基配列の決定
M13 サブクローンの塩基配列決定のた めのシークエンス反応は、 シークエン ス反応 ロボッ卜(カタリスト877 、PEアプライドバイオシステムス )を刑いて おこなった。 反応試薬はABl BigDye Pr imer Cycle Sequenci ng Ready Rcaction Kit、
- 2 1M13 (PEアプライドバイオシステムズ)を問いた。反応は、 使用説明書に 従っておこなった。 反応 後のサンプルは、 反応試薬の使用説明書に従ってエタ
ノール沈j殿して回収 した。 回収したシークエンスサンプルは、 3μlのゲルロー ディング緩衝液(脱イオ ン化ホルムアミドと 25mM EDTA， pH8.0、 ブルーデキ
ストラン( 50mg/mI)を5 : 1 の比で混合した もの) に溶解し、 950C、 2分間静 置した 後、 氷上で急冷した。 反応サンプルはDNAシークエンサ一、 ABIPRISM 377XL (PEアプライドバイオシステムズ) を用いて電気泳動した。シークエ ンス用ゲルは、 専用48cm ガラスプレートを用い、使用説明書に従って作成し た。 サンプルコ-ムは48 サンプル用を用いた。 サンプル 1. 2μl を電気泳動に 用いた。DNAシークエンサ-2台を同時に使用し、 96穴プレート1枚分のサン プルの塩基配列を一度に決定できるように 電気泳動した。
2・6・2 入クローンの塩基配列の決定
得られた M13 サブクローンDNAの塩基配列の連結は、 I話基配列連結用ソフ トウェア、Sequencher ( Gene Codes)を用いた。連結を谷易にする ため、 λEMBL3 のレフトアームとライトアームの塩基配列を、得られた M13 サフクローンDNA の塩基配列 ととも に連結させた。 連結が終了した後、 λクローンのインサ-ト
19
DNAは、 クロ一二ングサイトでλベクターのアームと切り離した。 λクローン のインサ-卜DNA は、 片鎖の塩基配列のみ表示し、 その方向はλベクターの レフトアーム、 5' - インサート DNA-3'、 λベクターのライトアームを順方向 とした。 λク口ーンのインサートDNAのどの領域も、M13 サブクローンDNA
の出込配列で少なくても2回以上読まれた時点、で、 そのλクローンのインサ- トDNAの塩基配列を決定したこととした。
l本のM13 サブクローンで決定されている領域は、 その領域をはさんだプラ イマーを合成した。 プライマーの5' 側にそれぞれM13-21 とM13Revの配列 を付け足した。 合成したプライマーを用いて、 Tνo/caniumのゲノムDNAを鋳
唱として、PCRによりl本のM13 サブクローンで決定されている領域を増幅 した。 反応条件はM13 サブクローンライブラリーインサートDNAのPCRに
よる増幅(2-5-5)と同様の条件を用いた。 得られたPCR産物は、 PCR産物精 製 用キットを用いて、 プライマーと基質dN TPを除去した。 その結果得られた 精製PCR産物を鋳型として、 シークエンス反応をおこなった。 シークエンス反 応はGc ncAmp 9600 (PEアプライドバイオシステムズ)を用いておこなった。
反応試薬はABI B igDye Pr imer Cy cle S eque ncing Ready Reaction Kit， -21M13を用 いた。 DNA の塩基配列は、 M13 サブクローンの塩基配列の決定(2-6-1 )と同 級に決定した。
2・6・3λコンティグの作成
DNAのiぷ�t内げiJの決定したλフアージから作ったコンセンサス配列を用い、
Scqucnchcrにより側々のλフアージの相同な配列を重ねることによって、 λコ ンティゲを作JJえした。
20
2・7 BACライブラリーの作成
2・7・1 ゲノムDNAのHind 1I1部分切断断片の精製
塩化マグネシウムを除いた1 X IJind 111反応用緩衝液10011に、 サンプルプラ グ の調整(2-3-1 )で作家したサンプルプラグ8何を渇した。 40C、 4附静目 してサンプルプラグを平衡化した。 平衡化したサンプルプラグは、2Uの/Jilld1 II、
