Microsoft PowerPoint - 柴田　 リサーチカンファ

卵巣癌を免疫抗原として作製された

ヒトモノクローナル抗体HMOCC‐1により特異的に認識される

モノまたはジ硫酸化N‐アセチルラクトサミンオリゴ糖構造

の同定

柴田 俊章

浜松医科大学 大学院5年

HMOCC‐1

糖鎖

卵巣癌

卵巣癌

??

??

HMOCC‐1

??

卵巣癌

卵巣癌

正常卵巣組織

生体内での糖鎖

エネルギー源 砂糖・米・でんぷん、ブドウ糖。グリコーゲンなどは、グルコースを多数結合させて、体 内でのエネルギー源として保存しやすい形に蓄積したもの。 生体内での糖・糖鎖 内でのエネルギ 源として保存しやすい形に蓄積したもの。 細胞骨格 セルロースなどは、丈夫な繊維になるため、動植物の体を構築する素材として重要。

複合糖質

タンパク質、脂質と結合して存在している。 （糖タンパク質、糖脂質、プロテオグライカン）

糖鎖の研究対象

ヘパリン コンドロイチン硫酸硫 など 糖蛋白は 1本の蛋白質に 短い糖鎖（単糖が20個まで）が 1本の蛋白質（コア蛋白）に、長い糖鎖（単糖 レセプター トランスポーター など ・糖蛋白は、1本の蛋白質に、短い糖鎖（単糖が20個まで）が、 1～数百本の糖鎖が結合している。 ・糖脂質は、1本の脂質分子に、1本の糖鎖が結合している。 1本の蛋白質（コア蛋白）に、長い糖鎖（単糖 が100～1万個：グリコサミノグリカン）が結合し ている。

糖鎖の特徴（1）

～構成～ （１）ヒトの場合では、約10種類の単糖が決まった ルールに従って、樹状・複雑に連なって、糖鎖を形成 する する。 （２）反応基が多い。 β‐D‐グルコース β D グルコ ス （３）立体構造が多様である。＝異性体を多く持つ。

糖鎖の特徴（2）

～糖タンパク質～ 糖タンパク質の糖鎖には、 ・アミノ酸のアスパラギン残基に結合しているN型糖鎖（N結合型糖鎖） ・アミノ酸のアスパラギン残基に結合しているN型糖鎖（N結合型糖鎖） ・アミノ酸のセリン（Ser）やスレオニン（Thr）に結合しているO型糖鎖（O結合型糖鎖） が存在する。 N N O N結合型糖鎖： 構造は複雑。 シグナル伝達やタンパク質のフォールディングに関係している。 O結合型糖鎖： 比較的 構造は単純。 O結合型糖鎖： 比較的、構造は単純。 ムチン（粘液）中に多数存在し、ムチン糖鎖とも呼ばれている。

糖鎖の特徴（3）

～糖鎖の生合成～ 設計図 DNA 転写 mRNA 翻訳 タンパク質 タンパク質の生合成 設計図 糖転移酵素 転写 翻訳 構築 設計図 DNA mRNA 糖転移酵素 硫酸転移酵素など （タンパク質） 転写 翻訳 糖鎖の生合成 構築 _糖鎖 転移酵素 種類ある ＊この転移酵素は、200‐300種類ある。

糖鎖の設計図は鋳型ではなく、糖鎖構造の把握が難しい。

反面、

反面、

研究の技術として、遺伝子研究法・タンパク質研究法を応用できる。

（例）B3GNT7（ beta Gal beta‐1 3‐N‐acetylglucosaminyltransferase 7 ）という酵素の場合 （例）B3GNT7（ beta Gal beta 1,3 N acetylglucosaminyltransferase 7 ）という酵素の場合 3位 1位 β ガラクトース 3位 1位

