博 士 （ 環 境 科 学 ） 東 條 ふ ゆ み
学 位 論 文 題 名
A microbiological study that is conducive to efficient ●
ammonlaremOValprOCeSSeS
（ ア ン モ ニ ア 除 去 プ ロ セ ス の 効 率 化 に 資 す る 微 生 物 学 的 研 究 ）
学位論文内容の要旨
農工 業 廃 水 や 生刪I水 な ど の汚 水中 のアン モニア などの 窒素化 合物 やりン が十分 に除去 され ないま ま環 境水 中に流 入した 場合 、iIl湖沼あ るいは 沿岸部 の富 栄養化 が起こ り、生 態系 の崩壊 や飲料 水の汚染を引き 起こ すこと が危倶 され ている 。また 水質汚 濁は 、利用 可能な 水資源 の減少にもっながり、世界的にも問題と なっ ている 。日本 では 、排水 中の窒 素化合 物や りン、 特定の 有機物 、および重金属などの濃度は水質汚濁防 止法 により 厳密に 規制 されて いる。 以上の こと から、 排水処 理にお いて窒素化合物を効率よく除去すること は重 要であ る。
現在 、ほ とんど の排水 処理施 設にお いて 、微生 物のア ンモニ ア代 謝を利用した活阯汚泥法が用いられてい る。 これは 、通常 好気 的なア ンモニ ア酸化 細菌 群と亜 硝酸酸 化細菌 群による硝化プロセスと、嫌気的条件下 にお ける脱 窒細菌 群に よる脱 窒プ口 セスに よっ て行わ れる。 この2っの プロセ スを経 るこ とで、アンモニア は窒 素ガス にまで 変換 され、 大気中 に放出 され る。ま た、こ れらの 細菌群は、自然界における窒素循環にも 重要 な役割 を果た すも のであ る。
活性 汚泥 はこの ように 複雑な 微生物 群集 から成 り、こ れを用 いて 安定的かつ効率的な水処理方法を確立す る た め に は 、 窒 素 除 去 に か か わ る 主 要 な 細 菌 の 生 態 ・ 機 能 の 理 解 が 不 可 欠 で あ る 。 本研 究で は、ア ンモニ ア処理 プロセ スの 効率化 を念頭 に、嫌 気的 アンモニア酸化細菌に関する生化学的解 析と 新規耐 熱陸ア ンモ ニア酸 化細菌 の取得 を行 った
ま ず、 第一 章では 背景と 本研究 の意 義につ いて論 じたo第二 章では 、従来 の硝 化と脱 窒とい う2段階の ブ ロ セス に と っ て 代わ り 得 る 、 高効 率 な1段 階プ ロ セス とし て期待 される 嫌気的 アン モニア 酸化(Anammox) に関わ る細菌 を生 化学的 に特徴 付けた 。
Anammox細 菌 は 、 嫌 気 的 条件 下 に お い てア ン モ ニ ア を電 子 供 与 体 、部 分 硝 化 に よ り供 給 さ れ る 亜硝 酸 を 電子 受 容 体 と して 、 直 陵 窒 素ガ ス ま で 変 換す る 反 応 を 行 う。Anammox細菌 は細胞 内に膜 で仕切 られた 特 殊 な 器 官(anammoxosome)を 持 っ て お り、 こ こ でAnammox反 応 が 行 わ れる と 考 え ら れ てい る 。 ま た 、 細胞同 士が凝 集し たグラ ニュー ルを形 成す ること で高い アンモ ニア代覇括陸を発現すると同時に、沈降しや す くな る こ と で 、処 理 槽 か ら 流出 し に く く なる 。 こ の こ と から 、Anammox細 菌を活 用する ために は、ア
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ン モニア 代調 制御と 共にグ ラニュ ール形 成に 関する 理解が 重要で ある と考え 、タン パク質の発現解析を行っ た 。
高いア ンモ ニア酸 化活性 をもっCanZ丘ぬ ￠Hs BrocadiaSi血cオの グラ ニュー ルをガ ラスビ ーズを 用い て 完 全に破 砕し 、超遠 心分離 操作に より可 溶陸 の細胞 質タン パク質 画分 と不溶 陸の膜 タンパク質画分を得た。
