日本大学大学院医学研究科博士課程

前立腺癌における新規アンドロゲン応答遺伝子

G3BP2 の同定及び機能解析

日本大学大学院医学研究科博士課程 外科系泌尿器科学専攻

芦苅 大作 2014 年

指導教員 髙橋 悟

前立腺癌における新規アンドロゲン応答遺伝子

G3BP2 の同定及び機能解析

日本大学大学院医学研究科博士課程 外科系泌尿器科学専攻

芦苅 大作 2014 年

指導教員 髙橋 悟

【目次】

【概要・緒言】

... 1

Ⅰ 前立腺癌と疫学

... 1

Ⅱ 治療

... 2

Ⅲ 前立腺癌におけるアンドロゲンの分子作用機序

... 9

Ⅳ ゲノム医学的手法を用いた

AR

下流シグナルの探索

... 10

【目的】

... 13

【対象と方法】

... 14

Ⅰ 細胞及び細胞培養液（培地）

... 14

Ⅱ

Luciferase assay ... 14

Ⅲ

Quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) ... 15

Ⅳ

Western Blot analysis ... 16

Ⅴ

Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA) ... 17

Ⅵ

Immunofluorescence (

蛍光免疫染色

) ... 18

Ⅶ

G3BP2

安定過剰発現細胞株

(Stable

細胞

)

の作製

... 18

Ⅷ

small interfering RNA (siRNA) ... 19

Ⅸ

Cell proliferation assay ... 19

Ⅹ

Cell migration assay ... 20

Ⅺ

Immunohistochemistry (

免疫組織染色

) ... 20

【結果】

... 22

Ⅰ アンドロゲン応答遺伝子

G3BP2

の同定

... 22

Ⅱ

G3BP2 ARE

の同定及びアンドロゲン応答性検討

... 22

Ⅲ

G3BP2

のアンドロゲン応答性の検討

... 24

Ⅳ

G3BP2

安定過剰発現細胞株を用いた前立腺癌細胞における機能解析

... 25

Ⅴ

G3BP2

発現抑制による前立腺癌細胞への影響の検討

... 25

Ⅵ 前立腺癌臨床検体における

G3BP2

発現解析

... 26

【考察】

... 28

Ⅰ

ChIP-chip

法及び

ChIP-sequence

法による新規アンドロゲン応答遺伝子の同定

28

Ⅱ

G3BP2

の分子機能

... 29

Ⅲ

G3BP2

の臨床病理に関する考察

... 31

Ⅳ 今後の展望

(

前立腺癌治療標的としての

G3BP2

の応用

) ... 32

【まとめ】

... 34

【謝辞】

... 35

【表・図・図説】

... 36

【引用文献】

... 57

【研究業績】

... 63

1

【概要・諸言】

Ⅰ 前立腺癌と疫学

前立腺癌（

Prostate Cancer: PCa

）とは、前立腺（外腺）に発生する病気、

癌の一つである。様々な組織型の悪性腫瘍が生じうるが、その殆どは腺癌

である。

前立腺癌は他の癌に比べ高齢者に多く、年齢階級別罹患数は高齢者ほど多くな

っている。

2005

～

2009

年の

5

年間の日本人男性の年齢調整罹患率（昭和

60

年 の年齢構成を基準人口として調整：

/10

万人

/

年）の推計値の平均は

41.3

であり、

胃癌、大腸（結腸・直腸）癌、肺癌に次いで

4

番目に高く、全男性悪性新生物 全部位の

11.3

％を占めている¹。しかし、近年では急増傾向にあり、将来の前立 腺癌罹患数の増加に関しては、

2025

～

2029

年の

5

年間の年間平均罹患数は

118,200

人と男性癌の第

1

番目となり、胃癌の

103,000

人、肺癌の

86,700

人を

超えると予測されている¹ 。

また日本での

2005

～

2009

年の男性年齢調整癌死亡率は

8.2

であり、肺癌、胃 癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、食道癌に次いで

7

番目に高く、同時期の前立腺 癌死亡数は、男性における悪性新生物死亡原因の

4.8

％を占めている² 。

年間前立腺癌死亡数は，上昇傾向にあり、

2000

年には

4,072

人（

2000

～

2004

年の

5

年間の平均）であるが、将来予測では、

2025

～

2029

年の

5

年間の年平均

2

死亡数は

15,700

人になると推定されており、

2000

～

2004

年の

1.9

倍にあたり、

男性癌のなかで第

5

番目の死亡数になると予測されている² 。

2008

年の世界の前立腺癌罹患数は

899,000

人で、死亡数は

258,000

人と予測さ

れている。また、

2030

年には年間の新規発生前立腺癌数は約

170

万人となり、

約

50

万人もの人が前立腺癌で死亡するとの予測もある³ 。

前立腺癌は、欧米の先進国に発生率の高い癌で、

2000

～

2006

年の世界の国別前 立腺癌罹患率では、年齢調整罹患率（世界人口で調整：

/10

万人

/

年）で米国

118.2

が最も高く欧州諸国も軒並み高い。一方、アジア諸国の罹患率は低く、日本は

15.1

と低い⁴ 。

しかし、近年の食生活の欧米化や高齢化社会の到来などにより患者数の急

速な増加傾向などを受け、患者自身の認識も高まり、今や医療上の大きな

問題となっている。

Ⅱ 治療

前立腺癌は診断時の病期を基にして治療法を選択する。前立腺癌は治療の

選択肢が非常に多く、また選択する際は生存期間や性機能温存の問題など

患者本人の考えも重要視される。

3

１

.

手術療法（根治的前立腺全摘除術）

前立腺癌が前立腺内に留まっている場合（限局性前立腺癌）では手術によ

り癌細胞が完全切除できるため、最も根治性の高い治療法として位置づけ

られている。しかし、前立腺癌の治療法には様々な選択肢があり実際に前

立腺全摘除術の適応と考えられるのは次のように考えられている ⁵ 。

⑴

10

年以上の期待余命がある

⑵ 完全切除が可能な病態であること

⑶ 全身状態や合併症などに問題がない

期待余命が

10

年以上という点では日本では

75

歳くらいまでがその適応と 考えられている。またそのためにも全身状態や合併症に問題がないとされ

ている。

手術で切除するのは前立腺、精嚢、精管の一部、膀胱頸部の一部などであ

る。また手術時に同時に所属リンパ節（閉鎖リンパ節等）郭清も行われる。

手術法としては開腹手術、体腔鏡手術（腹腔鏡手術）、内視鏡下ミニマム

創手術、ロボット支援下手術などがあり、手術経路として経恥骨後式、経

会陰式等がある。さらに勃起に関わる神経を温存する神経血管束温存手術

と温存しない手術に分かれる。

4

２

.

放射線療法（外部照射、密封小線源療法）

前立腺癌の根治療法には手術療法以外に放射線療法などがあるが治療成績

に大きな差がないことや体への負担が軽いという期待から近年では放射線

治療の役割が注目されている ⁶ 。また、進行癌で骨転移などを有する症例

に対して局所疼痛コントロール目的に行う対症的放射線治療も重要な役割

を担っている。

放射線治療技術は画像診断技術の発展とともに飛躍的に進歩してきた。

外照射では近年、三次元原体照射（

three-dimensional conformal radiation

therapy : 3D-CRT

）やコンピュータを用いて自動的に放射線照射装置を制

御 す る 強 度 変 調 放 射 線 治 療 （

intensity modulated radiation therapy : IMRT

）を用いて

70Gy

以上の局所への十分な高線量投与と直腸への線量抑

制を両立することが可能になってきている。

他の選択肢として密封小線源療法（

brachytherapy

）がある。最も良い適応 は

Gleason Score

や

prostate specific antigen (PSA)

値 を 合 わ せ た

D’Amico

のリスク分類で低～中リスク分類の症例である。密封小線源療法

は麻酔下に砕石位にて

transrectal ultrasonography (TRUS)

を用いて前立 腺を画像モニターで把握しながら会陰部よりヨウ素

125

シード線源を刺入 する方法である ⁷ 。

5

３

.

