水生植物の成長を促進する微生物(PGPR)の探索

(1)

「新技術説明会」

－

6

次産業化と明日へのものづくり－

水生植物の成長を促進する新規根圏微生物の発見とその利活用

産業技術総合研究所生物プロセス研究部門玉木秀幸

平成

23-27

年度先端的低炭素化技術開発

(ALCA)

「根圏微生物共生系を活用した高次植生バイオプロセスシステムの開発」

(2)

高次植生バイオプロセスの概念

水生植物

太陽光を動力源とする低炭素型バイオプロセスの開発 Energy

光駆動型生物変換作用 → 技術

N

根圏

P O₂ Ｃ

植物成長促進Ｅ

N ・ P 吸収

根圏微生物活性化 CO

₂

→

賦活化因子の供給

独立栄養生物&再生可能なバイオマス資源

水生植物と根圏微生物の共生系を活用

(3)

洗浄ウキクサ根

（ほぼ無菌だが、完全無菌でない）

P23

なし ⁰

0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

0 50 100 150

フェノール残存率

時間（

h

）

▲ P23 なしウキクサ成長促進活性＆

フェノール分解性＆

（P23は回収も可能）

「新規水草根圏微生物」特願2008-099213号

ウキクサ個体数

0 10 20 30 40

0 50 100 150

時間（

h

）

水生植物で知られる唯一の PGPR

1 ｘ 10⁸ cells/株

40ppm

■

^{P23 あり}

P23

あり

持続的フェノール分解植物成長促進

根圏細菌

Acinetobacter

sp. P23 の再付着実験 P23 付着のダブル効果

水生植物の既存 PGPR: Acinetobacter sp. P23 株

※Plant Growth Promoting Rhizobacteria

（植物成長促進根圏微生物）

(4)

本技術開発のポイント

植物成長を促進する根圏微生物

高次植生バイオプロセスの技術基盤

植物付着で変化する根圏微生物１＋１＝３や５になる生物間相互作用

水生植物と根圏微生物の未開拓共生関係を発掘＆再設計

光エネルギー利用範囲の拡大

(5)

水生植物根圏微生物ライブラリーの構築

各種水生植物からの根圏微生物リソース

長期安定保存

(-80˚C)

新しい根圏微生物の網羅的分離・収集

(6)

水生植物根圏微生物ライブラリーの構築

水生植物根圏微生物ライブラリー

2014

年

8

月現在

180 株程度（ 50 属、 70 種以上）

- Alphaproteobacteria - Betaproteobacteria - Gammaproteobacteria - Deltaproteobacteria - Actinobacteria

- Bacteroidetes

- Acidobacteria - Verrucomicrobia - Armatimonadetes

培養頻度の極めて低い門レベルの系統群

(7)

水生植物根圏から分離された新門微生物

水生植物の根圏環境から分離

写真: ヨシ (Phragmites australis)

低栄養条件

長期間培養

新門微生物の分離培養化に成功

→

^新門

Armatimonadetes

門を提案

新規性

門

(phylum)

綱 (class) 目

(order)

科

(family)

属

(genus)

種

(species)

系統分類階級

高い

低い

(8)

0 5 10 15

Number of fronds

Incubation time [days]

Control

control比 control

根圏微生物添加

Test

根圏微生物添加 Control Test

14 days

25℃

16 h-light/8 h-dark 10000 Lux

葉状体数の control比で PGPR効果を評価実験条件:

植物培養試験管 φ4.0cm

滅菌Hoagland培地 40mL

水生植物:

無菌コウキクサ(Lemna minor)

水生植物の成長促進根圏微生物 (PGPR) の探索

(9)

水生植物の新規PGPRの発見

control MRB1 MRB2

0 20 40 60 80 100 120 140

0 3 6 9 12 15

Number of fronds

Incubation days

Control

P23(2.1) MRB2(3.6) MRB3(4.6)

MRB1(3.4) MRB4(2.9)

MRB3

特許出願「植物成長強化剤及びそれを用いた植物栽培方法」特願

2013-150997

(10)

新規PGPRの分子系統学的分類

菌株名門 or 綱の分類群既知最近縁種 Accession No. 相同性

P23 Gammaproteobacteria Acinetobacter calcoaceticus KC758143.1 99.7%

MRB1 Betaproteobacteria Pelomonas saccharophila ^FJ513082 99.2%

MRB2 Gammaproteobacteria Dokdonella sp. KC157043.1 93.6%

MRB3 Betaproteobacteria Pelomonas saccharophila ^AB681917 99.5%

MRB4 Alphaproteobacteria Bradyrhizobium japonicum JQ514082.1 98.8%

MRB1~4 株は特許微生物として保存機関に寄託

→ 特許出願「植物成長強化剤及びそれを用いた植物栽培方法」特願 2013-150997

(11)

新規PGPRの植物成長促進能力の評価

Control

(Hoagland培地200mL)

Test

(根圏微生物+Hoagland培地) 無菌

ウキクサ 5株

成長評価

葉状体数をカウント +

バイオマス(重量)測定クロロフィル量測定

根圏顕微鏡観察

(根圏定着能有無)