＋

B3GNT7 β‐ガラクトース β‐N‐アセチルグルコサミン β‐ガラクトース β‐N‐アセチルグルコサミン

GlcNAcβ1 ‐3Gal

GlcNAc

Gal

β1,3

HMOCC‐1

HMOCC‐1は、

・卵巣癌を特異的認識する

・完全ヒトモノクローナル抗体

である。

治療抗体の作用機序

① ADCC（Antibody-dependent cellular cytotoxicity）活性

d d

ヒト化抗体・ヒト抗体

糖鎖

② CDC活性：補体依存性細胞障害活性 （CDC: Complement-Dependent Cytotoxicity） ③ 細胞内情報伝達の阻害

モノクロナール抗体の種類

Murine Human

Fab

Fc

( = omab) ( = ximab) ( = zumab) ( = umab)

Rit i b T t b ® Rituximab Cetuximab Trastuzumab Bevacizumab (Rituxan®_{) (Herceptin}®₎ (Avastin®₎ (Erbitux) 第一世代：マウス抗体 第 世代：マウス抗体 第二世代：キメラ抗体 第三世代：ヒト化抗体 最新 ：ヒト抗体 HAMAが産生される マウスの抗体を患者に投与すると異物としてマウス抗体に対する抗体 （ＨＡＭＡ：human anti mouse antibody）ができて、薬効失う。 最新 ：ヒト抗体

HMOCC‐1による各組織の組織免疫染色

各臓器に対する特異性の評価 卵巣癌各組織型における染色性の違い 染色強度 Weak Moderate Strong A 漿液性腺癌 A: 漿液性腺癌 B: 粘液性腺癌 C: 類内膜性腺癌 D: 明細胞性腺癌 Suzuki N, et al. Gynecologic Oncology 95, 2004. D: 明細胞性腺癌 HMOCC‐1は、卵巣癌に特異的に結合し、 その中でも粘液性腺癌・明細胞腺癌に対しより高い特異性を示す。

HMOCC‐1抗原決定基の特徴

HMOCC‐1の抗原は、

・膜型糖タンパク質。

・糖鎖部分を認識している。

・N結合型糖鎖。

小活１

(1) HMOCC‐1は、ヒト卵巣癌細胞を特異的に認識する完全ヒト抗体

である。

(2) 認識抗原は、N‐結合型糖鎖である。

本研究では、「糖転移酵素」および「硫酸転移酵素」を

遺伝子工学的手法で探索し、HMOCC‐1が認識する構造を決定した。

HMOCC‐1の抗原決定基を同定する方法

研究1.

(1)目的の酵素遺伝子を、HMOCC‐1抗原をもたないHEK細胞に遺伝子導入し

同定

発現させることにより、抗原決定基を生合成するのに必要な酵素を

同定

する。 遺伝子導入（トランスフェクション） リポフェクタミン＋Plus試薬

目的の酵素遺伝子

細胞

抗

遺伝子導入（トランスフェクション） プラスミドベクター

推定

HEK

細胞（

_HMOCC‐1

抗原（

－

））

(2) 同定された酵素群より、抗原決定基と考えられる糖鎖構造を

推定

する。

研究2.

・推定された糖鎖構造をELISAアッセイ、siRNA、質量分析法で

確認する。

HMOCC‐1抗原の生合成に必要な

糖転移酵素（GT）と硫酸転移酵素（ST）の同定

研究1‐1

＜方法１．＞

準備した酵素群の中に目的の遺伝子があるか調べる。

8 つの

糖転移酵素

糖転移酵素

（GTs）

_6つの

硫酸転移酵素

FUT1 

FUT2 

B3GALT5

CHST 1

硫酸転移酵素

（STs）

B3GALT5

GCNT1

GCNT3

CHST 1

CHST 2

CHST 4

HEK

細胞

B3GNT4 

B3GNT6

CHST 5

CHST 6 

GAL3ST3

HEK

細胞 （_HMOCC‐1抗原（－））

B3GNT7

GAL3ST3

HMOCC‐1抗原の生合成に必要な

糖転移酵素（GT）と硫酸転移酵素（ST）の同定

研究1

＜方法２．＞

14種類の酵素のうち、ひとつずつ除いて遺伝子導入することにより、必須とされる 酵素 酵素群 を 定す

8GT 6ST

酵素（または酵素群）を同定する。

ひとつずつ

8GTs+ 6STs

ひとつずつ

酵素を除く

残り

13種類の酵素を

遺伝子導入する

HEK

細胞（HMOCC‐1抗原（－））

HMOCC‐1抗原の生合成に必要な

糖転移酵素（GT）と硫酸転移酵素（ST）の同定

研究1‐1

1次抗体：HMOCC‐1 発色：HRP AEC試薬

結果2.

