アドレノドキシンの局在 奈良県立医科大学第

種々の免疫電子顕微鏡j 去を用いたウシ副腎皮質 アドレノドキシンの局在

奈良県立医科大学第 1 解剖 j 学教室

秦 野 修

LOCALIZATION OF  ADRENODOXIN IN BOVINE ADRENAL CORTEX USING  VARIOUS IMMUNOELECTRON MICROSCOPIC TECHNIQUES 

OSAMU HAT  ANO 

D e p a r t m e n t  0 1  Anatomy ，  Nara M e d i c a l  U n i v e r s i t y  

R e c e i v e d  J a n u a r y  3 1 ，  1 9 9 0  

Summa ηAdrenodoxin h a s  b e e n  r e p o r t e d  t o  b e  h e t e r o g e n o u s l y  d i s t r i b u t e d  among  t h e  m i t o c h o n d r i a  w i t h i n  a  s i n g l e  p a r e n c h y m a l  c e l l  o f  t h e  a d r e n a l  c o r t e x  by a  p r e . e m b e d d i n g   i m m u n o c y t o c h e m i c a l  method w i t h  h o r s e r a d i s h  p e r o x i d a s e . l a b e l e d  F a b '  a n t i b o d i e s .  U s i n g   v a r i o u s   i m m u n o e l e c t r o n   m i c r o s c o p i c   t e c h n i q u e s ，  1 r e . e x a m i n e d   t h e   d i s t r i b u t i o n   o f   a d r e n o d o x i n  among t h e  m i t o c h o n d r i a  i n  t h e  p a r e n c h y m a l  c e l l s  o f  b o v i n e  a d r e n a l  c o r t e x .  By  p o s t . e m b e d d i n g  i m m u n o c y t o c h e m i s t r y  i n   c o m b i n a t i o n  w i t h  t h e  p r o t e i n  A ‑ g o l d  t e c h n i q u e ，  g o l d  p a r t i c 1 e s  were s e e n  o n  a l l   t h e  m i t o c h o n d r i a  examined i n  t h e  p a r e n c h y m a l .  c e l l s .   By  n o n . e m b e d d i n g  i m m u n o c y t o c h e m i s t r y   C i m m u n o . c r y o u l t r a m i c r o t o m y )  i n  c o m b i n a t i o n  w i t h   t h e  p r o t e i n  A‑gold t e c h n i q u e  o r  a  p e r o x i d a s e . l a b e l e d  s t r e p t a v i d i n . b i o t i n  method ，  a l l  o f  t h e   m i t o c h o n d r i a  examined i n   t h e  p a r e n c h y m a l  c e l l s   were l a b e l e d  w i t h  g o l d  p a r t i c 1 e s   o r  3 ，  3 '  . d i a m i n o b e n z i d i n e  r e a c t i o n  p r o d u c t s .  By p r e . e m b e d d i n g  i m m u n o c y t o c h e m i s t r y  e x a m i n i n g   t r a n s v e r s e  u l t r a t h i n  s e c t i o n s  p r e p a r e d  from c r y o s t a t  s e c t i o n s ，  t h e  m i t o c h o n d r i a  i n  c o n t a c t   w i t h  t h e  s u r f a c e  o f  t h e  c r y o s t a t  s e c t i o n s  were s t a i n e d  a t   a  h i g h e r  p e r c e n t a g e  t h a n  t h e   m i t o c h o n d r i a  w i t h i n   t h e   c r y o s t a t   s e c t i o n s .   These r e s u l t s   s u g g e s t   t h a t   a d r e n o d o x i n  i s   d i s t r i b u t e d  h o m o g e n e o u s l y  among t h e  m i t o c h o n d r i a  w i t h i n  a  p a r e n c h y m a l  c e l l   a n d  t h a t   m i t o c h o n d r i a l  h e t e r o g e n e i t y  i s   c a u s e d  by u n e v e n  a n t i b o d y  p e n e t r a t i o n  i n t o  m i t o c h o n d r i a  i n   t h e  p r e . e m b e d d i n g  m e t h o d .  W i t h i n  t h e  m i t o c h o n d r i a  i n  t h e  p a r e n c h y m a l  c e l l s ，  a d r e n o d o x i n   was s t a i n e d  on t h e  m a t r i x  a n d  i n n e r  m i t o c h o n d r i a l  membrane. A d r e n o d o x i n  was a l s o   s t a i n e d   on t h e   r o u n d  a n d  e l e c t r o n . d e n s e   i n t r a m i t o c h o n d r i a l   b o d i e s ，  w h i c h  were o f t e n   o b s e r v e d  i n  t h e  m i t o c h o n d r i a  o f  p a r e n c h y m a l  c e l 1 s  i n  t h e  z o n a  g l o m e r u l o s a  a n d  i n  t h e  o u t e r   l a y e r  o f  t h e  z o n a  f a s c i c u l a t a .  By q u a n t i t a t i v e  i m m u n o e l e c t r o n  m i c r o s c o p y ，  t h e  d e n s i t y  o f   g o l d  p a r t i c 1 e s  o n  m i t o c h o n d r i a  i n  t h e  p a r e n c h y m a l  c e l l s  o f  t h e  z o n a  g l o m e r u l o s a  was two  t o  t h r e e  f o l d  l o w e r  t h a n  t h a t  o f  t h e  z o n a  f a s c i c u l a t a ，  w h i l e  t h a t  o f  t h e  z o n a  r e t i c u l a r i s  was  s i m i l a r  t o  t h a t  o f  t h e  z o n a  f a s c i c u l a t a .  The m e r i t s  a n d  d e m e r i t s  o f  p r e ， 剛 p o s t . ，  a n d  n o n .   embedding i m m u n o c y t o c h e m i s t r y  a r e  d i s c u s s e d .  