SDS‐ポ リアク リル アミド ゲル電 気泳動 法（sDS．PAGE）と エドマ ン彡瀬 翠法に よるN末端アミノみ麪a列の決 定 から、 膜画 分に特 異的に 高発現 する3っの タンパ ク質 ￠35，P45，P90）を検出した。これらは相同 陸検索 に よ り 、AnammoX反 応 に か か わる 重 要 な 酵 素と 予 測 さ れ てい る タ ン パ ク質 で あ り 、 さ らに 、 窒素代 謝関 連 遺 伝 子RNApoりmeraseサ ブ ュ ニ ッ ト であ る シ グ マ54に 特 異 的 な二 成 分 制 御 因子 の 下 流 に 連 続し て な ら ん で い る こ と が わ か っ た ま た 、AnammoX反 応と グ ラ ニ ュ ール 形 成 は 密 接 な関 係 が あ る こと か ら 、 こ れ ら の タ ン パク 質 が グ ラニュ ール 形成に も関与 してい る可 能陸も 示唆さ れたそ こで、 これ らの遺 伝子を そ れ ぞれ大 腸菌 に導入 した形 質転換 体を作 出し、細胞接着の指標としてバイオフイルム形成量の測定を行った。
そ の結果 、す べての 形質転 換体に おいて 、ベクターのみの場合に比べてノくイオフィルム形成量が増加した。
ま た 、SDS．PAGEに お い て も 冊 げ とP錨 を 導 入 し た 大 腸 菌 で は 、 目 的 タン パ ク 質 が 発現 し て い る こ と を 確 認 し た こ れ は 伽2c拙n驂 毋 ．s洫cオ の 膜 タ ン パク 質 が 大 腸 菌に お い て も 膜に 局 在 し 得 るこ と を 示 唆 する初 めて の成果 である 。
第 三 章 では 、 火 力 発 電所 の 高 温 排 水 処理 漕 か ら 今 回新 た に 単 離 した 、 耐 熱 陸 のNitmsomonas属細 菌に つ いて 報告す る。
Nitmsomonas属 細 菌 は 、 好 気 的 ア ン モ ニ ア 酸 化 プ ロ セ ス の 鍵微 生 物 で あ ると 共 に 、Anammox細 菌 グ ラ ニ ュ ー ル の 外 側に も 存 在 し 、Anammox反 応 に 必要 な 部 分 硝 化を 担 っ て い ると も 考 え ら れて いる 重要な ア ン モ ニ ア 酸 化 細菌 で ある 。しか し、 独立栄 養陸細 菌で増 殖速 度が遅 いこと や、pH、水温 、有機 物負荷 など の 環境 要因を 受けや すいこ とな どから 、アン モニア 処理の 律速 となっ ている 。従っ て、硝化槽活性汚泥内に お いて 硝化反 応を担 う細菌 の優 占種を 同定し 、その 諸特陸 を明 らかに するこ とは、 効率的なアンモニア除去 プ ロセ スにと って非 常に重 要で ある。 実際、 火力発 電所排 水処 理場で は自治 体排水 処理場の活陸汚泥を用い て いる が、排 水の温 度や成 分が 大きく 異なる などの 原因で 、ア ンモニ ア除去 処理速 度が不安定で非効率的で あ ると ぃう問 題をか かえて いる 。そこ で、火 カ発電 弼ぴ冰 に適 応した 耐熱陸 アンモ ニア酸化細菌を取得する こ とを 目的に 実験を 進めた 。
火 カ 発 電所 排 水 処 理 上の 活 陸 汚 泥 か ら、MA培 地を用 いて細 菌の 集積培 養を行 った後 、1％ゲラ ンガ ムを 加 え たMAプ レ ー ト に段 階 希 釈 し て 培養 し た 。 出 現し た コ ロ ニ ーをMA培 地 で振 と う 培 養 し、 培 地 中 の ア ン モ ニ ア 残 存 量と 亜 硝酸 残存量 、及 乙席鱶 液濁度 の測定 を行 い、再 度、MAプ レー 卜に塗 布して コロニ ーを 形 成 さ せ たア ン モ ニ ア の減 少 と 亜 硝 酸の 増 加 が 見 られ た コ ロ ニ ー につ い て16S rRNAの 解 析 を 行い 、 相 同 ´陸 検索を 行った ところ 、Am． ぬm凹2a．s伽斑mえ 皿嵒Nm2Tと97．7％の 相同性 を示した。しかし、生育可 能 温 度 を 調 べ た と こ ろ 、Nm斑 田 珊 おNm2Tは37℃ 以 上 で は 生 育 で き な い の に 対 し 、 単 離 し た 朋b弧 鉛 m伽 甜sp．は48℃ で も生 育 可 能 で あっ た こ と 、菌体 サイズ の違い 、生育 可能 な炭酸 濃度が 異なる こと など か ら 、 本 菌 に つい て 耐 熱 陸 を有 す る 新 種 のべm． 圃 凹 船属 細 菌 、Wぬ瑯 卿 卿s舶 口閉 〇 め 細賀msp．nov． を 提 案 し たN曲 出 伽 勿 ぬ 謝 硲は 、 有 機 物 が少 な い 一 方 で灰 分 を 多 く 含む 排 水 を 比 較 的高 温 条件（37・45
℃ ） で 処 理 す る 、 火 カ 発 蔔 听 の 排 水 処 理 槽 と い う 非 常 に 特 殊 な 環境 に 適 応 し てい る と 考 え られ る 。
学位論文審査の要旨 主査 教 授
副査 教 授 特任助教 教 授
森川 福井 三輪 岡部
学 位 論 文 題 名