Mock 8GTs+ 6STs

8 つの

糖転移酵素

（GTs）

_6つの

発色：HRP－AEC試薬

FUT1 

FUT2

（GTs）

_6つの

硫酸転移酵素

（STs）

8GTs 6STs

FUT2 

B3GALT5

GCNT1

CHST 1

CHST 2

8GTs 6STs

GCNT1

GCNT3

B3GNT4 

CHST 2

CHST 4

CHST 5

B3GNT6

B3GNT7

CHST 6 

GAL3ST3

HMOCC‐1抗原の生合成に必要な

糖転移酵素（GT）と硫酸転移酵素（ST）の同定

研究1

b

a

c

d

結果2.

－FUT1

－FUT2

－GCNT1

f

e

g

_h

－GCNT3

－B3GNT4 －B3GNT6 －B3GNT7

j

k

l

i

－B3GNT7

j

k

l

i

－CHST1

－CHST2

－CHST4

－GAL3ST3

－GAL3ST3

m

n

a. None,  b. FUT1,  c. FUT2,  d. GCNT1, GCNT3 f B3GNT4 B3GNT6 h B3GNT7 Removal enzyme

GAL3ST3

e. GCNT3,  f. B3GNT4,  g. B3GNT6,  h. B3GNT7, i. CHST 1,  j. CHST 2,  k. CHST 4,  l.  GAL3ST3, m. CHST 5,  n. CHST 6. 

－CHST5

－CHST6

HMOCC‐1抗原の生合成に必要な

糖転移酵素（GT）と硫酸転移酵素（ST）の同定

研究1

結果2.

b a c d f e g h

CHST1 

g j k l i m n Removal enzyme a. None,  b. FUT1,  c. FUT2,  d. GCNT1, e. GCNT3,  f. B3GNT4,  g. B3GNT6,  h. B3GNT7, i. CHST 1,  j. CHST 2,  k. CHST 4,  l.  GAL3ST3, m. CHST 5,  n. CHST 6.  y

CHST1が発現していないと、HMOCC‐1抗原の生合成は亢進する。

CHST1が発現していることにより、HMOCC‐1抗原の生合成は抑制されている。

HMOCC‐1抗原の生合成に必要な

糖転移酵素（GT）と硫酸転移酵素（ST）の同定

研究1‐1

確認実験： HMOCC‐1抗原の生合成に必要不可欠と考えられるB3GNT7とGAL3ST3は、 確 本当に必要なのか確認する。

a

b

c

a. GAL3ST3 only, b CHST1 only

d

e

f

b. CHST1 only, c. B3GNT7 only, d GAL3ST3+CHST1

d

e

f

_{d. GAL3ST3+CHST1,} e. CHST1 +B3GNT7, f. GAL3ST3 +B3GNT7.