I n d e x  Terms 

a d r e n o d o x i n ，  b o v i n e  a d r e n a l  c o r t e x ，  i m m u n o e l e c t r o n  m i c r o s c o p y ，  l o c a l i z a t i o n ，  m i t o c h o n .  

d r i a l  h e t e r o g e n e i t y  

緒 言

ステロイドホノレモン生合成には，その最初のステップ であるコレステローノレの側鎖切断を触媒するチトクロー ム P‑450(SCC) をはじめ，種々のチトクローム P ‑ 4 5 0 が 関与している.これらの P ‑ 4 5 0 には生化学的な遠心分画 法により， ミトコンドリアに存在するタイプと， ミクロ ソームに存在するタイプがあることがわかっている

アドレノドキシン ( a d r e n o d o x i n ) は ， NADPH からアド レノドキシンリダクターゼ ( a d r e n o d o x i nr e d u c t a s e ) に 伝達された電子を受取り，ミトコンドリアに局在する P 4 5 0  ( P ‑ 4 5 0  (SC C)と P ‑ 4 5 0 ( 1 1 β ) ) にその電子を伝達する 機能を持っており

， P ‑ 4 5 0 の酵素触媒機能〔ステロイド 水酸化反応〉の発現に必須のタンパク質である.アドレノ

ドキシンは，分子量 2 2 ， 0 0 0 ダノレトンの前駆体としてポリ ソームで合成され， ミトコンドリア内にはいったのち切 断を受けて，分子量 1 2 ， 0 0 0 ダノレトンのタンパク質となっ て機能することがわかっている

生体高分子の細胞内局在を知るには，細胞分画法のほ かに，免疫電子顕微鏡法が存在する.免疫電子顕微鏡法 は，細胞分画法では避け難い他成分の混入の問題が無く，

直接， 目で観察可能であるという長所をもっている.免 疫電子顕微鏡法には，大きく分けて 3 種類の方法があり，

それぞれ，包埋前染色法 ( p r e ‑ e m b e d d i n g 法

，包埋後染 色 法 ( p o s t ‑ e m b e d d i n g 法

ベ 無 包 埋 染 色 法 ( n o n ‑ embedding 法 あ る い は immuno ‑cryoul t r a ‑ microtomy) 

とよばれている.