200μgJml仔牛血清アルブミン(BSA)を含み、 塩化マクネシウムを除いた 1 X
Hind III反応用緩衝液 190μl で、40C、1 時間保温して酵素溶液で平衡化した。
制限酵素による部分切断反応は、 2M の塩化マグネシウムを終濃度100 mM にな るように酵素溶液に加えることで開始した。 サンプルプラグ|付のゲノム DNA は、 3TC、 1時間Hind I IIによって切断した。 反応は、 0.5M EDTA 200μl を力[]
えて反応液の入ったチューブを氷中に移すことにより停止した。 以降はサンプ ルプラグ内ゲノムDNAの制限酵素による切断(2-3-2)と全く同様に洗浄したo Hind III で部分 切断した8伺のサンプルプラグは、 0.5xTBEで作成した1%高
純度低融点泳動用アガロースゲルに包埋した。 電気泳動は2Lの0.5xTBEを用 い， 140C、 6V/cm、 固定ramp 90 、 4 時間の後、 140C、 6V/cm、 固定ramp 6 、 12
時間泳動した。 泳動後、 サンプル DNAが存在すると忠われるゲルの大部分 を 切り取った。 残った分子量マーカーとサンプルをエチジウムブロマイ ドで染色
して泳動状態を確認した。 切り取ったゲルから同的の大きさの/find III l析)十を 含む部分のゲルを切り出した。 切り出したゲル)十を、 BACライフラリー作成の ためのゲノムDNA のHind IIJ断片の精製 に用いた。 パルスフィールドゲル電
気泳動の後、 切り出したゲル片の重量を測定した。 ケル重置lm g 、句たり3μl の1 xゲレース(エピセンタ テクノ ロジ-)用緩衝 j夜を加 え て40C、 1 11寺問静置 した。 その後、 1 xゲレース用緩衝液を捨て、 700Cで保温し、 ゲルを完全に溶
21
解した。ゲルが 完全に溶解したことをピペットチップでつついて確認し、 溶液 を450Cに移して5分間静l買した。5分後ゲレースをゲル重量600mg に対してlU 加え 450C、 1時間反M�J�しゲルを完全に分解した。ゲルの完全分解は反応液を氷 上に向き、 再びゲル化が起こらないことを見ることで 確認した。溶液中のゲノ ムDNAの/lind山断片の濃度はサランラップ法(42) で測定した。 得られたゲ ノムDNAのlIind IJI断片は 40Cで保存した。
2・7・2 BACベクターの調整
BAC ベク タ一、 pBcloBACl1(44) を保持する大腸菌株、 HS996 はリサーチジ ェネティック から購入した。 購入した菌株は、 LB/IPTG/X-gal!Cm プレート( ク
ロラムフェニコールを12.5μg/mlの濃度で含むLB/ IPTG/X-galアガ ー プレー ト )で370C、 一晩、 線画培養した(45)。線画培養の結果得られた青色 の単一コ ロニーをクロラムフェニコールを12.5μg/mlの濃度で 含むLB 培地( LB/Cm)、
2m!に組閣し、 370Cで一晩激しく振渥しながら前培養した。本培養は、 LB/Cm 培地lLに前培養液を1m!ずつ植菌し、3rcで激しく振渥しながらおこなった。
l'fjは600nm における吸光度が 0.6から 0.7に達するまで培養した。培養した菌 体は述心機(ベツク マンAvantiJ25， JLAI0， 500ロータ-)を用いて5，000X g、
10分、 40Cで遠心して集|渇した。菌(本沈澱はキアゲンプラスミドマキシキット の Pl渋液10m!で113濁した。!否濁j夜は370C、 20分静置し、 0.2N水酸化ナトリ ウム、1<Ji SD Sを20ml加えて穏、やかに転倒混合して溶菌した。溶菌液は、 室温 で10分静目した後、 氷冷した3M酢酸カリウムpH4.8を15m! 加えて穏、やかに 7 [IIJ転倒泌fTしrj1 fl]した。 'i1利した溶液は室温で 10分静置した後、 遠心機(ベ