B3GNT7とGAL3ST3は、HMOCC‐1抗原生合成に必要不可欠と確認された。

研究1‐1の結果の小活

8 つの

糖転移酵素

糖転移酵素

（GTs）

6つの

硫酸転移酵素

FUT1 

FUT2

硫酸転移酵素

（STs）

FUT2 

B3GALT5

GCNT1

CHST 1

CHST 2

GCNT1

GCNT3

CHST 2

CHST 4

CHST 5

B3GNT4 

B3GNT6

CHST 5

CHST 6 

B3GNT7

GAL3ST3

研究1‐1の結果の小活

8 つの

糖転移酵素

糖転移酵素

（GTs）

6つの

硫酸転移酵素

FUT1 

FUT2

硫酸転移酵素

（STs）

FUT2 

B3GALT5

GCNT1

CHST 1

CHST 2

GCNT1

GCNT3

CHST 2

CHST 4

CHST 5

B3GNT4 

B3GNT6

CHST 5

CHST 6 

B3GNT7

GAL3ST3

酵素B3GNT7とGAL3ST3とCHST1の働き

B3GNT7

（ beta Gal beta‐1,3‐N‐acetylglucosaminyltransferase 7 ）

＋

B3GNT7

Gal ‐ GlcNAc

Gal ‐ GlcNAc

Gal – GlcNAc ‐ Gal – GlcNAc

β1,3

Β1,4

β1,4

N型糖鎖の末端はポリラクトサミン構造を持つことが多く、糖鎖 末端 リラク 構造を持 多 、 B3GNT7は、この構造を生合成している。 B3GNT7 ラクトサミン構造

β1,3

N型糖鎖の例 ラクトサミン構造 ラクトサミン構造

酵素B3GNT7とGAL3ST3とCHST1の働き

GAL3ST3

（ beta‐galactose‐3‐O‐sulfotransferase 3 ）という酵素の場合

‐ X‐ X ‐

‐ X‐ X ‐ ＋

GAL3ST3

H

₂

SO

₄ ‐

_O

3

S 3

X X 

Gal

X X  ＋

H

₂

SO

₄

CHST1

( k t lf t D l t 6 O lf t f ）という酵素の場合

O

₃

S 3

Gal

CHST1

( keratan sulfate D‐galactose‐6‐O sulfotransferase ）という酵素の場合

SO

₃

‐ X‐ Gal ‐ X ‐ X ‐

Gal

Gal

CHST1

6

Gal

Gal

＋ H

₂

SO

₄

‐ X‐ Gal ‐ X ‐ X ‐

Gal

Gal

SO

₃ CHST1

‐ X‐ Gal ‐ X ‐ X ‐

Gal

Gal

6

研究1‐2

HMOCC‐1抗原決定基の構造推定とCHST1の調節酵素としての働き

＜方法の概要＞

調節遺伝子としての

B3GNT7

必須な糖転移酵素

GAL3ST3

必須な硫酸転移酵素

CHST 1

調節遺伝子としての

硫酸転移酵素

B3GNT7

GAL3ST3

CHST 1

いろいろな組み合わせで遺伝子導入することにより、

相互作用を明らかにして

HMOCC 1抗原決定基の構造を

推定

する

HMOCC‐1抗原決定基の構造を

推定

する

CHST1の調節酵素としての働きの推定。

HEK

細胞（HMOCC‐1抗原（－））

研究1‐2

HMOCC‐1抗原決定基の構造推定とCHST1の調節酵素としての働き

＜結果１＞

＜方法１＞

3G

G

3S 3

B3GNT7 + GAL3ST3

B3GNT7 → GAL3ST3 +CHST1

抗原を発現する

_細胞が

_細胞が

_{少なくなる}

_{少なくなる。}

研究1‐2

HMOCC‐1抗原決定基の構造推定とCHST1の調節酵素としての働き

B3GNT7 + GAL3ST3

ポリラクトサミンの基本骨格 ポリラクトサミンの基本骨格 β1,3 Produced Backbone structure  by B3GNT7. GAL3ST3

：Gal

β1,3

：GlcNAc

HMOCC‐1 抗原決定構造

‐

_O

3

S 3

HMOCC‐1抗原決定基の構造推定とCHST1の調節酵素としての働き

研究1‐2

抗原を発現する

B3GNT7 → GAL3ST3 +CHST1

抗原を発現する

細胞が

少ない

ポリラクトサミンの基本骨格 β1,3 Produced Backbone structure  GAL3ST3 +CHST1 by B3GNT7. SO₃‐ SO₃‐ β1,3 ‐_O 3S 3 β1,36 β1,3 ‐_O 3S 3 3 6 HMOCC‐1 antigen SO₃‐ _SO 3‐ SO₃‐ SO₃‐ 6 SO₃‐ 6 β1,3 6 ‐_O 3S 3 β1,36 6 ‐_O 3S 3 6 _β1,36