14日間

成長評価

14日間

<根圏微生物菌株評価>

成長促進ホルモン(IAA)生産性シデロフォア生産性

リン可溶化能

【PGPRの能力を多角的に評価】

(12)

Control P23(2.7) MRB4(2.1)

0 100 200 300 400 500 600 700

0 5 10 15

Number of fronds

Incubation days

MRB3(3.8) MRB1(3.8)

MRB2(3.1) YO-36(3.0)

ウキクサ成長促進効果-1: 葉状体数

(13)

0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035

contorl P23 MRB1 MRB2 MRB3 MRB4 YO-36

Dry weight/g-flask

1.6

2.3

2.4 2.3

1.8 1.8

ウキクサ成長促進効果-2: 乾燥重量

(14)

PGPR効果-3: クロロフィル量

0 10 20 30 40 50 60 70 80

control P23 MRB1 MRB2 MRB3 MRB4

Total chlorophyll/100g-fronds

5.9

5.2 5.4 5.5 5.8

PGPR添加対照区 (無添加)

(15)

新規水生植物成長促進微生物の用途

1. 有用植物としての「ウキクサ」の高効率栽培への利活用 2. 植物工場等の植物水耕栽培の高効率化

(1) ウキクサ以外の植物に対する成長促進効果 (2) 低照度条件における植物成長促進効果

(3) 低肥料条件における植物成長促進効果

3. 水生植物-微生物共生系を活用した植生浄化技術の高度化 4. 水生植物-PGPR共培養系による有用物質生産プロセスの開発

- 微生物単独あるいは植物単独では困難な有用物質を作る -

(16)

ウキクサは栄養価の高い植物

ウキクサは高タンパク・高デンプン含有植物

→ デンプン含量も高い時期には、植物体の60%以上になる（非可食バイオマス原料）

→ 植物体あたりのタンパク質含量15-45%で大豆に匹敵（家畜・海産物養殖用の濃厚飼料）

(17)

Lecteron: hepatitis treatment

At its peak a few years ago, Biolex employed about 70 but now 13. (March 2012)

【ウキクサを宿主とした医薬品製造】

(18)

P23 株のレタス＆イネへの効果の実証

レタスレタス

/

大腸菌レタス

/P23

クロロフィル量

:

(mg/100g-plant)

72.0 57.3 92.5

P23 と共培養すると単子葉植物のウキクサだけでなく双子葉植物（レタス）のクロロフィル量も増大する。

（低肥料条件）

P23 クロロフィル

□ 双子葉植物

-

イネへの効果

□ レタスへの効果（双子葉植物）

(19)

低照度条件での成長促進効果の検証

葉状体数の比較コントロール比の比較

P23株、MRB3株ともに低照度条件で高い成長促進効果を示した。

特に、5000 luxの照度でも、PGPR添加系は10000 luxの対照区と同程度の植物成長を維持した。

□ 照度の比較： 10000 lux vs 5000 lux

0 20 40 60 80 100 120 140

5000 lux 10000 lux control

P23 MRB3

No. of fronds

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0

5000 lux 10000 lux

Control ratio

control P23 MRB3

(20)

低肥料条件での成長促進効果の検証

葉状体数の比較コントロール比の比較

P23株、MRB3株ともに低肥料条件で高い成長促進効果を示した。

特に、PGPR添加系は、50倍あるいは100倍希釈した培地でも、無希釈の培地に匹敵する効果を示した。

□ 肥料の濃度の比較： x1, 1/50, 1/100 希釈培地

No. of fronds

0 20 40 60 80 100 120 140

1 1/50 1/100

control P23 MRB3

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0

1 1/50 1/100

Control ratio

control P23 MRB3

(21)

想定される大規模適用現場

〜ケース１：富栄養化水域のオンサイト・オフサイト浄化〜

中国の汚染湖沼水浄化

汚染湖沼水（深刻な富栄養化）

窒素：5.5〜12.4mg/L リン：1.8〜 13.7mg/L オンサイト浄化への適用

省エネルギー型植生浄化技術として良好な水環境を保全・創出

中国雲南省昆明市滇池（テンチ）

中国における水道水源としての基準全窒素：

1 mg/L,

全リン：

0.05 mg/L

都市下水工場廃水

農業排水

都市雨水オフサイト浄化への適用

余剰植物体バイオマスの収処理水穫

適正管理植生システム人工湿地、人工浮き島型植

生システムの設置

余剰植物体バイオマスの収穫

(22)

工場廃水の2次処理水窒素：10 mg/L, リン：3 mg/L

NP：1 mg/L, BPA：1 mg/L

高機能・高性能植生浄化技術として良好な水環境を保全・創出

ノニルフェノール（

NP

）とビスフェノール

A

（

BPA

）の

内分泌撹乱作用濃度：いずれも

1 µg/L

〜

日本の工場廃水仕上げ処理

想定される適用現場

〜ケース２：二次処理水の水質安定化（日本国内）〜

P B

B B

要素技術の組み合わせ・融合

（処理水の水質安定化・管理）

基盤材

制御・管理

処理水

植物：窒素・リン除去

＋根圏微生物：

難分解性有機化学物質分解

＋

ＰＧＰＲ：植物成長促進

＋

基盤材（ろ材）：

窒素・リン・化学物質の蓄積

＋

適正管理：システムの安定化

(23)