された膜においても，特にミトコンドリアのように内膜，

外膜の二重の単位膜に固まれた細胞内小器官では，抗体 がこの二重膜を通過することは非常に困難である.その た め ミ ト コ ン ド リ ア 内 抗 原 の 局 在 の 解 析 は ， p r e ‑ embedding 法において最も困難なものとされているめ.

p r e ‑ e m b e d d i n g 法において，この抗体の膜透過性をより 良くするために，蛋白質分解酵素により抗体の低分子化 を行い， F a b ' まで分解し，染色性をあげている報告がな されている剖

7)が，浸透性において完全であるかどうか は疑問視されるところである.一方，他の 2 種の免疫電 子顕微鏡法においては， p o s t ‑ e m b e d d i n g 法則

において も ， n o n ‑ e m b e d d i n g 法

においても，ミトコンドリア二重 膜はウルトラミクロトームによる超薄切片作成の際に切 断されるので， ミトコンドリア内抗原は，膜に邪魔され ることなく自由に抗原抗体反応が可能であり，抗体の浸 透性の問題はまったく無い.

著者は，アドレノドキシンの免疫電子顕微鏡法による 局在を解析している際に，このミトコンドリア聞におけ るアドレノドキシン存在量の不均一性の問題につきあた り，種々の免疫電子顕微鏡を用いることにより，このミ トコンドリア聞の不均一性の真偽を検討することになっ た.本論文では， これらの種々の免疫電子顕微鏡法を用 いて明らかになったアドレノドキシンの存在様式，およ び局在部位，また定量免疫電子顕微鏡法によって明らか になった副腎皮質各層におけるアドレノドキシンのミト コンドリア内存在密度の違いについて報告すると共に，

それぞれの免疫電子顕微鏡法の持つ長所・短所について アドレノドキシンを含めて 4 種のミトコンドリア内 P も述べる.

‑ 4 5 0 関連酵素，すなわち P‑450(SCC) ， P ‑ 4 5 0 ( 1 1 β ) ，ア ドレノドキシンおよびアドレノドキシンリダクターゼの

局在に関しては， 4種共に免疫電子顕微鏡法・包埋前染色 動物と組織固定

材料および方法

法 ( p r e ‑ e m b e d d i n g 法〉により，ミトコンドリア内膜に存 2 0 匹の雌ウシ(成牛〉の副腎を屠畜場より入手した.ウ 在し，また，同一細胞内ミトコンドリア間で，これら酵 シ の 死 後 l 時間以内〔朝 7 時から 1 0 時の間〉に副腎を 素を大量に含むものからまったく含まないものまで，そ 1mm の厚さでスライスし，以下の種々の国定液で 0‑4' の存在量においてミトコンドリア聞で、木均一性 ( h e t e r ‑ C で 3‑8 時間固定した.固定液は， 1 ) 2%  g l u f a r a l d e ‑ o g e n e i t y ) に 富 ん で し 、 る と い う 報 告 が な さ れ て い hyde(GA)‑2% paraformaldehyde(PFA)‑0 . 1   M 燐 酸 る

別のグループは同様の p r e ‑ e m b e d d i n g 法によ 緩衝液 pH7 . 4 (PB) ， 2)2%  GA‑1% P F A ‑ 0 . 1   M PB ， 

り

， P‑450(SCC) と P ‑ 4 5 0 ( 1 1 β 〉に関して陽性のミトコン 3)1% GA‑l% PFA‑0.1 M PB ，  4 ) 0 . 5 %  GA‑2% PFA  ドリアと陰性のミトコンドリア聞に形態に違いがないこ 0 . 1   M PB ，  5)0.I%GA‑2% PFA‑O . l   M PB ，  6 ) 0 . 0 5 %   とから，このミトコンドリア聞における酵素存在量の不 GA‑4% PFA‑O . l   M PB ，  7 ) 0 . 0 5 %  GA‑4% PFA‑0.21% 

均一性の存在を疑問視している

p r e ‑ e m b e d d i n g 法の ピグリン酸 0 . 1M PB ，  8)2% PFA‑0.21% ピクリン酸 O .