ホルモン療法

1940

年代に

Huggins

らがホルモン療法の有用性を提唱しノーベル賞を受賞

して以来今日まで、進行性前立腺癌治療の第一選択である ⁸ 。

一般的に前立腺癌はほぼ全ての癌細胞内においてアンドロゲン受容体（

AR

） の発現が認められおり、アンドロゲン依存性を示し、アンドロゲン刺激に

より癌細胞が増殖することが知られている ^9-10 。そして、アンドロゲン作

用を抑制するホルモン療法を施行すると、アポトーシスが誘導され癌細胞

が死滅し腫瘍は縮小していく。

ホルモン療法の方法としては、血中アンドロゲンの除去・抑制、前立腺に

おけるアンドロゲン作用の拮抗、前立腺癌細胞への直接作用などがある。

血中テストステロンを去勢域に低下させる方法として、両側精巣摘除術に

よ る 外 科 的 去 勢 術 や 黄 体 化 ホ ル モ ン 刺 激 ホ ル モ ン （

luteinizing hormone-releasing hormone

：

LHRH

）アゴニストや

LHRH

アンタゴニス

トによる内科的去勢が施行される。

LHRH

アゴニストは一過性に黄体化ホ ルモン（

luteinizing hormone

：

LH

）及びテストステロンを上昇させる（フ レアアップ現象）が認められ、その後

LHRH

受容体のダウンレギュレーシ ョンを引き起こして

LH

及びテストステロンが著明に抑制される。このフレ アアップの予防及び去勢だけでは治療効果が不十分なことよりアンチアン

6

ドロゲン剤を併用する

MAB

（

maximum androgen blockade

）療法が主流 となっている。

初回内分泌療法に不応となった場合はアンチアンドロゲン剤の中止（アン

チアンドロゲン除去症候群）、別のアンチアンドロゲン製剤への変更（ア

ンチアンドロゲン交代療法）を行う。さらに不応となった場合などはグル

ココルチコイド療法やエストロゲン療法などが有効な場合がある。

近年、数種類の新しいホルモン療法治療薬が開発中である。

LHRH

を直接 抑制する

LHRH

アンタゴニストであるデガレリクスは、投与後のフレアア ップを起こさない。またステロイド代謝酵素（

CYP17

）阻害薬であるアビ ラテロンや

TAK-700

は、コレステロールからのアンドロゲン合成を阻害す ることで治療効果を示す。また、第

2

世代のアンチアンドロゲン剤である

MDV3100

は、強力なアンドロゲン受容体阻害作用を有し、治療効果が期待

されている。

４

.PSA

監視療法

前立腺癌と診断されてもすぐに治療せずに経過を観察するという選択肢も

ある。これは転移巣がなく

Gleason Score

が低い早期癌を臨床上意義のな い癌と判断して

PSA

測定で経過をみる

PSA

監視療法（

active surveillance

）

7

という方法である。

５

.

抗癌化学療法

前立腺癌はアンドロゲン感受性に増殖することから、手術療法や放射線療

法などの根治療法が適応にならない転移症例であっても、ホルモン療法に

より病状は改善し

PSA

は低下する。しかしその作用は長く続かず多くは数 年 以 内 に 治 療 抵 抗 性 と な り 、 去 勢 抵 抗 性 前 立 腺 癌 （

castration resistant prostate cancer

：

CRPC

）となる。

現在、日本国内で

CRPC

に対する確立した治療法はほとんどないが、タキ サン系抗癌剤であるドセタキセル（

docetaxel

：

DTX

）療法は

CRPC

に対す る治療法のひとつである。ドセタキセルは

tubulin

に結合し微小管の脱重合 を阻害することにより細胞分裂を阻害する抗癌剤である。

2004

年にドセタ キセルとプレドニゾロンあるいはリン酸エストラムスチンとの併用療法が

有意に生存期間を延長したと報告された^11-12 。

６

.

アンドロゲン受容体（

AR

）を標的とした新規治療薬

AR

の解析が進むのとともに癌組織中のステロイドについての研究が進ん

だ。

CRPC

の骨転移巣では組織中のテストステロン濃度が上昇しており、

8

アンドロゲン合成に必要な酵素活性の亢進が原因であることが明らかとさ

れた¹³ 。

また、

CRPC

では

backdoor pathway

と言われるステロイド合成経路を獲得 することにより癌組織中のアンドロゲン濃度が上昇することも提唱された

14 。

これらより

CRPC

に至る過程において

AR

の活性化が重要でありこれらを 標的とした治療が注目されている。

①

CYP17

阻害薬

コレステロールからアンドロゲンが合成される経路において、

CYP17

は重 要な酵素である。これを阻害することにより癌組織中のアンドロゲン濃度

が低下し

AR

の活性化を阻害することが可能となる。

Abiraterone

（アビラテロン）は

CYP17

を阻害する経口薬であるが、ドセ

タキセル抵抗性

CRPC

に対してアビラテロン及びステロイド投与療法とス テロイド単独投与療法の大規模第Ⅲ相試験が行われ全生存期間が有意に延

長されたことから

CRPC

に対する内分泌療法として注目されている。日本 で も 臨 床 試 験 が 実 施 さ れ て い る 。 他 に

TAK700

も ア ビ ラ テ ロ ン 同 様 に

CYP17

阻害薬だが、阻害する酵素活性の選択性に相違がありアビラテロン

に比べコルチゾール合成がある程度維持されるといわれている。

9

②

MDV3100

（

enzalutamide

）

非ステロイド性アンチアンドロゲン薬として広く日本でも使用されている

ビカルタミドやフルタミドは

AR

に点突然変異などがある場合に作動性に 働くことがあることが知られている。そこで第二世代アンチアンドロゲン

剤として注目されている

MDV3100

は

AR

への親和性が高く、作動性もな く、

AR

の核内への移行も阻害することが示されている ¹⁵ 。大規模第Ⅲ相 試験の中間発表では

AFFIRM

試験（ドセタキセル後）において生存期間の 予測中央値が有意に延長したとの報告があり期待されている ^16-17 。

Ⅲ 前立腺癌におけるアンドロゲンの分子作用機序

前立腺癌はアンドロゲンによりその増殖の制御を受けている。アンドロゲ

ンのうち、血液中で最も高濃度に存在し重要な役割を果たしているのがテ

ストステロンであり、その約

90

％は精巣由来である。視床下部から

LHRH

が分泌され、下垂体での

LH

の合成分泌を刺激する。そして、

LH

は精巣に 働いてテストステロンの合成分泌を促進する。テストステロンは標的臓器

である前立腺細胞内に取り込まれると、

5α

還元酵素の働きによってジヒド ロテストステロン（

dihydrotestosterone

：

DHT

）に代謝される。

DHT

はテ ストステロンよりも活性が強く標的細胞内の

AR

と結合して複合体を形成

10

する。このように

DHT

がリガンドとして核内受容体である

AR

と複合体を 形 成 し 、 核 内 に 移 行 す る と ア ン ド ロ ゲ ン 応 答 配 列 （

androgen response element : ARE

）に結合して、他の転写活性化因子（

coactivator

）とともに

標的遺伝子のプロモーター周辺のヒストン修飾を変化させることにより転

写活性を促進、

mRNA

及び蛋白の発現を介してアンドロゲン作用を現す。

アンドロゲン応答遺伝子の中には過剰発現することにより、

anti-apoptosis

、 細胞増殖に働き前立腺癌の発生、悪性化を促すものがある^18-21

(

図２

)