ックマン^vantiJ25、JA-25.50口ーター)を用いて20，000X g、 10分、 40Cで遠心 した。何られた上;占を月Ijの谷出に[DJ収した。 上清に対してP/C抽出を2 回おこ
フウ
なった。DNAは、 0.1倍容の 10M酢酸アンモニウムと0.7代のイソプロパノー ルを加えてよく混合し、 -200C、30分静置することで析出させた。析出したDNA は、 10，000X g、 10分、 40Cで遠心することにより沈澱させた。 沈澱させたDNA は 10mlの 70%エタノールで洗浄し、 風乾した(42)0 風乾した DNAは、 8ml のTEpH8.0に溶か した。この溶液に、 30%ポリエチレングリコール8，000(PEG
8，000)を含む1.6M 塩化ナトリウム溶液を0.8倍符加えて40C、 16 n初日i静置して DNAを沈澱させた。 沈澱させたDNAは、 10，000X g、 20分、 40Cで述心して沈
澱として回収した。 得られたDNA 沈澱をImlの T E pH8.0に溶解した。 何られ た DNA 溶液に対して、 フェノールークロロホルム抽出、 クロロホルム川出をお こなった。DNAは分取した水相に 0.1倍容の3M酢酸ナトリウム と2.5 倍容 のエタノールを加えて穏やかに転倒混合し、 -800C、 10分静P11することで析出
させた。 析出したDNAは、 遠心機(卜ミ-MX150、 T MP llロータ-)を)jjし、
て15，000rpm， 5分、 40Cで遠心することにより沈澱させた。 沈澱させたDNAは
1mlの -200C 70%エタノール を加えて2-3回転倒させた後、 15，000rpm， 1分、
40Cで遠心することにより沈澱として回収し、 洗浄脱塩した。洗浄脱塩したDNA は風乾した後、 500μ1TE pH8.0 を加えて 40C 一晩かけて溶解した。
溶解iしたサンプルは、 0.7%アガロースにトリスー酢酸/EDTA緩衝液(TAE と略、 10X 保存溶液 lL 中 242g トリス、 57.1ml氷酢酸、 37.2g EDTA)を用い てミューピッドゲ、ル電気泳動槽により100V、 30分電気泳動した。?JK到Jには 10
μlのサンプルを用いた。泳動終了後、 ゲルを10μg/m!のエチシウムフロマイ ド溶液に浸し、DNAを染色した。DNAのバンドは、 集号外線を照射することで 可視化し、 紫外線照射下で写真に蟻影した。 残りのサンプルに1Iτ19/mlRNase A を終濃度 20μg/m!になるように 加え、 3rc、 2時間j保温して必人したRNAを
分解した(46)0 RNAの分解を、 10μlのサンプルを用いたミユーピツドゲル電 気泳動槽による電気泳動で確認した後、 サンプルの半量をプラスミドセーフ(エ
23
ピセン タテクノロジ-) 50Uで3TCで一晩処理して、 混入したゲ ノムDNA断 片を除いた(47)。ゲノムDNA の分解を10μl の サンプルを用いたミユ ービツ
ドゲル電気泳動槽による 電気泳動 で 確認した後、 残り のサンプルに対してフェ ノールークロロホルム抽出、 クロロホルム抽出をおこない、 エタノール沈澱させ た。沈澱させたDNAは 1m]の -200C 70%エタノールを加えて 2-3回転倒 させた後、 15，000中m， 1分、40Cで遠心すること により 沈澱として同収し、 洗浄
脱塩した。洗浄脱塩したDNAは風乾した後、 100μlのTE pH8.0を加えて40C
一晩かけて溶解した。
このようにして調整したベクタ-DNA 5μlをミューピッドゲル電気泳動槽に より 電気泳動し濃度を確認した。約500ngのベクタ-DNAを終容量100μl に なるように] X Hind III 用緩衝液に 加え、 36UのHind IIIを加えて3TC、 5時
間静置し、 ベクタ-DNAを切断した。切断したベクタ-DNA は、 5μiをミユ ーピツドゲル電気泳動槽により 電気泳動し 切断されたことを確認した。残りの サンプルに対してフェ ノールークロロホルム抽出 、クロロホルム抽出をおこない、