欠点として，抗体の浸透性が悪いということがあげられ 1 3  M PB ，  9 )   P  L  P 固定液 ( 0 . 0 1M 過ヨウ素酸ナトリウ

る.抗体は完全な生体膜を通過することが出来ず，固定 ム ー 0 . 0 7 5M リジン 2%P F A ‑ 0 . 0 3 7  M 燐酸緩衝液 pH6 .  

2 ) を試した. g l u t a r a l d e h y d e 濃度 (0‑2%) およびピクリ る.ニッケノレグリッド上の超薄切片を BSA‑PBS で 1 0 ン酸の添加は， p o s t ‑ e m b e d d i n g 法と non‑embedding 法 分間の前処理をし， BSA‑PBS で 1 0 0 倍希釈した抗アド における染色強度にほとんど影響を及ぼさなかったが， ノドキシン抗血清で一晩反応させた後， BSA‑PBS で洗 p r e ‑ 巴 mbedding 法においては，わずか 0 . 0 5 % の g l u t a r a l

浄し， 0 . 0 5 %Tw

n2 0  ( S i g m a ) を含む BSA‑PBS で 5 0 dehyde 添加によっても染色強度の著しい減退が認めら 倍希釈した p r o t e i nA  ‑ g o l d  (5nm) 液で、 2 時間反応させ，

れた 0 . 0 5 %Tween 2 0 を含む BSA‑PBS で洗浄し，更に BSA p o s t ‑ e m b e d d i n g 法に用いる組織は，主に 0 . 5 % GA‑ ‑PBS で洗浄，蒸留水で洗浄後， 4% 酢酸ウランで 6 分間，

2% PFA‑O.l M PB で固定後， 0 . 1   M PB で 1 時間洗い R e y n o l d s 'l e a d  c i t r a t 巴で 9 0 秒間染色し，電子顕微鏡(日 50% ，  70% ，  90% ，  100% エタノーノレで脱水した後，低温包 本電子 JEM1200EX) で観察した.

埋樹脂 L o w i c r y lK4M に包埋し，紫外線照射を 4

C で 3 対照実験として，抗アドレノドキシン抗血清と精製ア 日間行い重合させた国. R e i c h e r t 社 U l t r a c u tE を用い ドレノドキシンとを， 1 μ l の抗血清に対して 1 0 0 μ g の精 て作成した超薄切片をニッケノレグリッドに拾い，免疫細 製アドレノドキシンの割合であらかじめ一晩反応させて 胞化学的染色を行った. おいたものを，抗アドレノドキシン抗血清の代わりに用 non‑embedding 法に用いる組織は，主に 2%GA‑2%  いた.また，別の対照実験として，抗アドレノドキシン PFA‑O.l MPB で固定後， 2 . 3  M s u c r o s e ‑ 5 0  m M   PB に 抗血清を正常ウサギ血清に代えて反応させた.

1 時間浸透させた後，液体窒素で凍結し， R e i c h 巴 r t 社 n o n ‑ e m b e d d i n g 法における免疫細胞化学的染色 FC4 で作成した凍結超薄切片をニッケノレグリッドに拾 Tokuyasu

の方法を少し改変して行った.ニッケノレ い，免疫細胞化学的染色をおこなった. グリッド上の凍結超薄切片会 PBS で洗浄， 2% g e l a t i n  

p r e ‑ e m b e d d i n g 法に用いる組織は，主に 4%PFA‑O.l  で 1 0 分間の前処理をし， 0 . 1 %  g e l a t i n ‑ l 0  m M   g l y c i n e ‑ M PB で固定後，順に 10% ， 20% ，  30% s u c r o s e ‑ O . l  M  0 . 9 %  NaCl‑50mM PB(GGPBS) で洗った後， 2% BSA  PB に浸透させ，

