博 士 （ 獣 医 学 ） 咼 在弘 学位 論文 題名
Polymorphisms and Antiviral Activity of the Mx and PKR in the Chicken
（ニワトりにおけるMx とPKR の多様性と抗ウイルス活性）
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
動物・宿主細胞には特異的な遺伝子発現により、感染ウィルスの増殖を抑制する機構がある ことが知られている。MxとPKRはイン夕一フェロン(IFN)刺激によって発現し、RNAウイル スに対する抵抗性作用を示す。また、様々な種からMxとPKR遺伝子がク口一ニングされ、そ のcoding領域が解析されている。とくにヒトとマウスでは解析が進み、抗ウィルス作用を持つ 抵抗性Mx遺伝子とPKR'遺伝子の存在が報告されている。ヒトとマウスの場合、人為突然変異 Mxを用いてウイルス感染実験を行った結果、一つのアミノ酸置換によってウイルス増殖抑制 能が変化したことが報告されている。このようにMx遺伝子には、ウイルス増殖抑制にかかわ る領域が存在すると考えられる。PKRはわずかではあるがほとんどの細胞に存在し、IFNに より発現がさらに増強される。ヒトとマウスのPKRを解析した結果、N末端側にはds RNA結 合蛋白の特徴であるds RNA結合ドヌイン(DRBD)が2箇所、C末端側には多くのセリン／スレオ ニンキナーゼを含んでいることが知られている。多くのウイルスがPKRを不活化する断片をコ ードすると共に、多数の感染実験結果から、細胞レベルの感染防御に対してPKRは重要な役割 を果たすことが予測されている。しかし、ウイルスとPKRの相互作用に関してはまだそのメカ ニズムははっきりとは解明されていない。
自然界でウイルスの主な中間宿主と知られているニワトりの場合、ドイツの研究グループか ら白色レグホン種を用いてすでにMx遺伝子のク口一二ングと塩基配列が報告されているもの の、抗ウイルス活性のない感受性夕イプであった。また、二ワトリPKRに関してはまだその構 造や詳しい機能解析がなされていない。本研究は、ニワトりにおいてMxおよびP」繦遺伝子の 多型と発現、ウイルス増殖抑制能の解析を目的として行った。
第一章では、白色レグホン種を含む多数の品種におけるニワトリM遺伝子の検索を行い、
多様性の有無とRNAウィルス感染に対する増殖抑制活性を調べた。すなわち、合計で15品種 のニワトりを用いて11日令の胎子から繊維芽細胞を初代培養し、IFN誘導剤のpoly（I）パC）で 刺激した後total RNAを抽出レた。次にRACE法とRT‑PCRにより全長Mx cDNAをク口一二ン グしcoding領域の塩基配列を決定し、文献の感受性夕イプの白色レグホン種と比較した。その 結果、品種によって10から18箇所の塩基置換が検出され、そのうち6から12箇所においてア ―64ー
ミノ酸置換を 伴うことが認められ、品種に よる多様性がきわめて高い ことが明らかになった。
さらに、シー クエンス結果から文献の感受 性夕イプの白色レグホン種 と遺伝的距離がかなり遠 い と 推 定 さ れ た い く っ か の 品 種 のMx遺 伝 子 を 、 機 能 欠 損 に よ りMxを 発 現 し な い マ ウ ス BALB/3T3 (3T3)細胞に導 入発現させた。それらの導 入培養細胞を用いて組換えGFP遺伝子を持 つ 水泡 性ロ 内炎ウイルス(VSV)による感染実験を行い 、感染細胞数を螢光顕微鏡 下で計測レた と ころ 、シ ャモ を 含む5品種 のMx遺 伝子 はコ ン ト口 一ル より 明らかに抗ウィル ス作用が高か っ た。 一方 ナゴ ヤ 種を 含む2品 種のMx遺 伝子 は 抗ウ イル ス作 用がコント口一ル と同様低かっ た。また、イ ンフルェンザウィルス(H5Nl）を用いた感染実験の結果、VSVと同様な抗ウイルス 活性の多様性 を示した。したがって、二ワ トりにおいてウィルス感染 に対する抵抗性夕イプの Mx遺伝 子が 存在 す るこ とが 初め て見 出された。これ らの結果から、ニワトりのMx遺伝子は品 種間において 多様性があり、その中で機能的な抵抗性夕イプが存在することが明らかにされた。
さ らに 、抵 抗性 夕 イプ 品種 のMx夕ン パクのアミノ酸 配列を他の感受性夕イプと 比較検討した ところ、抵抗 性夕イプあるいは感受性夕イ プにのみ共通して存在する 特異的なアミノ酸置換が 見 出さ れた 。すなわち、631番のアミノ酸がAsnであ る場合は抵抗性、Serである 場合は感受性 を示すことが 確認された。
第二 章で は、二ワトリPKR遺伝子の全長cDNAをク口 一二ングし、その塩基配列 を決定した。
さ らに 、VSV感 染に 対す る増 殖 抑制 活性を調べた。7品種のニワトリ胎子から繊 維芽細胞を初 代培養し、IFN誘導剤のpoly（I）パC）で刺激した後、total RNAを抽出した。他種刷は遺伝子を 比 較検 討し 、ホ モ 口ジ ーの 高い 領域 の 塩基 配列 を基 に作 製 した プラ イマ ー を用 いてRACEと RT‑PCRを行 い、 二 ワト りの 全長PKR cDNAを クロ ーニ ング し た。 その 塩基 配 列を 比較 した結 果 、 二 ワ ト リPKRは550アミ ノ酸 か ら趣 るタ ンパ ク質 で あり 、他 のRNA結 合夕 ンパ ク 質及 び キ ナー ゼ群 の特 徴 であ るニ つのDRBDと多くのキナー ゼドメインが保存されてい ることが確認 さ れた 。ま た、品種にお いて多型を示し、186番、234番、そして507番のアミノ 酸においてー つの塩基置換 によってアミノ酸置換を伴う ことが判明した。さらに、VSV感染に対し感受性PKR を 持つ マウ スBALB／3T3（3T3）細胞を用いてニワト リPKR遺伝子を導入発現させ 、第一章と同 じ方法でVSV感 染実験を行った結果、KS13（R507Q）以外の全てがコン ト口一ルより明らかに抗 ウ イル ス作 用が 高 かっ た。KS‐3の 場合、全部で6つ のクローンのうちぅっは抵 抗性を、また 他 の3っ は 感受性を示し 、ウイルス感染に対し不安定 な抗ウイルス活性を持つこ とが確認され た。
本 研 究 か ら ニ ワ ト り のMxとPKRに は多 型も し くは 変異 が存 在 し、 抗ウ イル ス活 性 につ い て も多 様性 が存在するこ とが分かった。ヒト及びマ ウスのA血遺伝子の多型及び 変異と抗ウイ ル ス活 性の 研究結果と今 回の結果を総合すると、A血 遺伝子はその種内において 系統もしくは 品種間で多様 な多型と変異を持っており、 それが抗ウイルス活性の多 様性を決定している因子 のーっとなっ ていることが推察された。ま た、自然界において主な中 間宿主であるニワトりに は他のホ乳類 が持っている機能的なPKRが 保存されており、C‐末端の ーつのアミノ酸置換によ って多様な抗 ウイルス活性を示すことが示 唆された。
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