エタノール沈澱させた。沈j殿させたDNAは1m!の -200C 70%エタノールを 加えて2-3向転倒させた後、 15，000中m， 1分、 40Cで遠IL，\することにより 沈澱と して同収し、 洗浄脱塩した。洗浄脱塩したDNAは風乾した。ベクタ-DNA に
生じたHind 1 II切断端の 5'末端 のリン酸基を除去するため、 100μ! の 1X仔牛 小腸アルカリフォスファターゼ 用緩衝液に溶解した。f子牛小腸アル カ リフォス ファターゼ10Uを加えて3TC、1時間静置しHind 111切断端の 5'末端を脱リン
円変化した。 脱リン酸化したベクタ-DNA に対して フェノールークロロホルム抽 川、 クuロホルム抽出をおこない、 エタノール沈澱させた。沈j殿させたDNA は洗浄脱出した。洗浄脱塩したDNA は風乾した後、 30μl の TE pH8.0 に溶解
して、 lμiをミューピッド電気泳動で確認した後、 BACラ イブラリ ー作成用べ クター として-200Cで保存した。
24
2・7・3 BACライブラリーの作成
ライゲ - シヨンは以下の条(午でおこなった。 BACライフラリ ー作成川ベクタ -2μl、 ゲノムDNAのHind III 断片2μl、66mM卜リス一塩限 pH 7.5、6.6mM 塩化マグネシウム、 10mMジチオス レイトール、 O.lmMATP 、 T-lDNAリプj
- ゼ125U (宝酒造)を混合し、 終公量6μ!とし、 160Cで -B免静目した後、 40C で3日静置した。反応後のサンプ ルは、 20mlの 0. 5xTBEを入れた滅的シャー レに浮かべたフィルタ- (ミリ ポア、 タイプVS、 ポアサ イズ0.025μm) tに 滴下し、 室温で2時間透析した。
BACライ ブラリ ーの形質転換に は、 エレクトロポレーシヨン用大脇的エレク トロマ ックスDHI0B (ギブコ BRL)を用いた。-800Cで 保仔したエレク トロポ レーシヨン用の菌液50μlに、 透析したサンプルのiμlを加えて穏やかにビペ
テイングすること によって 混合し、 電極間距離O.lcmのエレクトロポレーショ ン 用キユベットに移した。DNAは ジーンパルサ ーを用い、 l.4KcV 、25μF、 100
Qの設定で大腸菌に エレクトロポレーションした(48)。パ ル ス終fの後、 ，:r-í 液に可能な限りすばやく1m!のSOC培地を加えて、3TCで1時間保温した後、
100μlをLB/IPTG/X-gal!Cm プレートに均一に塗布して、3TC、 -8免{米j品した。
翌日、 プレー卜ょに生育した白いコロニーを、iつずつ滅的Jf\似校でつつき、
各ウェルにLB/Cm培地200μlの人った96穴フレートに移して、370Cで終日 培養した。培地の濁度が上昇することを見て閑の生育をぽ認した後、 I自主主械は
100μlずつ2枚の96穴プレートに分けた。 1枚に2Xグリセロールヴ;液(65切 (w/v)グリセロール 、 O.lM硫酸マグネシウム、 O.025M卜リス-íílJ�般p118.3)を 加えて穏やかにピペティングして混合し、 ー800Cで保存した(49) 0
残りのプ レー卜から各1μlを取り、96本の3m!のLB/Cm府地に植肉し、3TC、
25
1免培養した。 習u、 BACクローンDNAはプラスミド調製機、 PI2:100 (クラ ホウ)を用いて精製し、 50μlのTEpH8.0に懸濁した。 各クローンDNAは制 限醇素Nοl 1によりク口一二ンクサイトの両側を切断し、 インサ-卜 DNAを切 り山した後、 l努アガロースゲルを用いて電気泳動した。 電気泳動終了 後、 ゲ ルを 10μg!mlの エチジウムブロマイ ドに浸してDNAを染色し、 DNAの バン
ドは紫外線照射下で写真に撮影した。 インサ-卜の存在が確認されたクローン は、 パルスフィール ドゲル電気泳動でインサ-卜DNAの サイズを確認した。