(20μm) を作成し ‑GGPBS で 1 0 0 倍希釈した抗アドレノドキシン抗血清 20mM PB‑0.9% NaCl(PBS) で洗った後， PBS 中に浮遊 で 1 時間反応させた.次に， GGPBS で洗浄し， 2%BSA 

させた状態で免疫細胞化学的染色をおこなった ‑GGPBS で 5 0 倍希釈した p r o t 巴 i nA‑gold(6nm) 液と l 形態観察だけの通常の電子顕微鏡法に用いる組織は， 時間反応させた.この後 GGPBS で洗浄， O . I M  PB で洗 0 . 5 %  GA‑2% PFA‑O.l M PB で固定後，更に 2% オス 浄 ， 2% g l u t a r a l d e h y d 巴 ‑ 0 . 1M PB で 2 0 分間固定後，蒸 ミウムで 2 時間後固定し，エポキシ樹脂 (Luveak8 1 2 ・ 半 留水で洗浄して， 2% 中性酢酸ウラン溶液で 1 0 分間処理 井化学〉に包埋した. した.ついで蒸留水で洗浄し， 0 . 0 2 % 酸性酢酸ウランー O

アドレノドキシンの精製と抗血清の作成 2% メチノレセノレロースー 2% ポリエチレングリコーノレ アドレノドキシンは， ウシ副腎皮質ミトコンドリア画 (MWI540) で 1 0 分間処理した後，グリッドをノレープで 分より， Suhara ら叫の方法により精製されたものを用 すくいあげ，過剰の液を j 慮紙で除き乾燥させて，電子顕 いた.アドレノドキシンに対する抗血清は，ウサギを精 微鏡で観察した.

製アドレノドキシンで， O h a s h i と Omura

の方法で免 p r e ‑ e m b e d d i n g   ).去における免疫細胞化学的染色 疫したものを用いた.このアドレノノドキシン抗血清は， 厚さ 20μm のクリオスタット切片を，浮遊法により以 オグタロニ一二重拡散法により，精製アドレノドキシン 下の処理を行った. BSA‑PBS で 1 0 分間の前処理をし および副腎皮質ミトコンドリアの超音波処理抽出液の両 た後， BSA‑PBS で 2 0 0 0 倍に希釈した抗アドレノドキ 者に対して，一本の沈降線を形成した. シン抗血清と 1 5 時間反応させ，その後 PBS で洗浄，

p r o t e i n  A ‑ g o l d   液の調整 BSA‑PBS で 2 0 0 倍希釈したピオチン化抗ウサギ IgG

平 均 直 径 5nm と 6nm の 金 コ ロ イ ド を S l o t と 抗体 (ABCk i t ，  V e c t o r 社〉と一晩反応させ， PBS で洗

G 

超薄切片をクリオスタット切片に，平行あるいは垂直に 作成し， 4% 酢酸ウランで 2 0 分間， R e i n o 1 d s '  1 e a d  c i t r a t e   で 3 分間染色し，電子顕微鏡で観察した.

光学顕微鏡レベルの免疫細胞化学

厚さ 1μm の L o w i c r y 1 K4M 切片をスライドグラス上 に固着させ， p o s t ‑ e m b e d d i n g 法における免疫細胞化学 的染色の項で述べた p r o t 巴 inA‑go1d 法で染めた後，銀増 感(J a n s s e n 社の s i l v 巴 renhancement k i t を使用〉をおこ なっ k.

定量免疫電子顕微鏡法

p o s t ‑ e m b e d d i n g 法で免疫染色した切片の電子顕微鏡 写真より， 6 個の実質細胞のミトコンドリア上の金粒子 数を数えた.ミトコンドリアの断面積は， L e i t z 社の半自 動イメージアナライザによって測定し， ミトコンドリア 単位断面積(1 μm') あたりの金粒子数を計算した.

結 果

1. 