。その ため

AR

を阻害する抗アンドロゲン療法は前立腺癌に対する確立された治 療法の一つであるが、しばしば治療中に癌が再燃しアンドロゲン非依存的

に増殖する治療抵抗性の獲得が臨床上の大きな課題となっている ^22-23 。そ

の機序については不明な点が多いが、前立腺癌細胞内の

AR

発現強度に関係 なく、

AR

自身の活性型変異や増幅、癌組織中でのステロイド合成経路の獲 得など、アンドロゲンシグナルが活性化されている状態となっているとの

報告がある ^24-25 。そのためアンドロゲン応答遺伝子がホルモン療法不応性

癌の増殖に働いている可能性が示唆されている。

Ⅳ ゲノム医学的手法を用いた

AR

下流シグナルの探索

前立腺癌の発症及び進展に重要な役割を果たしているアンドロゲンの標的

11

遺伝子に着目した研究が盛んに行われいくつかの報告がある。東京大学大

学院医学系研究科抗加齢医学講座では、より直接的な

AR

の標的遺伝子を同 定するために、

AR

陽性前立腺癌細胞株にアンドロゲンを付加しゲノム

DNA

上 に 結 合 し た

AR

を 特 異 抗 体 に よ り 同 定 す る ク ロ マ チ ン 免 疫 沈 降 法

（

Chromatin immunoprecipitation : ChIP assay

）に、標識した

ChIP DNA

をゲノムタイリングアレイにハイブリダイゼーションさせ、有意なシグナ

ルを得られる領域を検出する

ChIP-chip

法や、次世代シークエンサーによ るシークエンスを組み合わせた

ChIP-sequence

法などを施行してきた。こ れ ら に よ り ゲ ノ ム ワ イ ド に

AR

結 合 領 域 を 含 む

Androgen Receptor Binding Sites

（

ARBSs

）を約

500bp

単位で同定できるようになった。我々

は

ChIP-chip

法により

2872

箇所（

p-value < 10

^-5）、

ChIP-sequence

法に より

10392

箇所（

> 10

倍）の

ARBS

を同定した ^26-27 （図

3

）。

これらの方法により転写因子の結合部位をゲノムワイドに同定可能となっ

た。また、これらを用いてより直接的な

AR

のターゲット遺伝子である新規 アンドロゲン応答遺伝子を同定し、機能解析することで前立腺癌細胞内に

おけるアンドロゲンの分子作用機序が徐々に明らかとなってきている ^28-31 。

このように

ChIP-chip

法及び

ChIP-sequence

法により同定された

AR

結合 部位の中から、より直接的な

AR

応答遺伝子を同定し発現制御解析をするた

12

めに、全ゲノムの遺伝子転写開始点より

3kb

以内に

AR

結合部位（

ARBS

） を有する遺伝子を抽出してきた。得られた

ARBS

のうち転写開始点

3kb

以 内のものは約

4.5

％で、これらについて

Cap Analysis of Gene Expression

（

CAGE

）

, RNA-sequence

法

,

マイクロアレイ法などによりアンドロゲン 応答性発現誘導解析を行い、さらに臨床サンプルによるマイクロアレイ発

現解析（

Oncomine

）で正常前立腺組織に比べ前立腺癌での発現が有意に上

昇しているものに絞り込みを行った（図

4

）。

以上の方法により全

9

遺伝子が抽出されたが、アンドロゲン応答遺伝子と して既報の遺伝子以外のものについて、さらなる機能解析を行い

G3BP2

に 絞り混んだ。

13

【目的】

前述の方法により同定された新規の

AR

標的遺伝子群の中で我々は

G3BP2

（

Ras GTPase activating protein (SH3 domain) binding protein2

）に着目 した。本研究では新たな前立腺癌の治療標的や診断マーカーの発見へとつ

ながることを目指し、

G3BP2

のアンドロゲン応答性の検討及び前立腺癌細 胞内での機能解析を行い検討した。

14

【対象と方法】

Ⅰ 細胞及び細胞培養液（培地）

前立腺癌細胞は、

AR

陽性ヒト前立腺癌細胞株

LNCaP

細胞（

the American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA

）及び別の

AR

陽性前立腺癌

細胞株

VCaP

細胞（

the American Type Culture Collection, Rockville, MD

） を使用した。

LNCaP

細胞の細胞培養には

RPMI1640

に

10

％ウシ胎児血清

（

fetal bovine serum; FBS, JRH Bioscience)

を混合した培地にて行い、

VCaP

細胞の細胞培養には

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

（

DMEM

）

に

15

％

FBS

を混合した培地にて

37

℃、

5

％

CO

2条件下で培養を行った。

また、アンドロゲン（

DHT

）刺激前には約

72

時間フェノールレッドフリー 培養液にチャコール処理された

5

％

FBS

を混合した培地にて培養を行い、

ホルモン除去を行った。

Ⅱ

Luciferase assay

pGL3-basic Luciferase vector

（

Promega, Madison, WI, USA

）を用いて、

アンドロゲン応答遺伝子候補

G3BP2

の

TSS

近傍の

ARBS

を含む

Promoter/

Enhancer

領域（

Chromosome 4: 76816078-76818629

（

hg18

）

,

全

2551bp

）

15

を

insert

として

G3BP2 promoter-Luc construct

を作成した。

また、その

ARBS

中に含まれる

ARE

領域（

Transfac

により同定）の中央

3 bp

よりそれぞれ上流及び下流に

2 bp

の位置の塩基に変異を入れた（それぞ

れ

C→A

及び

G→C

）

G3BP2 mutation-Luc construct

を作成した。それぞ れの

construct

は

LNCaP

細胞に

XP DNA Transfection Reagent

（

Roche Applied Science, Mannheim, Germany

）を使用して

transfection

し

48

時

間培養後、リガンド刺激を行い検討した。

Tk-PRL

プラスミド

10 ng

を一緒 に遺伝子導入し、遺伝子導入の効率で標準化するための内部コントロール

として使用した。

Ⅲ

Quantitative reverse transcription-PCR

（

qRT-PCR

）

細胞より

RNA

を

ISOGEN

（

Nippon Gene, Tokyo, Japan

）を用いて溶解、

抽出した。一本鎖

cDNA

は

Primescript RT reagent kit

（

TAKARA, Kyoto, Japan

）を用いて

mRNA

より逆転写合成した。

qRT-PCR

は

ABI step one

（

Life technologies, Carlsbad, CA, USA

）を用いて行い遺伝子発現量を定 量化した。

用いた

Primer sequences

は以下の通りである。

GAPDH

forward: 5’-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA- 3’

16

reverse: 5’-GTGGTCGTTGAGGGCAATG- 3’