抗原を発現する

B3GNT7 → GAL3ST3 +CHST1

抗原を発現する

_細胞が

_少ない

ポリラクトサミンの基本骨格 β1,3 β1,3 Produced Backbone structure  by B3GNT7. GAL3ST3 +CHST1

_SO

3‐

6

β1,3 ‐_O 3S 3

β1,3

6

3

競合

HMOCC‐1 antigen ‐

O

3

S

3

抗原を発現する

B3GNT7 → GAL3ST3 +CHST1

抗原を発現する

細胞が

少ない

ポリラクトサミンの基本骨格

CHST1を含む2つのガラクトース硫酸転移酵素を

同時に

発現する

β1,3 Produced Backbone structure  by B3GNT7. GAL3ST3 +CHST1

C S を含む

のガラクト ス硫酸転移酵素を

同時に

発現する

ガラクトースへの硫酸基の結合が

競合する

GAL3ST3 +CHST1

SO

₃‐ GAL3ST3 +CHST1

HMOCC‐1抗原の生合成が抑制される。

β1 3

6

競合

β1,3 HMOCC‐1 antigen ‐_O 3S 3

β1,3

‐

_O

3

S

3

研究1‐2

HMOCC‐1抗原決定基の構造推定とCHST1の調節酵素としての働き

＜結果２＞

＜方法２＞

B3GNT7 + GAL3ST3

B3GNT7 + GAL3ST3 → CHST1 

抗原を発現する

細胞が

多くなる。

抗原を発現する

抗原を発現する

細胞が

多くなる。

B3GNT7 + GAL3ST3 → CHST1 

ポリラクトサミンの基本骨格 β1,3 Produced Backbone structure  by B3GNT7. β1,3 ‐_O 3S 3 GAL3ST3 HMOCC‐1 antigen 3

SO

₃‐

SO

₃‐ _CHST1 β1,3

6

‐

_O

3

S

3

β1,3 ‐

_O

3

S

3

6

β

SO

₃‐

_SO

3‐ β1,3

6

6

‐

_O

3

S

3

抗原を発現する

抗原を発現する

細胞が

多くなる。

B3GNT7 + GAL3ST3 → CHST1 

ポリラクトサミンの基本骨格 β1,3 Produced Backbone structure  by B3GNT7. β1,3 ‐_O 3S 3 GAL3ST3 HMOCC‐1 antigen 3