光学顕微鏡レベルでの免疫細胞化学

ウシ副腎の L o w i c r y 1 K4M 切片を， ウサギ抗ウシ・ア ドレノドキシン抗血清，引続き p r o t e i nA  ‑ g o l d 液で処理 した後，銀増感をおこない，アドレノドキシンの光学顕 微鏡レベノレで、の局在を調べると ( F i g . l)，球状帯，束状帯，

網状帯の実質細胞細胞質に銀の沈着が認められた.球状 帯の染色強度は，束状帯や網状帯に比べてより弱かった ( F i g . 1 a ， b ) . 副腎被膜や副腎髄質，また副腎皮質内の非実 質細胞，すなわち内皮細胞，結合組織系の線維芽細胞，

血管腔内の細胞などは染色されなかった ( F i g . 1 c ) . 2.  包埋後染色法 ( p o s t ‑ e m b e d d i n g 法)

低温包埋樹脂である Lowic 巧 1 1 K4M に包埋したウシ 副腎の超薄切片を，抗アドレノドキシン抗血清，引続き p r o t e i n  A  ‑ g o l d 液と反応させた.金粒子は副腎皮質の三 層 す べ て の 実 質 細 胞 の ミ ト コ ン ド リ ア 上 に 存 在 し た ( F i g ム 4 ， 5 ) . 副腎被膜や副腎髄質，また副腎皮質内の非実 質細胞，すなわち内皮細胞，結合組織系の線維芽細胞，

血管腔内の細胞などの上には金粒子は認められなかっ た.実質細胞においては，調べた限りすべてのミトコン ドリア上に金粒子は認められ，他の細胞内小器官すなわ ち，細胞核 ( n u c 1 e i)，滑面及び粗面小胞体 (smooth and  rough e n d o p 1 a s m i c  r e t i c u 1 u m ) ，一次および二次リソゾ ーム ( p r i m a r yand s e c o n d a r y  1 y s o s o m e ) ， ベノレオキシ ソーム ( p e r o x i s o m e ) ， ゴノレジ体 C G o 1 g ia p p a r a t u s ) ，  脂 肪滴Cl i p i dd r o p 1 e t ) ，及び細胞質基質上には，金粒子は認 められなかった.

2‑1  束状帯.金粒子は調べた限りすべてのミトコン ドリア上に認められた ( F i g . 2 ) . 東状帯のミトコンドリア

は，直径約 0.6μm のほぼ球形をしており，そのクリステ は小胞状 ( v e s i c u 1 a r ) ないし小管状 ( t u b u 1 e r ) の形態をし ている.金粒子はマトリッグスとミトコンドリア内膜に 認められた ( F i g . 2 ) . ミトコンドリア単位断面積あたりの 金粒子密度を測定すると C F i g . 6 ) ， ミトコンドリア 1μm' 当り平均 4 2 2 . 8 個の金粒子が存在し，その標準備差は 5 9 3 と小さく， ミトコンドリア間でのアドレノドキシン存 在密度は均一であった. p r e . e m b e d d i n g 法を用いて副腎 皮質ミトコンドリアは，アドレノドキシンを大量に含む ものから，まったく含まないものまで不均一性に富んで いる

と報告されているが，その様な不均一性は認める ことができなかった.

金粒子は丸く電子密度の高いミトコンドリア内穎粒上 にも認められた C F i g . 3 a ムC).このミトコンドリア内穎粒 は束状帯外層部に頻繁に認められたが，束状帯内層部に はほとんど認められなかった.大きなミトコンドリア内 頼粒では， ミトコンドリア内にいっぱいに広がる程の大 きな穎粒も存在し， この大きな穎粒上にも同様に金粒子 は認められた.大きなミトコンドリア内穎粒は，一見す ると脂肪滴の様な印象を与えるが，脂肪滴は，今回用い た L Q w i c r y 1 K4M 包埋切片においては，電子密度が{尽 く，ほとんど透明 ( e 1 e c t r o n . 1 u c e n t ) である ( F i g . 3 a ) ので 容易にミトコンドリア内頼粒と区別がついた.金粒子は 脂肪滴上には認められなかった ( F i g . 3 a ) . 大きなミトコ ンドリア内穎粒を持つミトコンドリアは， ミトコンドリ アそのものの直径も他のミトコンドリアに比べて大きい ものが多かった.