G3BP2

forward: 5’-TGTGGAACTTCGCATCAATACC- 3’

reverse: 5’-AAACGTACTTCCCCTCGAAACA- 3’

PSA

forward: 5’-CAGGAACAAAAGCGTGATCTTG- 3’

reverse: 5’-GCTGTGGCTGACCTGAAATACC- 3’

TMPRSS2

forward: 5’-TCAACCCCTCTAACTGGTGTGA- 3’

reverse: 5’-AGGCGAACACACCGATTCTC- 3’

また、抗アンドロゲン剤として

Bicalutamide

（

Sigma, St Louis, MO, USA

） を使用した。

Ⅳ

Western blot analysis

Whole cell lysate

を

Lysis buffer

（

NP40 buffer : 50mM Tris-HCl ph8.0, 150mM NaCl, 1.0% NP40

） に て 溶 解 し て 回 収 、 蛋 白 濃 度 測 定 は

BCA protein assay kit

（

Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA

）を用いた。

約

30 µg

の蛋白を

8

％

SDS-polyacrylamide gel

で電気泳動し

Immobilon-P Transfer Membrane

（

Millipore, Billerica, MA, USA

）に転写させた。メン

ブレンはそれぞれ後述の

1

次抗体及び

2

次抗体と反応させ

the Western

Blotting Chemiluminescence Luminol Reagent

（

Santa Cruz

17

Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA

）を用いて発色させた。

抗体はそれぞれ

Anti-G3BP2 antibody (Abcam, Cambridge, MA, USA)

、

Anti-Flag antibody (Sigma, St Louis, MO, USA)

、

Anti-β-actin monoclonal antibody (Sigma, St Louis, MO, USA)

を用いた。

Ⅴ

Electrophoresis Mobility Shift Assay

（

EMSA

）

LNCaP

細胞を

15cm dish

で培養後、

Vehicle

処理と

DHT100 nM

処理を

48

時 間 行 っ た 後 に 回 収 、 核 内 タ ン パ ク 質 の 分 離 を 施 行 し た 。 核 抽 出 は

Hypotonic Buffer

（

20mM HEPES pH7.9, 10mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.65% NP-40, 1mM DTT

） に て 施 行 し 核 内 タ ン パ ク 質 の 分 離 は

RIPA Buffer

（

25 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1.0% NP- 40, 1.0%

sodium deoxycholate

、

0.1% SDS

）を用いて抽出した。

ARE

及び

ARE mutation

のそれぞれのオリゴ核酸の配列は以下の通りであ

る。

ARE

：

CTCTGCGGAGCACGCGCAGTACGCTGC

ARE mutation

：

CTCTGCGGAGCAAGCGCACTACGCTGC

また核内タンパク質とオリゴ核酸は室温で

15

分間

incubation

を行い、

Gel

shift assay

には

DIG Gel Shift Kit, 2

^nd

Generation

（

Roche Applied Science,

18

Mannheim, Germany

）を用いて検討した。

抗

AR

抗体との

incubation

時間及び濃度は図に記載の通りである。

ま た 、 抗 体 は

Anti-AR rabbit monoclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)

を用いて

assay

を施行した。

Ⅵ

Immunofluorescence

（蛍光免疫染色）

ホルモン除去した

LNCaP

細胞に

Vehicle

及び

DHT100 nM

処理

48

時間後 にそれぞれ

4

％パラフォルムアルデヒド、

0.1

％

Triton X-100

、

2

％

BSA

処理 を順次行い、

G3BP2

抗体（

1

：

200

希釈）処理

24

時間後に

Alexa-488

ヤギ

anti-Rabbit IgG

（

1

：

1000

希釈）処理

1

時間施行した。核の染色には

DAPI

（

Nacarai tesque, Kyoto, Japan

） を 使 用 し た 。 撮 影 は

confocal laser scanning microscope

（

model FLUOVIEW FV10i; Olympus, Tokyo, Japan

）

にて行った。

Ⅶ

G3BP2

安定過剰発現細胞株（

Stable

細胞）の作製

pcDNA3.1-FLAG

に前述の

Luciferase construct

と同様にして

G3BP2

を

insert

し

LNCaP

細胞に

transfection

した。

G418 500 µg/ml

処理し

N

末端

に

Flag

付きの

G3BP2

安定過剰発現細胞株（

Flag-G3BP2 #1, #2

）を作製

19

した。

Ⅷ

Small interfering RNA

（

siRNA

）

以 下 の

Stealth RNAi

及 び コ ン ト ロ ー ル

RNAi

（

Life technologies, Carlsbad, CA, USA

）を購入し使用した。

siG3BP2 #1

（

Cat.No. G3BP2 HSS114989

）

siG3BP2 #2

（

Cat.No. G3BP2 HSS114990

）

上記の

siRNA

は全て

10 nM

にて使用した。

Transfection

は

Lipofectamine RNAiMAX Reagent

（

Life technologies, Carlsbad, CA, USA

）を用いた。

Ⅸ

Cell proliferation assay

細 胞 増 殖 率 を

MTS proliferation assay

（

Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell proliferation assay, Promega, Madison, WI, USA

）を用いて

定量的に検討した。

Stable

細胞（

G3BP2 #1, #2

）及び

pcDNA3.1-FLAG

空

Vector transfection

細胞（

Vector #1, #2

）をそれぞれ

96 well dish

の各

well

に

3000

個の細胞を

4 well

ずつ入れ

0, 24, 48, 72

時間培養後に増殖率を測 定した。

20

また、

siRNA

を用いた

assay

では各

well

に

3×10

³個の細胞を入れ

24

時間 後（

day 1

）に

siRNA

を

transfection

し

day 6

まで測定した。

Ⅹ

Cell migration assay

細 胞 の 遊 走 能 を 検 討 す る た め フ ィ ブ ロ ネ ク チ ン 処 理 し た

Cell Culture Insert with an 8.0-µm pore size PET filter

（

Becton Dickinson

）を用いた。

Stable

細胞及び

siRNA

を用いた実験系において、

5×10

⁴個の細胞を各

well

に入れ

24

時間培養しメタノール固定後ギムザ染色し

pore

を通過した細胞 数を蛍光顕微鏡

(Nikon eclipse TE 2000-U; Nikon, Tokyo, Japan)×400

視 野にてランダム

5

視野で撮影検討した。

Ⅺ

Immunohistochemistry

（免疫組織染色）

日本大学医学部附属板橋病院にて前立腺癌の診断のもと前立腺全摘除術を

施行した

101

例について、

anti-G3BP2 antibody

（

1

：

100

希釈）を用いた 免疫組織染色を

peroxidase catalyzed signal amplification

（

CSA

）

system

（

DAKO, Carpinteria, CA, USA

）を用いて施行した。評価法は光学顕微鏡

（

×200

）で全細胞数のなかで陽性細胞数が何％存在するか（

score 0,

陽性 細胞なし

; score 1, < 1/100; score 2, 1/100 to 1/10; score 3, 1/10 to 1/3;

21

score 4, 1/3 to 2/3; score5, > 2/3

）、及び染色強度（

score 0,

染色されず

; score 1,

弱

; score 2,

中

; score 3,

強）を足し合わせて

IR score; 0-8

までで

評価した。既報論文を参考にして

IR score

≧

7

を強発現、

IR score

≦

6

を弱発現とした ^21,30 。

ま た 、 全 て の 統 計 処 理 の 結 果 は 平 均 値

±

標 準 偏 差

(SD)