パルスフィールドゲル電気泳動は、 ゲルに1%高純度アガロース、 泳動用緩衝 液に0.5xTBEを使用し、 140C、 6V/cm、 ramp 60-105で18時間泳動した。 電
気泳動終f後、 ゲルを10μg/mlのエチジウムブロマイドに浸してDNAを染色 し、 DNAのバンドは、 紫外線を照射し可視化して写真に撮影した。 インサ
卜の存在が確認、されたクローンDNA溶液は、 4 0Cで保存した。
2-8λライブラリー(IJ)の作成
T. l'o/cul1ium のゲノムDNA溶液(Il )を制限酵素Sau 3AI、 0.08Uで部分分 解した。 λアームとのライゲーションの際に、 長いゲノムDNA 断片と短いゲ
ノム DNA断片がとともに挿入されることを少しでも防ぐことを目的として、
ゲノムDNAのSau 3AIによる部分分解物を1% アガロース、 1XTBEを用い、 ミ ユ ー ピッドゲル電気泳動装置により 100 V、30分電気泳動して約2 0kbpのDNA がん� (1:する ゲ ルの部分を切り出した。 切り出したアガロースを滅菌爪楊校で細
かく百令き、 500μlのDNA溶出用緩衝液(0.1%SDS、 0.5M酢酸アンモニウム、
1 ()m M酢円をマゲネシウム、 101MEDTA)を加えて3rc、 -A免溶出した。;容出j夜 はフ ェ ノールークロロホルム抽出をおこ な った後、 1%アガロー ス、 1 xTAEを
川 い、 ミ ユーピッ ド電気泳動装置で 1 00 V、30 分電気泳動して20kbp 前後のDNA
26
の存在を確認した。
λ EMBL3アームとゲノムDNAとのうイゲーシヨン反応は、 λ EMBL3アー ム1μg当 たりのゲノムDNA量を0.5μl、 1.0μl、 3.0μ!と変化させ、 350Uの
T4DNAライゲース(宝酒造)により総量10μ!として、 160C、 4白川1�11J)(Jt�L た。 反応後、 10μ!の反応液全量を、 GIGAPACK IIIXL (ストラトジーン)を11]
いて、 説明書に従いパッ ケージン グした。 λ ラ イブラリーのタ イタ ーの昨認に
用いる大腸関XLl・Blue MRA (P2)は、 0.2% (w/v)マル卜ース、 IOmM悦椴γゲ ネシウムを含むLB 培地3mlで300C、 一日免培長したo XLI-Bluc MRA (P2)は、
使用直前に10mMの硫酸マグネシウムで600nmの吸光度が0.5になるよう后釈 した。 λファージライセートの一部を、 希釈したXLI-Bluc MRA (P2)に加え て、 3rc、 15分静置し、 大腸菌に感染させた。 λファージの感染した大腸附を
含む溶液は、 480CのLBトップアガ一、 3011に力IJえ償件した。 mtf�うした的泌は LBアガープレートの上に均一に流し込み、 3rc-0免静l官した(プレーティン
グ)。 翌日 、 得 られたプ ラーク数を数えて、 λライブラリーの タ イタ ー を倣.1沼 した。
2-9コスミドライブラリーの作成
コスミドライブラリーは、 ゲノムDNA (1I)を使川して、 大阪大乍 微生物 病研究所 遺伝子基礎研究部門 遺伝チ生物学分野の牧野糾:↑専tの作製した
ものを使用した。 プレ ーチインゲの ため、 大腸がíXLI-Bluc MRF、を0.2切(w/v) マルトース、 IOmM硫酸マグネシウムを含むLB .t剖也5011で370C、 ・H免rjíj .t庁長 した。 本培養は0.2% (w/v)マル トース、 10mM 侃椴マグネ シ ウムを合むLB t(1 地5mlに前培養液50μlを加えて370C、 2時間培養したo r�1は、 本I庁長械のIml を 10， 000rpmで3分間遠心することで沈澱させた。 肉体沈澱は 500μlの IOmM
27
の硫酸マグネシウムに懸濁した。 菌懸濁液は、40μiずつ5本のチューブに分 注した。 各チューフに 、40μl の送付された コスミドライセートを加えて、 穏 やかに撹持した。 大腸菌とコスミドライセートの混合液は室温で30分間静置