正章 学 京子
聡（大学院工学研究院）
A microbiological study that is conducive to efficie'nt ●
ammonla removal processes
（アンモニア除去プロセスの効率化に資する微生物学的研究）
農工業廃水や生活排水など汚水中のアンモニアやりンが十分に除去されないまま環境水中に 流入した場合、河川湖沼あるいは沿岸部の富栄養化が起こり、生態系の崩壊や飲料水の汚染を 引き起こすことが危惧されている。また水質汚濁は、利用可能な飲料水資源の減少にもっなが り、人類の生存にもかかわる重大な問題となりつっある。すなわち、排水から窒素化合物を効 率 よく 除去 す るこ とは 自然 生態 系の 維持 のみ なら ず人 類生 存の ため に も重 要で ある 。 現在、ほとんどの排水処理施設では、微生物のアンモニア代謝活性を利用した活性汚泥法が 用いられている。これは、通常好気的なアンモニア酸化細菌群と亜硝酸酸化細菌群による硝化 プ口セスと、嫌気的条件下における脱窒細菌群による脱窒プ口セスによって行われる。この2 段階プ口セスを経ることで、アンモニアは窒素ガスにまで変換され、大気中に放出される。ま た、近年になって嫌気的条件下でアンモニアを酸化する（アナモックス）細菌が注目されてい る。以上これらの細菌群は、自然界における全地球レベルでの窒素循環にも重要な役割を果た すものである。．
まず、第一章では背景と本研究の目的および意義について論じた。第二章では、従来の硝化 と脱窒という二段階プ口セスにとって代わり得る、高効率な一段階プ口セスとして期待される 嫌 気 的 ア ン モ ニ ア 酸 化 (Anammox) に 関 わ る 細 菌 を 生 化 学 的 に 特 徴 付 け た 。 Anammox 細菌は、嫌気的条件下においてアンモニアを電子供与体、部分硝化により供給さ れる亜硝酸を電子受 容体として、直接窒素ガスまで変換する反応を行う。Anammox 細菌は細 胞 内 に 膜 で 仕 切 ら れ た 特 殊 な 器官 (anammoxosome) を持 って おり 、こ こで Anammox 反 応 が行われると考えられている。また、細胞同士が凝集したグラニュールを形成することで高い アンモニア代謝活性を発現すると同時に、沈降しやすくなることで、処理槽から流出しにくく なる。以上のことか ら Anammox 細菌をさらに活用するた．めには、アンモニア代謝制御と共 にグラニール形成に関する理解が重要であると考え、膜局在性夕ンパク質の発現解析を行った。
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高 い ア ン モ ニ ア 酸 化 活 性 を も つ Candidatus Brocadia sinica の グ ラ ニ ュ ー ル を ガ ラ ス ビ ー ズ で 完 全 に 破 砕 し 、 超 遠 心 分 離 操 作 に よ り 可 溶 性 の 細 胞 質 夕 ン パ ク 質 画 分 と 不 溶 性 の 膜 夕 ン パ ク 質 画 分 を 得 た 。SDS‑ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動 法 と ェ ド マ ン 分 解 法 に よ るN末 端 ア ミ ノ 酸 配 列 の 決 定 か ら 、 膜 画 分 に 特 異 的 に 高 発 現 す る3つ の タ ン バ ク 質(P35，P45，P90)を 検 出 し 、 同 定 し た 。 こ れ ら は ア ミ ノ 酸 配 列 の 相 同 性 検 索 に よ り 、Anammox反 応 に か か わ る 重 要 な 酵 素 と 予 測 さ れ て い るanamoxosome夕 ン パ ク 質 で あ る こ と 、 さ ら に 、 そ の 遺 伝 子 群 は 窒 素 代 謝 関 連 遺 伝 子RNA polymeraseサ ブ ュ ニ ッ ト で あ る シ グ マ54に 特 異 的 な 二 成 分 制 御 因 子 の 下 流 に 連 続 し て な ら ん で い る こ と が わ か っ た 。 そ こ で 、 こ れ ら の 遺 伝 子 を そ れ ぞ れ 大 腸 菌 に 導 入 し た 形 質 転 換 体 を 作 出 し 、 遺 伝 子 産 物 の 膜 へ の 輸 送 の 指 標 と し て バ イ オ フ ィ ル ム 形 成 量 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、 す べ て の 形 質 転 換 体 に お い て 、 ベ ク タ ー の み の 場 合 に 比 べ て バ イ オ フ ィ ル ム 形 成 量 が 増 加 し た 。 こ れ は CandidatusB．sinica の 膜 夕 ン パ ク 質 が 大 腸 菌 に お い て も 膜 に 輸 送 さ れ る こ と を 間 接 的 に 示 唆 す る 初 め て の 成 果 で あ る 。