に て 表 し た 。

Student’s unpaired two-tailed t test

は

2

パラメータ間の比較で用い、

one-way ANOVA

は

2

群間比較の際用い、

p < 0.05

の場合統計的有意差有

りとした。また、臨床サンプルでの統計学的有意差は

χ

²検定または相関解 析で検討し、統計ソフトは

Graphpad Prism ver 5.0 software

（

GraphPad Software Inc, CA, USA

）及び

JMP. Pro 9 software

（

SAS Institute, Cary, NC

）を使用した。なお、本研究は日本大学医学部附属板橋病院倫理委員会

の承認を得て施行した。

22

【結果】

Ⅰ アンドロゲン応答遺伝子

G3BP2

の同定

前述のごとく

AR

陽性ヒト前立腺癌細胞株

LNCaP

細胞を用いてゲノムワイ ドにアンドロゲン応答遺伝子を検索した。

ChIP-sequence

法により

G3BP2

の

TSS

近傍（

3kb

以内）にリガンド刺激によって多くの

AR

の結合が認め られる領域を同定した（図

5

上）。また、

AR ChIP assay

によりリガンド 付加での有意な結合の増加を確認できた（図

5

下）。

G3BP2

は

Chromosome 4: 76786990-76817629 (hg18), reverse strand

に位置しており、核蛋白や

RNA

輸送の足場蛋白としての機能や様々なシグナリングとの関与が報告さ

れている ^32-35 。また、癌との関連性として、乳癌細胞において過剰発現し

ていることや、大腸癌細胞での細胞増殖への関与、

p53

及び

MDM2

と結合 し

ubiquitin

化や

degradation

を阻害している等の報告がある ^37-39 。

Ⅱ

G3BP2 ARE

の同定及びアンドロゲン応答性の検討

まず

G3BP2

のアンドロゲンや

AR

による発現制御メカニズムを解析した。

G3BP2 TSS

近傍の

ARBS

内及び周囲のモチーフ検索を公共データベース

（

BIOBASE Biological Databases

内にある

Transfac

）を用いて検索した

23

ところ、

ARBS

内に

1

つの

Androgen responsive element

（

ARE

）を認め、

また周囲にはいくつかの

AR

関連転写因子群（

Oct1, FOXA1/ HNF3

）など の結合配列が認められた（図

6

）。

次に、実際にこの

ARE

を介した結合が起きているのか、またこの

AR

の結 合がアンドロゲン応答性に重要かどうかを解析した。

まず初めに前述のごとく

Luciferase vector

に

G3BP2 ARBS

及び

Promoter/

Enhancer

領域を

insert

として

G3BP2 promoter-Luc construct

を作成し、

さらに

Motif

解析により同定された

ARE

候補領域に

mutation

を入れた

G3BP2 mutation-Luc construct

を作成した（図

7

）。

まず

G3BP2 promoter-Luc construct

を

LNCaP

細胞に

transfection

し

Luciferase assay

にて

Vehicle

処理及びリガンド処理（

DHT 100 nM

）での

転写活性化を評価したところ、

Vehicle

処理に比べリガンド処理のもので有 意 な リ ガ ン ド 依 存 的 な 転 写 活 性 化 を 認 め た （ 図

8

） 。 次 に 、

G3BP2 mutation-Luc construct

を 用 い て 同 様 に し て 転 写 活 性 化 を 検 討 し た 。

G3BP2 promoter-Luc

ではリガンド依存的な転写活性化が再現性をもって

認められ、そのリガンド依存的な転写活性化は

ARE

候補領域に

mutation

を入れることにより消失した（図

9

）。

また、

Electrophoresis Mobility Shift Assay

（

EMSA

）にてこの

ARE

候補

24

配列と蛋白の結合を解析したところ、リガンド刺激でより多くの蛋白質と

の結合が認められ、

mutation

を入れた配列ではこの結合の消失を確認した

（図

10

左）。さらに、抗

AR

抗体と

incubation

させることにより

AR/ARE

の結合が抗

AR

抗体濃度及び

incubation

時間に相関して減弱することを確 認し

AR

が直接

DNA

配列と結合していることが示唆された（図

10

右）。

以上より

G3BP2 TSS

近傍の

ARE

候補領域に

AR

が結合し転写活性化に重

要な役割を担っていることが確認できた。

Ⅲ

G3BP2

のアンドロゲン応答性の検討

qRT-PCR

を用いて

mRNA

レベルでのアンドロゲン応答性を検討した。

Vehicle

処理に比べリガンド処理（

DHT 100 nM

）ではリガンド及び時間依

存 的 に 有 意 な 増 加 を 認 め （ 図

11

左 ） 、 そ の 増 加 は 抗 ア ン ド ロ ゲ ン 剤

（

Bicalutamide

）を用いることにより消失した（図

11

右）。

次に、同様にしてリガンド処理をした

LNCaP

細胞よりタンパク質を抽出し

Western Blot

法により検討した。するとタンパク質レベルでもリガンド及

び時間依存的な増加を認めた（図

12

上）。さらに蛍光免疫染色によりリガ ンド依存的なタンパク質の増加は、細胞内において細胞質有意な局在で高

発現していることが認められた（図

12

下）。

25

また、別の

AR

陽性前立腺癌細胞株

VCaP

細胞を用いて同様にした検討を 行ったところ、

LNCaP

細胞と同様にリガンド依存的な転写活性化を認め、

mRNA

レベル及びタンパク質レベルでも有意な増加を確認できた（図

13

）。

以上より

G3BP2

は

mRNA

レベル、タンパク質レベルでアンドロゲンによ

り制御される標的遺伝子であることが示された。

Ⅳ

G3BP2

安定過剰発現細胞株での検討

さ ら に

G3BP2

の 前 立 腺 癌 に お け る 機 能 を 解 析 す る た め 前 述 の 通 り に 、

Vector

のみを

transfection

し細胞培養して得られた細胞株（

Vector #1, #2

）

と、

N

末端に

Flag

付きの

G3BP2

安定過剰発現細胞株（

Flag-G3BP2 #1, #2

） を作製した（図

14

）。

これらの細胞株を用いて

Cell proliferation assay

にて

G3BP2

過剰発現の 増殖能へ与える影響について検討したところ、

G3BP2

安定過剰発現細胞株 である

Flag-G3BP2 #1, #2

は

Vector #1, #2

に比べ細胞増殖能が亢進してい た（

p < 0.05

）（図

15

）。また、同様に

Cell migration assay

にても有意 差をもって細胞遊走能の亢進を認めた（

p < 0.05

）（図

16

）。

Ⅴ

G3BP2

発現抑制による前立腺癌細胞への影響の検討

26

まず初めに前述の

Invitrogen Stealth RNAi #1, #2

の

2

種類を用いて

G3BP2

を充分に発現抑制できることを

Luciferase assay

及び

Western Blot

法により確認した（図

17

）。

次にこの

siRNA

を用いて

Proliferation assay

及び

Cell migration assay

に て検討したところ、

G3BP2

を

knock down

することにより細胞増殖能及び 遊走能がともに抑制されることが示された（図

18

、

19

）。

以上より前立腺癌細胞株において

G3BP2