2‑2  球状帯.アドレノドキシンの局在を示す金粒子 は，球状帯実質細胞ミトコンドリアのマトリッグスとミ

トコンドリア内膜に認められた ( F i g . 4 a ， b )，マトリック スにおける局在は，マトリッグスの領域が広いミトコン ドリアにおいてはっきりと確認された ( F i g . 4 a ， b ) . また ミトコンドリア単位断面積当りの金粒子密度は， ミトコ ンドリア lμm' 当り平均 1 7 3 . 5 個であり，束状帯ミトコン ドリアに比べて 2 .4分の l の低密度であった ( F i g . 6 ) .

アドレノドキシンの局在を示す金粒子は，丸く電子密

度の高いミトコンドリア内穎粒上にも認められた ( F i g .

4a ， b ) . このミトコンドリア内穎粒は，球状帯実質細胞に

非常に多数存在しており，副腎皮質すべての層のうちで

最も高頻度に存在していた"また，大きさもミトコンド

リア内にいっぱいに広がった程の大きなミトコンドリア

内頼粒が多数存在していた.この様に大きなミトコンド

りア内穎粒を持つミトコンドリアは，通常の形態を持つ

ミトコンドリアに比べて，直径がより大きくなっている

ものが多かった. ミトコンドリア内にいっぱいに広がっ

ている大きなミトコンドリア内穎粒は，一見したところ ミトコンドリアとは思われず，むしろ脂肪滴に思われる が，1)脂肪滴はこの L o w i c r y lK4M 包埋切片において明 るく抜けて見えるのに対して，電子密度が高く黒く見え ることと，

オスミウム後固定，エポキシ樹脂包埋した 標本で観察すると， ミトコンドリアの内膜，外膜に相当 すると思われる二重の単位膜が存在すること ( F i g . 8 ) か ら ， ミトコンドリアであると判断された.

2‑3 

網状帯.網状帯ミトコンドリアにおける所見 は，束状帯ミトコンドリアの所見と似ており，特に束状 帯の内層部のミトコンドリアの所見とよく似ていた.ア ドレノドキシンの局在を示す金粒子は，調べた限りすべ ての実質細胞ミトコンドリア上に認められた ( F i g . 5 ) . ミ

トコンドリアは，直径約 0.6μm のほぼ球形をしており，

そ の ク リ ス テ は ， 小 胞 状 ( v e s i c u l a r ) な い し 小 管 状 ( t u b u l e r ) の形態をしており，束状帯ミトコンドリアより も小管状のクリステが多い.金粒子はマトリックスとミ トコンドりア内膜に認められた. ミトコンドリア単位断 面積あたりの金粒子密度は，東状帯のものとほぼ同程度 であった.丸く電子密度の高いミトコンドリア内頼粒は，

束状帯の内層部と同様に非常にまれにしか存在せず，ま た小さいものであったが，このまれに認められるミトコ ンドリア内穎粒上には金粒子が認められた.

2‑4 

対照実験.1)1次抗体として，精製アドレノド キシンと前もって反応させておいた抗アドレノドキシン 抗血清を用いた時，全ての実質細胞ミトコンドリア上，

および丸く電子密度の高いミトコンドリア内頼粒上にお いて，金粒子はほとんど存在しなくなった ( F i g . 7).他の 細胞内小器官および非実質細胞においても，金粒子はほ とんど存在しなかった.また， 2 ) 1 次抗体として，抗アド レノドキシン抗血清の代わりに正常ウサギ血清を用いた 時も，1)と同様に全ての細胞内小器官に，金粒子はほと んど存在しなかった.