SO

₃‐

SO

₃‐ _CHST1 β1,3

6

‐

_O

3

S

3

β1,3 ‐

_O

3

S

3

6

β

SO

₃‐

_SO

3‐ β1,3

6

6

‐

_O

3

S

3

より強いHMOCC‐1 antigen

小活

（1） HMOCC‐1抗原の生合成に必要な糖転移酵素（B3GNT7）と硫酸転移酵素

（GAL3ST3）を遺伝工学的手法を用いて同定した

（GAL3ST3）を遺伝工学的手法を用いて同定した。

（2）

SO₃‐ 6 6 ‐_O 3S 3

競合

Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐ 4GlcNAc1β ‐

CHST1の発現バランスにより、

生体内でHMOCC‐1抗原量の調節を行っていることが示唆される。

3

（3） HMOCC‐1の抗原決定基は、下記のように推定された。

3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐ 4GlcNAc1β ‐

‐_O 3S

or SO3‐

3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐4GlcNAc1β ‐6

‐_O 3S

推定糖鎖構造の確認実験

3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐ 4GlcNAc1β ‐

‐_O 3S β β β β 3 or 3G lβ1 4Gl NA β1 3G lβ1 4Gl NA 1β6 SO₃‐

O S 3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐4GlcNAc1β ‐

‐_O 3S

(1) 化学合成されたHMOCC‐1抗原決定基の糖鎖構造による

ELIZA Inhibition Assay。

(2) RMG‐1細胞における必要糖転移酵素糖鎖遺伝子のRT‐PCR。

(3) siRNAを用いたB3GNT7とGAL3ST3の遺伝子ノックダウン実験。

(3) siRNAを用いたB3GNT7とGAL3ST3の遺伝子ノックダウン実験。

(4)質量分析法による卵巣癌組織試料における目的糖鎖構造の同定。

推定糖鎖構造の確認実験

3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐ 4GlcNAc1β ‐

‐_O 3S β β β β 3 or 3G lβ1 4Gl NA β1 3G lβ1 4Gl NA 1β6 SO₃‐

O S 3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐4GlcNAc1β ‐

‐_O 3S

(1) 化学合成されたHMOCC‐1抗原決定基の糖鎖構造による

ELIZA Inhibition Assay。

(2) RMG‐1細胞における必要糖転移酵素糖鎖遺伝子のRT‐PCR。

(3) siRNAを用いたB3GNT7とGAL3ST3の遺伝子ノックダウン実験。

(3) siRNAを用いたB3GNT7とGAL3ST3の遺伝子ノックダウン実験。

(4)質量分析法による卵巣癌組織試料における目的糖鎖構造の同定。

化学合成されたHMOCC‐1抗原決定基の糖鎖構造による

ELIZA Inhibition Assay の原理

RMG‐1細胞を96穴プレートで培養。 4％パラホルムアルデヒド in PBS で固定。 0 3％過酸化水素水で内因性ペルオキシダーゼを阻害 化学合成オリゴ糖 _{0.3％過酸化水素水で内因性ペルオキシダ ゼを阻害。} HMOCC‐1（一次抗体）と濃度を振り分けた化学合成オリゴ糖 （阻害物質）の混成液を各ウェルの細胞に振りかけ、インキュ ベ 時 化学合成オリ 糖 ベーション。（1時間） HRP結合の2次抗体（Human IgM antibody）を振りかけ、イン キュベーション。（1時間） HMOCC‐1 キュベ ション。（1時間） 余分な2次抗体を洗浄。 （ ） を化学発光 （ 分） RMG 1細胞 TMB（tetramethylbenzidine）にてHRPを化学発光。（30分） 硫酸により反応中止。 RMG‐1細胞 HMOCC‐1抗原決定基 RMG‐1細胞に結合しているHMOCC‐1を吸光度450nmで測定。

化学合成されたHMOCC‐1抗原決定基の糖鎖構造によるELIZA Inhibition Assay 硫酸化していないジ・ラクトサミン構造 VS VS B3GNT7 ＋Gal3ST3に相当する 末端ガラクトース3位がひとつ硫酸化されたジ・ラクトサミン構造 No sulfated and Blue line: Non‐sulfated tetrasaccharide. Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐3Galβ1 ‐4GlcNAc1β ‐ NH₂ No sulfated and mono‐sulfated Green line: Mono‐sulfated tetrasaccharide.

3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐ 4GlcNAc1β ‐ NH₂

‐_O 3S

B3GNT7 ＋Gal3ST3に相当する 末端ガラクトース3位がひとつ硫酸化されたジ・ラクトサミン構造

VS

Gal3ST3＋B3GNT7→CHST1に相当する

末端ガラクトース3位と内部ガラクトース6位のふたつが硫酸化されたジ・ラクトサミン構造

Green line: Mono‐sulfated tetrasaccharide

Mono‐sulfated and disulfated

Green line: Mono‐sulfated tetrasaccharide.

3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐ 4GlcNAc1β ‐ NH₂

‐_O 3S

Purple line: Di‐sulfated tetrasaccharide.

SO₃‐

3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐4GlcNAc1β ‐ NH6 ₂

SO₃ ‐_O

推定糖鎖構造の確認実験

3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐ 4GlcNAc1β ‐

‐_O 3S β β β β 3 or 3G lβ1 4Gl NA β1 3G lβ1 4Gl NA 1β6 SO₃‐

O S 3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐4GlcNAc1β ‐

‐_O 3S

(1) 化学合成されたHMOCC‐1抗原決定基の糖鎖構造による

ELIZA Inhibition Assay。

(2) RMG‐1細胞における必要糖転移酵素糖鎖遺伝子のRT‐PCR。

(3) siRNAを用いたB3GNT7とGAL3ST3の遺伝子ノックダウン実験。

(3) siRNAを用いたB3GNT7とGAL3ST3の遺伝子ノックダウン実験。

(4)質量分析法による卵巣癌組織試料における目的糖鎖構造の同定。

RMG‐1細胞における必要糖転移酵素糖鎖遺伝子のRT‐PCR

～方法～ 卵巣癌細胞（RMG‐1細胞）に先の実験で得られたHMOCC‐1抗原を生合成するのに 必要不可欠な糖転移酵素が本当に発現しているのかRT‐PCRで確認した。 RMG‐1細胞を培養。 RNAをRMG‐1細胞からTRI‐zol試薬にて抽出。 RNAをRMG 1細胞からTRI zol試薬にて抽出。 Oligo(dT)