は細胞増殖能及び遊走能の両方 を強く促進的に制御していると考えられた。

Ⅵ 前立腺癌臨床検体における

G3BP2

発現解析

実際の前立腺癌における

G3BP2

の機能を解析するため、臨床サンプルにお

ける

G3BP2

蛋白の発現を免疫組織染色により解析した。そのため日本大学

医学部附属板橋病院にて前立腺癌の診断で根治的前立腺全摘除術を施行し

た

101

例の臨床検体について抗

G3BP2

抗体を用いて免疫組織染色を行い、

染色強度を測定し検討した。染色強度の詳細は前述の方法にて行った。す

ると

IR score

が

7

以上を強発現、

6

以下を弱発現で評価したところ、弱発

現

83

例、強発現

18

例であった。その臨床病理を解析したところ

pathological

T stage

（

p = 0.01

）、リンパ節転移陽性例（

p = 0.0011

）、

Gleason Score

27

（

p = 0.0003

）と有意に相関した。また、正常前立腺組織ではほとんど染色

を得られず、癌で高発現していることが見出された（表

,

図

20

）。

28

【考察】

Ⅰ

ChIP-chip

法及び

ChIP-sequence

法による新規アンドロゲン応答遺伝 子の同定

本研究では

ChIP-chip

法及び

ChIP-sequence

法を用いてゲノムワイドに

ARE

を解析した結果を引用している。東京大学大学院医学系研究科抗加齢

医学講座の高山らはこれまでに

ChIP-chip

法による

AR

結合部位の解析結 果を報告している ^26-26 。従来の

ARE

に関する多くの報告は各遺伝子の転 写開始点（

TSS

）近傍のプロモーター領域の配列を解析しレポーターアッセ イなどで同定するものであった³⁹ 。しかし、これらの方法では

TSS

近傍の

AR

結合部位のみの解析であり、ヒトゲノム全領域を解析したものではなか

った。今回

ChIP-chip

法及び

ChIP-sequence

法によりヒトゲノム全領域を 解析し

AR

結合部位を同定することに成功している。利点として、標的遺伝 子のプロモーター領域に偏ることなく

AR

結合部位を網羅的に同定するこ とが可能であることがあげられる。また、次世代シークエンサーを用いる

ことによって

AR

の結合が強い領域の配列をシークエンスし全ゲノム配列 上のどの位置に

AR

結合部位が存在しているか、またターゲット遺伝子のど の位置に

ARE

が存在するかなどの詳細な情報が得られるようになった。本

29

研究により

G3BP2 TSS

近傍（

Intron 1

）に

1

つの

AR

結合部位を同定し、

これは新規の

AR

結合部位であった。その部位に対する

ChIP assay

では

AR

の結合が濃縮して確認され精度の高い検出ができていることが見出さ

れた。同定した

AR

結合部位への

AR

の結合により直接的なアンドロゲンに よる転写制御を受け、アンドロゲン応答性に

mRNA

及びタンパク質レベル での発現増加が認められ新規アンドロゲン応答遺伝子の発見へと至った。

今後ますます

ChIP-chip

法及び

ChIP-sequence

法が核内受容体ならびに転 写因子の機能解析に応用されていくことが期待される。

Ⅱ

G3BP2

の分子機能

本研究により

G3BP2

がアンドロゲンによる制御を受けていることを見出 した。

G3BP family

は

G3BP1, G3BP2a, G3BP2b

の

3

つのアイソフォーム が知られているがそれぞれ

Proline rich (PxxP) motif

の

splicing

の程度に より大きく分類されている。

G3BP2

は

Ras GTPase activating protein (SH3 domain) binding protein2

であり

Ras GAP

に

SH3 domain

を介して

結合することが知られている。また、

G3BP2

の

C

末端には

RNA Recognition Motif

や

RGG (arginine-glycine rich) box

など

RNA

との結合がよく知られ

ている

domain

や

p53

との結合が報告されている

domain

なども認められ

30

る ^41-43 。このように

G3BP2

は様々な

domain

を有しており癌との関連に

関してもいくつかの報告があり近年、癌関連遺伝子としても注目されてい

る^{37, 44-45} 。

G3BP2

は

C

末端の

domain

を介して癌抑制遺伝子

p53

や

MDM2

と直接結合し、

p53

の

degradation

及び

ubiquitin

化を阻害し、さらに

MDM2

自身の

ubiquitin

化も阻害していることが知られている。また、

G3BP2

に

より

p53

の細胞内局在は核内から細胞質へ変化し、その機能は抑制されて いる。さらに

G3BP2

の発現を抑制することにより

MDM2

は減少し、

p53

はタンパク質レベルで増加を認め活性も上昇する ³⁹ 。このように多くの報

告では

G3BP2

は癌細胞で過剰発現しており、

p53

と結合し抑制することで

癌細胞の増殖能を亢進させているものと考えられる。また、前立腺癌細胞

におけるドセタキセル感受性は機能的な

p53

により決定されるとの報告も ある⁴⁶ 。さらに臨床検体における前立腺癌細胞の

p53

遺伝子変異はゲノム レベルで約

40%

との報告もあり前立腺癌の発生や悪性化などに深く関与し ているものと思われる ⁴⁷ 。

今回、

p53

と直接的に結合しその活性の制御に関わる

G3BP2

が前立腺癌細 胞においてアンドロゲン応答性に発現増加することを初めて報告した。ア

ンドロゲンが

G3BP2

を直接制御し前立腺癌の悪性化に関与している可能 性が示唆される。

31

Ⅲ

G3BP2

の臨床病理に関する考察

本研究の細胞レベルでの実験結果を元に実際の前立腺癌における機能を解

析するため、日本大学医学部附属板橋病院にて前立腺癌の診断で根治的前

立腺全摘除術を施行した

101

例の臨床サンプルを用いて

G3BP2

蛋白の発現 を免疫組織染色により解析した。すると

IR score 7

以上を強発現、

6

以下を 弱発現として評価したところ、弱発現

83

例、強発現

18

例であった。さら に臨床病理を解析したところ

pathological T stage

（

p = 0.01

）、リンパ節 転移陽性例（

p = 0.0011

）、

Gleason Score

（

p = 0.0003

）と有意に相関し ていた。これは

G3BP2

強発現の臨床サンプルにおいて

T stage

が悪い傾向 が認められ、リンパ節転移陽性例が多いことを示している。さらに前立腺

癌の悪性度を示す

Gleason score

と強く相関していることから、

G3BP2

が 予後因子となる可能性を示唆している。これらの結果は細胞レベルで示さ

れた

G3BP2

安定過剰発現細胞株の増殖能の亢進や遊走能の亢進が認めら

れたことと一致する。しかし図

18

、

19

で示された結果はリガンド応答性に

G3BP2

を介した増殖能・遊走能を直接証明するものではないため、今後の

研究課題と言える。

これらより

G3BP2

は何らかのシグナル伝達経路に関与することで前立腺 癌細胞の増殖能や遊走能を亢進していると考えられる。またアンドロゲン

32

による直接的な制御を受けていることなどから、前立腺癌に関わるアンド

ロゲン作用の下流シグナルであると考えられる。さらに今回の免疫組織染

色では、正常前立腺組織では

G3BP2

抗体でほとんど染色を得られず、癌で 高発現していることが見出されており、アンドロゲンにより誘導され前立

腺癌の発症や進展に働いていることが示唆された。

Ⅳ 今後の研究の展望

（前立腺癌治療標的としての

G3BP2

の応用）

これまでの細胞レベルでの機能解析と臨床病理から得られた解析結果から、

G3BP2

は

TSS

近傍（

