siRNAssiRNAs

siRNA を用いた B3GNT7 と GAL3ST3 の遺伝子ノックダウン実験

No transfection Control siRNA

GAL3ST3 GAL3ST4

B3GNT7

No transfection Control siRNA

GAL3ST3 GAL3ST4

B3GNT7 *p=0.0191

siRNAs siRNAs

*p=0.0191

siRNAs

siRNAs

推定糖鎖構造の確認実験

3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐ 4GlcNAc1β ‐

‐O₃₃S β β β β

or

3G lβ1 4Gl NA β1 3G lβ1 4Gl NA 1β6 SO₃^‐

O S 3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐4GlcNAc1β ‐

‐O₃S

(1)  化学合成された HMOCC‐1 抗原決定基の糖鎖構造による ELIZA Inhibition Assay 。

(2) RMG‐1 細胞における必要糖転移酵素糖鎖遺伝子の RT‐PCR 。 (3) siRNA を用いた B3GNT7 と GAL3ST3 の遺伝子ノックダウン実験。

(3) siRNA を用いた B3GNT7 と GAL3ST3 の遺伝子ノックダウン実験。

(4) 質量分析法による卵巣癌組織試料における目的糖鎖構造の同定。

卵巣癌組織より抽出した試料の精製方法

実際の卵巣癌組織において、今回同定した糖鎖であるHMOCC‐1抗原決定基構造が 発現し るかを調べる

発現しているかを調べる。

組織（25g）を1mM EDTAを含むpH7 4のTris HCl緩衝液でホモジナイズする 組織（25g）を1mM EDTAを含むpH7.4のTris‐HCl緩衝液でホモジナイズする。

ホモジナイズされた組織の懸濁液をProteinase Kでタンパク消化する。（45C, 24時間）

可溶部分をSephadex G‐15で脱塩する。

ペプチドから糖鎖を脱離するため、0.5M水酸化ナトリウム（NaOH）と1M水素化ホウ 素ナトリウム（NaBH ）で処理する （アルカリβ脱離 常温 24時間 ）

素ナトリウム（NaBH₄）で処理する。（アルカリβ脱離、常温, 24時間 ） Sephadex G‐15で脱塩する。

Sephadex G‐50で糖鎖分画を集める。

さらに、QAE‐Sephadexカラムで硫酸化グリカン分画を集める。

（陰イオン交換クロマトグラフィー）

（陰イオン交換クロマトグラフィー）

質量分析法による卵巣癌組織試料における目的糖鎖構造の同定

MALDI‐MSとMS/MS、陰イオンモード

2ヶ所硫酸化された 推定された構造である(HexHexNAc)n 構造 は 含まれていることが確認できた

含まれていることが確認できた。

まとめ

（1） HMOCC‐1 抗原の生合成に必須な糖転移酵素（ B3GNT7 ）と硫酸転移酵素

（ GAL3ST3 ）を遺伝工学的手法を用いて同定した。

（2） CHST1 と GAL3ST3 の発現バランスにより、

生体内で HMOCC‐1 抗原量の調節を行っていることが示唆された。

（3） HMOCC‐1 の抗原決定基は、下記のように決定された。

3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐ 4GlcNAc1β‐

‐O₃S

or SO₃^‐

3Galβ1 ‐ 4GlcNAcβ1 ‐ 3Galβ1 ‐4GlcNAc1β6 ‐

‐O₃S

考察 （学位審査、リサカン用）

糖鎖構造を同定するための従来の方法

（１）既知の糖鎖もしくは糖脂質をプレートに並べ、それらを抗体と反応させること により網羅的に調べる方法。

・既知の糖鎖構造しか同定できない。

・糖タンパク質を合成するのは困難なため、プレートにならべられた糖鎖、

もしくは、糖脂質に抗体が反応しなければ同定できない。

（２）糖鎖を試料より抽出して、質量分析法を用いてその構造を同定していく方法。

・高純度の糖鎖としての試料抽出が難しい。

本方法の有益性

・糖及び硫酸転移酵素遺伝子導入により、抗原糖鎖は細胞自体で生合成されるので 糖蛋白質にも適用できる。

・何より大掛かりな分析機器を必要とせず、どの研究室でも適用できる。

我々は本研究で示した遺伝子技術を利用した方法は 将来広く適用できるであろうと 我々は本研究で示した遺伝子技術を利用した方法は、将来広く適用できるであろうと 考えている。