Primer にて、1st strand cDNAを作製。 Primer       にて、1st strand cDNAを作製。 Reverse transcriptase

PCR（右記条件）にて、それぞれのPrimerを用い増幅。 Gel 解析にてそれぞれの酵素のmRNA発現を確認。

RMG‐1細胞における必要糖転移酵素糖鎖遺伝子のRT‐PCR

GAL3ST3遺伝子は、RMG‐1細胞において強く発現している。

その一方 GAL3ST遺伝子の残り3つのサブタイプは発現がとても弱い

その一方、GAL3ST遺伝子の残り3つのサブタイプは発現がとても弱い

もしくは発現していない。

3G

遺伝子は

G 1細胞において発現している

B3GNT7遺伝子は、RMG‐1細胞において発現している。

推定糖鎖構造の確認実験

3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐ 4GlcNAc1β ‐

‐_O 3S β β β β 3 or 3G lβ1 4Gl NA β1 3G lβ1 4Gl NA 1β6 SO₃‐

O S 3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐4GlcNAc1β ‐

‐_O 3S

(1) 化学合成されたHMOCC‐1抗原決定基の糖鎖構造による

ELIZA Inhibition Assay。

(2) RMG‐1細胞における必要糖転移酵素糖鎖遺伝子のRT‐PCR。

(3) siRNAを用いたB3GNT7とGAL3ST3の遺伝子ノックダウン実験。

(3) siRNAを用いたB3GNT7とGAL3ST3の遺伝子ノックダウン実験。

(4)質量分析法による卵巣癌組織試料における目的糖鎖構造の同定。

siRNAを用いたB3GNT7とGAL3ST3の遺伝子ノックダウン実験

HMOCC‐1抗原の生合成に、B3GnT7とGAL3ST3が本当に必要不可欠か確認する。

RMG‐1細胞をガラススリップの上で50％程度となるまで培養する。

目的の酵素のsiRNAをX‐treme transfection reagent (Roche)で導入する。 さらに4日間培養する。

HMOCC‐1でsiRNAを導入したRMG‐1細胞を免疫染色する。 Image J ソフトで定量解析を行う。

siRNAを用いたB3GNT7とGAL3ST3の遺伝子ノックダウン実験

No transfection Control siRNA GAL3ST3 GAL3ST4 B3GNT7

siRNAs

siRNAs

RMG‐1細胞においてGAL3ST3とB3GNT7 は、

HMOCC‐1抗原の生合成に必要な酵素である。

No transfection Control siRNA

GAL3ST3 GAL3ST4

B3GNT7 *p=0.0191

siRNAs

siRNAs

*p=0.0191

siRNAs

siRNAs

推定糖鎖構造の確認実験

3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐ 4GlcNAc1β ‐

‐_O 3S β β β β 3 or 3G lβ1 4Gl NA β1 3G lβ1 4Gl NA 1β6 SO₃‐

O S 3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐4GlcNAc1β ‐

‐_O 3S

(1) 化学合成されたHMOCC‐1抗原決定基の糖鎖構造による

ELIZA Inhibition Assay。

(2) RMG‐1細胞における必要糖転移酵素糖鎖遺伝子のRT‐PCR。

(3) siRNAを用いたB3GNT7とGAL3ST3の遺伝子ノックダウン実験。

(3) siRNAを用いたB3GNT7とGAL3ST3の遺伝子ノックダウン実験。

(4)質量分析法による卵巣癌組織試料における目的糖鎖構造の同定。

卵巣癌組織より抽出した試料の精製方法