Intron 1

）に

1

つの

ARE

をもつ新規アンドロゲン応

答遺伝子で、アンドロゲン作用により前立腺癌細胞の増殖能及び遊走能を

亢進させる機能を有する可能性が考えられる。また

G3BP2

を発現抑制する ことにより癌細胞増殖能及び遊走能はそれぞれ抑制され、悪性度の低い癌

や正常前立腺組織では発現が低いことなどからも癌細胞において重要な役

割を果たしていることが想定できる。以上より

G3BP2

を治療標的とするこ とで前立腺癌細胞の発症や進展を抑えることができる新しい治療法につな

がる可能性もある。さらに、

G3BP2

と臨床的予後との関連性やホルモン療 法不応性前立腺癌細胞内での

G3BP2

の役割などを機能解析していくこと

33

で新たな臨床マーカーの発見や

CRPC

樹立の機序解明などへつながってい くことも考えられる。

今回、

G3BP2

の前立腺癌細胞における役割の一部が初めて報告できた。し

かし、実際にどのようなシグナル伝達経路に寄与し、どのような機能を持

っているかは未だに解明されていない点も多く今後の研究課題と言える。

34

【まとめ】

本研究においてヒトゲノムにおける

AR

結合領域データの解析を行い、新規 アンドロゲン応答遺伝子

G3BP2

を同定、さらに転写制御に関わる

ARE

を 同定した。また、

in vitro

で前立腺癌細胞の増殖能及び遊走能に深く関与し ていることを明らかにした。前立腺癌臨床検体においては悪性度（

Gleason score

）、

pathological T stage

分類、リンパ節転移などと相関していた。

G3BP2

は様々なシグナル伝達に関与しており、本研究並びにさらなる機能

解析により新たな治療標的や診断マーカーの発見などにつながる可能性が

期待される。

35

【謝辞】

本研究の機会を与えてくださり、終始親身な御指導、ご鞭撻を賜りました

日本大学医学部泌尿器科学系泌尿器科学分野主任教授 高橋悟博士に謹ん

で感謝の意を表します。また

1

年半の間、特別研究学生として受け入れ本 研究を行うにあたり、環境を与えて頂き、親身な御指導、貴重な御助言を

賜りました東京大学大学院医学系研究科抗加齢医学講座特任教授 井上聡

博士、東京大学大学院医学系研究科抗加齢医学講座特任講師 浦野友彦博

士、東京大学医学部附属病院老年病科 髙山賢一博士、東京大学医学部附

属病院泌尿器科講師 藤村哲也博士、日本大学医学部泌尿器科学系泌尿器

科学分野助教 大日方大亮博士に心から感謝申し上げます。本研究にあた

り細胞培養を初め、各種解析の御指導、ご鞭撻を賜りました東京大学大学

院医学系研究科抗加齢医学講座皆様に深く感謝申し上げます。

本研究をまとめるにあたり、貴重な御助言を賜りました日本大学医学部泌

尿器科学系泌尿器科学分野研究所准教授 山口健哉博士には衷心よりの謝

意を、そして日本大学医学部泌尿器科学系泌尿器科学分野の皆様に深く感

謝申し上げます。

最後に、物心両面にわたり援助をいただいた両親に感謝いたします。

36

【表・図・図説】

表 前立腺癌臨床病理検体を用いた

G3BP2

免疫組織染色

(n = 101)

G3BP2

染色強度

Low (n = 83)

High (n = 18)

p-value Age

68.2 ± 5.5 68.0 ± 6.6 0.87

血清

PSA

値

(ng/ml)

26.4 ± 34.8 27.6 ± 29.3 0.92 Gleason score

5 1 0 0.0003 6 37 3

7 25 2 8 12 7 9 7 2 10 1 4 Pathological T stage

2 37 8 0.01

3a 32 1

3b 13 7

4

1 2 Pathological N stage

N0 72 9 0.0011

N1 11 9

全細胞数のなかで陽性細胞数が何％存在し（

score 0,

陽性細胞なし

; score 1, <

1/100; score 2, 1/100 to 1/10; score 3, 1/10 to 1/3; score 4, 1/3 to 2/3; score5, >

2/3

）、染色強度（

score 0,

染色されず

; score 1,

弱

; score 2,

中

; score 3,

強）と 合わせて

IR score; 0-8

までで評価した。

IR score

≧

7

を強発現、

IR score

≦

6

を弱発現とした。

37

図

図

11

前前 立立 腺腺 癌癌 診診 療療 アア ルル ゴゴ リリ ズズ ムム

「前立腺癌診療ガイドライン

2012

年版」より抜粋・改変

38

図

図

22

前前 立立 腺腺 癌癌 細細 胞胞 内内 でで のの アア ンン ドド ロロ ゲゲ ンン 受受 容容 体体 のの 役役 割割

39

図

図

33

ゲゲ ノノ ムム ワワ イイ ドド なな

A AR R

結結 合合 部部 位位 のの 検検 索索

上 図 は

Prostate specific antigen (PSA)

の

Chromatin

immunoprecipitation (ChIP) -sequence

法の結果である。アンドロゲンを 付加することにより活性型ヒストンの修飾が認められ、エンハンサー・プ ロモーター領域に多くの

AR

の結合が認められる。同様にしてゲノムワイド にアンドロゲン応答配列を同定している。

40

図

図

44

直直 接接 的的 なな

A AR R

のの 制制 御御 をを 受受 けけ るる 遺遺 伝伝 子子 のの 同同 定定

41

図

図

55

アア ンン ドド ロロ ゲゲ ンン 応応 答答 遺遺 伝伝 子子

G G33B BPP22

のの 同同 定定

（ 上 段）

UCSC genome browser

（

hg18

） 上 で の

G3BP2

の 位 置 。

ChIP-sequence

法により

G3BP2 TSS

近傍にリガンド処理により

AR

の結 合の増加が認められ

1

つの

ARBS

が同定された。（下段）

LNCaP

細胞に

Vehicle

もしくは

DHT (10 nM )

処理を行い

AR

抗体により

ChIP assay

を 行った。濃縮度は

qRT-PCR

により定量化し

input

に対する濃縮率を示した。

42

図

図

66

G G33B BPP22 TTrraannssccrriippttiioonn SSttaarrtt SSiittee ((TTSSSS))

近近 傍傍

A AR RB BSS

内内

及

及 びび 周周 囲囲 のの

m moottiiff

検検 索索

G3BP2 TSS

下 流

645bp-1051bp

に

Androgen Receptor Binding Site

(ARBS)

を認め、内部に

1

つの

Androgen Response Element (ARE)

を同 定。また、周囲に

Oct1

や

HNF3

（

FOXA1

）などの前立腺癌で知られる

AR

関連転写因子群の結合予想配列が多く認められる。

43

図

図

77

G G33B BPP22 pprroom mootteerr,, m muuttaattiioonn--LLuucc ccoonnssttrruucctt

のの 作作 製製

（上段）

ARBS

を含む

G3BP2 enhancer/promoter

領域を

insert

した

G3BP2 promoter-Luc

を作製。さらに

ARBS

内に認められた

1

つの

ARE

候補領域 に

2

カ所の

mutation

を入れた

G3BP2 mutation-Luc

を作製した。（下段）

公共データベース（

Transfac

）で公表されている

ARE consensus

配列。

44

図

図

88

G G33B BPP22 A AR RE E

のの リリ ガガ ンン ドド 依依 存存 的的 なな 転転 写写 活活 性性 化化

LNCaP

細胞に図

7

で作製した

construct

を

transfection

しそれぞれ

Vehicle

及び

DHT (100 nM)