さ ら に 本 論 文 で は 、 喫 緊 の 問 題 を か か え る 排 水 処 理 現 場 へ の 対 策 に も 取 り 組 ん だ 。 火 力 発 電 所 排 水 処 理 場 で は 自 治 体 下 水 処 理 場 の 活 性 汚 泥 を 用 い て い る が 、 両 排 水 の 温 度 や 成 分 が 大 き く 異 な る な ど の 原 因 で 、 ア ン モ ニ ア 除 去 処 理 速 度 が 不 安 定 で 非 効 率 的 で あ る と い う 問 題 を か か え て い る 。 そ こ で 第 三 章 で は 、 火 力 発 電 所 排 水 に 適 応 し た 新 規 な 耐 熱 性 ア ン モ ニ ア 酸 化 細 菌 の 取 得 を 目 的 に 実 験 を 進 め た 。
火 力 発 電 所 排 水 処 理 槽 の 活 性 汚 泥 か ら 、MA培 地 を 用 い た ア ン モ ニ ア 酸 化 細 菌 の 集 積 培 養 後 、 1％ ゲ ラ ン ガ ム を 加 え たMAプ レ ー ト に 段 階 希 釈 し て ア ン モ ニ ア の 減 少 と 亜 硝 酸 の 増 加 を 示 す コ 口 二 ー を 取 得 し た 。 こ の 細 菌 に つ い て16S rRNA遺 伝 子 の 解 析 を 行 し ゝ 、 相 同 性 検 索 を 行 っ た と こ ろ 、tVitrosomonas communis Nm2と97.7％ の 相 同 性 を 有 す る 近 縁 種 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た 、 生 育 可 能 温 度 を 調 べ た と こ ろ 、N. communis Nm2は37℃ 以 上 で は 生 育 で き な い の に 対 し 、 単 離 し た 細 菌 くJPCCT2と 命 名 ） は48℃ で も 生 育 可 能 で あ っ た こ と 、 細 胞 形 態 の 違 い 、 生 育 可 能 な 炭 酸 濃 度 が 異 な る こ と さ ら に はDNA‑DNA hybridization testな ど か ら 、 JPCCT2に つ い て 耐 熱 性 を 有 す る 新 種 の tVitro． 90monas属 細 菌 、Nitrosomonas thermotolerans sp. nov.を 提 案 し た 。N. thermotoleransは 、 有 機 物 が 少 な い 一 方 で 灰 分 を 多 く 含 む 比 較 的 高 温(37‑42℃ ） な 排 水 と い う 特 殊 な 環 境 に よ く 適 応 し て お り 、 本 菌 数 を 増 強 す る こ と が 、 火 力 発 電 所 排 水 処 理 槽 の 安 定 化 お よ び 効 率 化 に 直 結 す る こ と が 期 待 さ れ る 。 以 上 、 ア ン モ ニ ア 除 去 プ 口 セ ス に お い て 利 用 さ れ て い る 活 性 汚 泥 は 非 常 に 複 雑 な 微 生 物 群 か ら 構 成 さ れ 、 ま だ 個 々 の 生 理 生 態 や 機 能 は 十 分 に 理 解 さ れ て い な い 。 こ こ で 得 ら れ た 数 多 く の 研 究 成 果 は 、 よ り 効 率 的 な ア ン モ ニ ア 処 理 技 術 の 基 盤 開 発 を 通 し て 環 境 科 学 の 発 展 に 大 い に 貢 献 す る も の で あ る 。
審 査 委 員 一 同 は 、 こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し 、 研 究 に 対 す る 申 請 者 の 誠 実 か つ 熱 心 な 取 り 組 み の 姿 勢 と 、 大 学 院 博 士 課 程 に お け る 研 鑽 や 修 得 単 位 な ど も あ わ せ 、 申 請 者 が 博 士 （ 環 境 科 学 ） の 学 位 を 受 け る 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た 。
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