した後、320μlのLB府地を加えて370C 、1時間培養した。培養後、菌は8，000中m、
3分間、40Cで沈澱 させた。 菌体の沈澱は50μlのLBに懸濁し、LB/Amプレー ト(LB プレートにアンピシリン 、 Amと略、 を 50μg/ml で含む)に均一に塗 布した。 植菌した LB/Amプレートは、3rcで一晩保温した。 得られた コスミ
ドライブクローンはBACクローンと同様にして-800Cで保存した。
2・10 全ゲノム塩基配列の決定
2・10・1ギャップを埋めるクローンの選択
人ライブラリーの塩基配列決定が終了した時点、で生じ たギャップの部分に相 当するクローンはハイブリ夕、イゼーションで選んだ。 ハイブリダイゼ-ション のプローブは、 1)、 人 コンティグの末端に位置するか、 またはコンティグを形
成しなかったλクローンのPCR産物 、 2)、 人 コンティグの末端に位置するか、
またはコンティグを形成 しなかった人クローンの左右両末端から約1.5kbp内側 に位置する 30塩基の配列を選んで 、外向きに作成したオリゴONA、 そして3)、
BAC クローンのクロ-ニンゲサイトを挟んで左右両側に存在するプロモーター を川いて作製したインサート ONAの左右両末端の転写産物である RNAプロー プ、 の1縄類を用いた。 1 )のλクローンのPCR産物は、 OIG ONAラペリン ゲキット(ロシユ ・ ダイアクノスティックス)を用いてOIGラベルした。 2 )
のオリゴONAは、DIGオリゴヌクレオチドγ ー末端ラベリングキット(ロシ ユ ・ 夕、イアグノスティッケス)を用いてOIGラベルした。 3)の RNAプロー
28
ブは OIG RNAラベリングキット(ロシユ ・ タイアゲノスティックス)を用い
てOIGラベルした。ラベルの方法は使用説明書;に従った。1)のλクローンの PCR産物をプローブに用いる場合 、プローブはラベル後、j削除ノ'kq�で 5分処f唱
した後、 氷中に反応チューブを入れ急冷して、 寸ミUJDNAに解断した。2)、 ヌ) はラベル後すぐにプローブとして使用した。 これらをプロープとして、 λライ ブラリー(11)、 BACライブラリーまたはコスミドライブラリーのDNAを同定
したナイロン膜に対してハイブリダイゼーションをおこなった。
ノ\イブリ夕、イゼーシヨンに用いた膜は、以下のようにして作成したoTE pH8.0 に怒濁したクローン ONA?容液の1μlを 、 12.5c01x 8.5c01のバイオタイン Aナ イロンメンブレン(ポール)上に8チャンネルピペットをmいてり6穴プレー トと同じ配置で 浸透させた。風乾したナイロンメンブレンは、1-分;ii;のO.4M ノk 酸化ナトリウム水溶液に]0分浸 して浸透させたクローンDNAを変件した。 ア ルカリ変性したクローン ONAの浸透している膜は、 十分呈の2Mの酢酸アン モニウム水溶液に 10分浸して中和した。 中和した膜は、 2XSSCで412く洗浄し、
ろ紙(ワットマン3MM )上に静置し風乾した。 やや湿った状態まで風乾した 膜は、 DNA 固定装置(GSジーンリンカ一、 ストラトジーン)にONAをのせ た面が上に な るように並べた。 30ミリジュールで紫外線を照射し、 DNA を目立 上に固定した。 膜は使用するまで40Cで保存した。
プレ ノ\イブリダイゼーシヨンとノ\イフリ夕、イゼーシヨンの;符液は、5 x SS C (20 XSS C: 3M 塩化ナトリウム 、 0. 3Mクエン椴ナトリウム二水不r1物、pH7.0)、 2勿 フロッキング溶液(ロシュ ・ ダイアグノスティックス)、 0.1堺(w/v) N-ラウリル ザルコシン 、1% SOS を用いた。 プレハイフリタイゼーシヨンとハイフリタイ ゼーシヨンは上記1)と3)のプローフを使用した場合は680Cで、 2)のプロー フを 使用した場合はプロープとして使用したオリゴ ONAのTmより100C低い 温度で反応した。 プレ ハイブリダイゼーシヨンは、 DNAを回定化した膜を 6X
29