処理し転写活性化を検討した。

pGL3 vector-Luc

は

negative control

として、

PSA

及び

mouse mammary tumor virus (MMTV)

-Luc

は

positive control

として使用した。

45

図

図

99

G G33B BPP22 m muuttaattiioonn--LLuucc

のの 転転 写写 活活 性性 化化 能能 のの 消消 失失

図

8

と同様に

LNCaP

細胞に図

7

で作製した

G3BP2 promoter-Luc

及び

G3BP2 mutation-Luc construct

をそれぞれ

transfection

し

Vehicle

及び

DHT (100 nM)

処理し転写活性化を検討した。

pGL3 vector-Luc

は

negative

control

として使用した。

46

図

図

1100

G G33B BPP22 A AR RE E

のの 同同 定定

（左図）

Vehicle

及び

DHT (100 nM)

処理

48

時間の

LNCaP

細胞から核内 タンパク質の分離抽出を行い、それぞれ

ARE, ARE mutation

オリゴ核酸と 室温で

15

分間

incubation

し

Gel shift assay

を施行した。（右図）リガン

ド処理

LNCaP

細胞から抽出した核内タンパク質とオリゴ核酸に加え抗

AR

抗体の濃度をそれぞれ

4, 10 (µg)

及び

incubation

時間を

15, 30

分間として 調整し施行した。

47

図

図

1111

G G33B BPP22 m mR RN NA A

レレ ベベ ルル でで のの リリ ガガ ンン ドド 応応 答答 性性 発発 現現 定定 量量 解解 析析

（左図）

LNCaP

細胞に

Vehicle

及び

DHT (100 nM)

処理し、処理後各時間 での

mRNA

レベルの発現を

qRT-PCR

を用いて定量化した。

Vehicle

処理 に対するリガンド処理での発現増加率で示した。（右図）

Vehicle

処理及び

DHT (100 nM)

処 理 単 独 、 さ ら に

DHT

処 理 に 抗 ア ン ド ロ ゲ ン 剤

Bicalutamide

付加（それぞれ

1 µM, 5 µM

）処理し

24

時間後に定量解析を 施行した。

48

図

図

1122

G G33B BPP22

タタ ンン パパ クク 質質 レレ ベベ ルル でで のの リリ ガガ ンン ドド 応応 答答 性性 発発 現現 解解 析析

（上図）

LNCaP

細胞に

Vehicle

及びリガンド処理

0, 24, 48

時間後にタンパ ク質を回収し

whole cell lysates 30 (µg)

で

Western Blot

法による発現解析 を行った。（下図）

LNCaP

細胞を用いて同様にしてリガンド処理し蛍光 免疫染色を施行した。

G3BP2

特異抗体により反応させ蛍光に標識された

2

次抗体を用いて局在を示した。

DAPI

により核染色を行った。

49

図

図

1133

別別 のの

A AR R

陽陽 性性 前前 立立 腺腺 癌癌 細細 胞胞 株株 （（

V VC CaaPP

細細 胞胞 ）） でで のの

G

G33B BPP22

アア ンン ドド ロロ ゲゲ ンン 応応 答答 性性 のの 検検 討討

細胞株を別の

AR

陽性前立腺癌細胞株

VCaP

細胞にして図

9, 11, 12

と同様 の条件にてアンドロゲン応答性を検討した。

50

図

図

1144

G G33B BPP22

安安 定定 過過 剰剰 発発 現現 細細 胞胞 株株 （（

SSttaabbllee

細細 胞胞 ）） のの 作作 製製

G418 (500 µg/ml)

にて

selection

を行い、

Flag

付き

G3BP2

安定過剰発現細 胞株を

2

株作製した。（上図）

qRT-PCR

により

mRNA

レベルでの

G3BP2

の発現を解析した。（下図）

Western Blot

法によりタンパク質レベルでの

G3BP2

の発現の解析を行った。

51

図

図

1155

G G33B BPP22

安安 定定 過過 剰剰 発発 現現 細細 胞胞 株株 のの 細細 胞胞 増増 殖殖 能能 解解 析析

Cell proliferation assay

（

MTS assay

）を用いて

G3BP2

安定過剰発現細胞

及び

Vector

コントロール細胞の細胞増殖能を検討した。

96 well

にそれぞ

れの細胞株を

3×10

³ 個ずつ散布した（

N=4

）。

0, 24, 48, 72

時間後に

MTS

assay

を行い、吸光度を測定した。

52

図

図

1166

G G33B BPP22

安安 定定 過過 剰剰 発発 現現 細細 胞胞 株株 のの 遊遊 走走 能能 解解 析析

G3BP2

安定過剰発現細胞及び

Vector

コントロール細胞をそれぞれ

5×10

⁴ 個ずつ

24 well

に散布し

24

時間培養し

Cell migration assay

を用いて解析 した。メタノール固定後ギムザ染色し

pore

を通過した細胞数を蛍光顕微鏡 にてランダム

5

視野で評価し

G3BP2

安定過剰発現細胞の遊走能を解析、

定量化した。

53

図

図

1177

ssiiG G33B BPP22

にに よよ るる 発発 現現 抑抑 制制 効効 率率 のの 検検 討討

LNCaP

細胞に対して各

siRNA (10 nM)

になるように

transfection

施行し、

48

時間後に

RNA

及びタンパク質を回収、

qRT-PCR, Western Blot

法によ り発現を解析した。

54

図

図

1188

G G33B BPP22

発発 現現 抑抑 制制 にに よよ るる 細細 胞胞 増増 殖殖 能能 へへ のの 影影 響響

図

15, 17

と同様の条件で

LNCaP

細胞を

siG3BP2 2

種類で処理し

cell

proliferation assay

にて検討した。

55

図

図

1199

G G33B BPP22

発発 現現 抑抑 制制 にに よよ るる 細細 胞胞 遊遊 走走 能能 へへ のの 影影 響響

図

18

の増殖能

assay

と同様に処理して遊走能については

cell migration

assay

にて定量化し検討した。

56

図

図

2200

前前 立立 腺腺 癌癌 臨臨 床床 検検 体体 にに おお けけ るる

G G33B BPP22

発発 現現 解解 析析

日本大学医学部附属板橋病院にて前立腺癌の診断のもと前立腺全摘除術を 施行した

101

例について、

anti-G3BP2 antibody

（

1

：

100

希釈）を用いた 免疫組織染色を施行した。

Gleason score

別及び

Benign

の免疫組織染色の 例を示した。

Scale bar: 50 (µm)

57

【引用文献】

1.

雑 賀 公 美 子

,

松 田 智 大

,

祖 父 江 友 孝

:

日 本 の が ん 罹 患 の 将 来 推 計

.

が ん・統計白書

2012

－データに基づくがん対策のために

,

祖父江友孝

,

片野 田耕太

,

味木和喜子ほか

(

編

),

篠原出版新社

,

東京

, 63-81

頁

, 2012

2.

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5. Catalona WJ and Han M : Definitive therapy for localized prostate cancer-An overview. in Campbell-Walsh Urology, edited by Wein AJ, Saunders, Philadelphia, 9th edition, pp2932-2946, 2007

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JAMA 280 : 969-974, 1998

8. Huggins C, Hodges CV : Studies on prostatic cancer; the effect of

castration, of estrogen and of androgen injection on serum phosphatases