実際の卵巣癌組織において、今回同定した糖鎖であるHMOCC‐1抗原決定基構造が 発現し るかを調べる 発現しているかを調べる。 組織（25g）を1mM EDTAを含むpH7 4のTris HCl緩衝液でホモジナイズする 組織（25g）を1mM EDTAを含むpH7.4のTris‐HCl緩衝液でホモジナイズする。 ホモジナイズされた組織の懸濁液をProteinase Kでタンパク消化する。（45C, 24時間） 可溶部分をSephadex G‐15で脱塩する。 ペプチドから糖鎖を脱離するため、0.5M水酸化ナトリウム（NaOH）と1M水素化ホウ 素ナトリウム（NaBH ）で処理する （アルカリβ脱離 常温 24時間 ） 素ナトリウム（NaBH₄）で処理する。（アルカリβ脱離、常温, 24時間 ） Sephadex G‐15で脱塩する。 Sephadex G‐50で糖鎖分画を集める。 さらに、QAE‐Sephadexカラムで硫酸化グリカン分画を集める。 （陰イオン交換クロマトグラフィー） （陰イオン交換クロマトグラフィー）

質量分析法による卵巣癌組織試料における目的糖鎖構造の同定

MALDI‐MSとMS/MS、陰イオンモード

2ヶ所硫酸化された 推定された構造である(HexHexNAc)n 構造 は

含まれていることが確認できた

含まれていることが確認できた。

まとめ

（1） HMOCC‐1抗原の生合成に必須な

糖転移酵素（B3GNT7）

と

硫酸転移酵素

（GAL3ST3）

を遺伝工学的手法を用いて同定した。

（2）

_{CHST1とGAL3ST3の発現バランス}

により、

生体内でHMOCC‐1抗原量の調節を行っていることが示唆された。

（3） HMOCC‐1の抗原決定基は、下記のように決定された。

3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐ 4GlcNAc1β ‐

‐_O 3S

or SO3‐

3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐4GlcNAc1β ‐6

‐_O 3S

考察 （学位審査、リサカン用）

糖鎖構造を同定するための従来の方法

（１）既知の糖鎖もしくは糖脂質をプレートに並べ、それらを抗体と反応させること により網羅的に調べる方法。 ・既知の糖鎖構造しか同定できない。 ・糖タンパク質を合成するのは困難なため、プレートにならべられた糖鎖、 もしくは、糖脂質に抗体が反応しなければ同定できない。 （２）糖鎖を試料より抽出して、質量分析法を用いてその構造を同定していく方法。 ・高純度の糖鎖としての試料抽出が難しい。

本方法の有益性

・糖及び硫酸転移酵素遺伝子導入により、抗原糖鎖は細胞自体で生合成されるので 糖蛋白質にも適用できる。 ・何より大掛かりな分析機器を必要とせず、どの研究室でも適用できる。 我々は本研究で示した遺伝子技術を利用した方法は 将来広く適用できるであろうと 我々は本研究で示した遺伝子技術を利用した方法は、将来広く適用できるであろうと 考えている。

考察・今後の展望 （分子標的研究会用）

（１）卵巣癌診断の一助となる。そのためには、本糖鎖構造が修飾されている血清分 泌糖タンパク質と卵巣癌の存在の関係をELISA法などにより検討する必要がある。 泌糖タンパク質と卵巣癌の存在の関係をELISA法などにより検討する必要がある。 （２）今回同定した糖転移酵素、もしくは糖鎖構造の発現が予後などに及ぼす影響を 検討する必要がある。 検討する必要 ある。 （３）正常組織でも発現を認めているため全身的な治療薬としては使用しにくいが、下 記の例のように局所の糖鎖相互作用が癌の発育に関係している際の局所治療薬と して利用できる可能性がある。 CA125のコア蛋白であるMUC16に結合しているN結合型糖鎖と CA125のコア蛋白であるMUC16に結合しているN結合型糖鎖と 腹膜中皮細胞上に発現しているMesothelinというタンパク質が 結合力が強く、卵巣癌の腹膜播種に関係している。

Gubbels J et al Molecular Cancer 2006 5: 50 Gubbels J et al, Molecular Cancer 2006, 5: 50.