本技術に関する知的財産権

• 発明の名称：植物成長強化剤及びそれを用いた植物栽培方法

• 出願番号：特願 2013-150997

• 出願人： JST （科学技術振興機構）、産総研

• 発明者：玉木秀幸、牧野彩花、鎌形洋一、

鈴木和歌子、菅原雅之、三輪京子、森川正章

(24)

水生植物の成長を促進する 微生物(PGPR)の探索

「新技術説明会」

6

水生植物の成長を促進する新規根圏 微生物の発見とその利活用

産業技術総合研究所 生物プロセス研究部門 玉木 秀幸

23-27

(ALCA)

「根圏微生物共生系を活用した高次植生バイオプロセスシステムの開発」

高次植生バイオプロセスの概念

水生植物

太陽光を動力源とする低炭素型バイオプロセスの開発 Energy

光駆動型生物変換作用 → 技術

根圏

植物成長促進 Ｅ

N ・ P 吸収

根圏微生物活性化 CO

→

賦活化因子の供給

独立栄養生物&再生可能なバイオマス資源

水生植物と根圏微生物の共生系を活用

P23

h

h

水生植物で知られる唯一の PGPR

■

P23

Acinetobacter

水生植物の既存 PGPR: Acinetobacter sp. P23 株

本技術開発のポイント

植物成長を促進する根圏微生物

高次植生バイオプロセスの技術基盤

植物付着で変化する根圏微生物 １＋１＝３や５になる生物間相互作用

水生植物と根圏微生物の未開拓共生関係を発掘＆再設計

光エネルギー利用範囲の拡大

水生植物根圏微生物ライブラリーの構築

(-80˚C)

水生植物根圏微生物ライブラリーの構築

水生植物根圏微生物ライブラリー

2014

8

180 株程度（ 50 属、 70 種以上）

- Alphaproteobacteria - Betaproteobacteria - Gammaproteobacteria - Deltaproteobacteria - Actinobacteria

- Bacteroidetes

- Acidobacteria - Verrucomicrobia - Armatimonadetes

水生植物根圏から分離された新門微生物

→

Armatimonadetes

(phylum)

(order)

(family)

(genus)

(species)

水生植物の成長促進根圏微生物 (PGPR) の探索

水生植物の新規PGPRの発見

control MRB1 MRB2

Control

MRB3

2013-150997

新規PGPRの分子系統学的分類

MRB1~4 株は特許微生物として保存機関に寄託

→ 特許出願 「植物成長強化剤及びそれを用いた植物栽培方法」 特願 2013-150997

新規PGPRの植物成長促進能力の評価

葉状体数をカウント +

バイオマス(重量)測定 クロロフィル量測定

根圏顕微鏡観察

【PGPRの能力を多角的に評価】

Control P23(2.7) MRB4(2.1)

MRB3(3.8) MRB1(3.8)

MRB2(3.1) YO-36(3.0)

ウキクサ成長促進効果-1: 葉状体数

ウキクサ成長促進効果-2: 乾燥重量

PGPR効果-3: クロロフィル量

control P23 MRB1 MRB2 MRB3 MRB4

新規水生植物成長促進微生物の用途

1. 有用植物としての「ウキクサ」の高効率栽培への利活用 2. 植物工場等の植物水耕栽培の高効率化

(1) ウキクサ以外の植物に対する成長促進効果 (2) 低照度条件における植物成長促進効果

(3) 低肥料条件における植物成長促進効果

3. 水生植物-微生物共生系を活用した植生浄化技術の高度化 4. 水生植物-PGPR共培養系による有用物質生産プロセスの開発

- 微生物単独あるいは植物単独では困難な有用物質を作る -

ウキクサは栄養価の高い植物

水生植物の成長を促進する微生物(PGPR)の探索

水生植物の成長を促進する新規根圏微生物の発見とその利活用

産業技術総合研究所生物プロセス研究部門玉木秀幸

植物成長促進Ｅ

植物付着で変化する根圏微生物１＋１＝３や５になる生物間相互作用

→ 特許出願「植物成長強化剤及びそれを用いた植物栽培方法」特願 2013-150997

バイオマス(重量)測定クロロフィル量測定

P23 と共培養すると単子葉植物のウキクサだけでなく双子葉植物（レタス）のクロロフィル量も増大する。

都市下水工場廃水

都市雨水オフサイト浄化への適用

工場廃水の2次処理水窒素：10 mg/L, リン：3 mg/L

高機能・高性能植生浄化技術として良好な水環境を保全・創出

• 発明の名称：植物成長強化剤及びそれを用いた植物栽培方法

• 出願番号：特願 2013-150997

• 出願人： JST （科学技術振興機構）、産総研

• 発明者：玉木秀幸、牧野彩花、鎌形洋一、

独立行政法人産業技術総合研究所生物プロセス研究部門

知財担当(副部門長) 扇谷悟

研究担当(主任研究員) 玉木秀幸