3  包埋前染色法 ( p r e

embedding 法)

3‑

1.ウシ副腎の 20μm のグリオスタット切片を，抗 アドレノドキシン抗血清，ピオチン化抗ウサギ IgG 抗 体，ストレプトアピジンーベノレオキシダーゼの

買に反応さ せ ， DAB 反応後，エポキ、ン樹脂包埋したものから超薄切 片を作成し，電子顕微鏡で観察すると，副腎皮質実質細 胞ミトコンドリアには，アドレノドキシンを大量に含む もの〔濃く染色されるもの〉や，少量含むもの(薄く染色さ れるもの)，あるいは全く含まないもの〔染色されないも の〉等，アドレノドキシン含有量に関して，同一細胞内ミ トコンドリア聞で不均一性に富んでいるとし、う結果が得 られた ( F i g . 9 a ) . これは，先に観察した p o s t ‑ e m b e d d i n g

法において， ミトコンドリア間でアドレノドキシン含有 量が均一であるという結果に，相反するものであった.

3‑2.

次に，同様に p r e ‑ e m b e d d i n g 法によって抗原抗 体反応後，エポキシ樹脂包埋したものからクリオスタッ

ト切片に垂直に超薄切片を作成し，電子顕微鏡観察する と ! l リオスタット切片表面に接したミトコ

ドリアは 70‑80% のミトコンドリアがアドレノドキシンに対して 強く反応陽性であったのに比べて，切片内部のミトコン ドリアは 30‑40% が反応陽性であり，切片表面に接した ミトコンドリアの方が，切片内部のミトコンドリアより も約 2 倍多く反応陽性であった ( F i g . 9 b ) .

4.

無 包 埋 染 色 法 ( n o r

embedding 法 も し く は i m m u n o ‑ c r y o u l t r a m i c r o t o m y )  

4‑1.

ウシ副腎皮質を固定後，樹脂包埋することなく，

直ちに凍結超薄切片を作成し，抗アドレノドキシン抗血 清，引続き p r o t e i nA  ‑ g o l d と反応させ，電子顕微鏡で観 察すると C F i g . l O ， l l ) ， p o s t ‑ e m b e d d i n g 法と同様に実質 細胞の全てのミトコンドリア上に金粒子が認められ，同 一細胞内ミトコンドリア聞では，金粒子は一様の標識密 度であった ( F i g . 1 0 a ) . ミトコンドリア内では，金粒子は

7

トリックスとミトコンドリア内膜に認められた ( F i g . l l a ) . また，丸く電子密度の高いミトコンドリア内穎粒 上にも金粒子は認められた ( F i g . 1 1 b ) . ゴノレジ装置 ( F i g . 1 0 b ) ，滑面小胞体 ( F i g . 1 0 a ) など，他の細胞内小器官には 金粒子は認められなかった.

4‑2.

ウシ副腎皮質の凍結超薄切片に，抗アドレノド キシン抗血清，ビオチン化抗ウサギ IgG 抗体，ストレプ トアピジンベノレオキシダーゼの順に反応させ， DAB 反 応を行った ( F i g . 1 2 ) . この方法は先におこなった p r e ‑ embedding 法 ( 3 ‑ 1)と比べて，同じく凍結切片であり， 2  次抗体以下の反応方法も同じであるが，反応させる際の 切片の厚さが異なっているだけである.すなわち p r e ‑ embedding 法のグリオスタット(凍結〉切片の場合，

20μm であったが，この凍結超薄切片の場合，約 0 . 1 μm

の薄さである.凍結超薄切片上で DAB 反応産物は，直径

約 50nm の粒状の頼粒 ( F i g . 1 2 b ) としてすべてのミトコ

ンドリア上に認められ ( F i g . 1 2 a ) ， p r e

embedding 法の結

果 C F i g . 9 a ) と相反するものであった.

考 察

ミトコンドリア間の染色性

著者は， p o s t

embedding 法を p r o t e i nA  ‑ g o l d 法と組 み合わせて用い，ウシ副腎皮質におけるアドレノドキシ ンの局在を調べた.ウシ副腎皮質を L o w i c r y lK4M に包 埋した超薄切片において，調べた限りすべての実質細胞 ミトコンドリア上に，アドレノドキシンの局在を示す金 粒子が認められた ( F i g ム 4 ， 5 ) . またミトコンドリア単位 断面積当りの金粒子標識密度は，束状帯ミトコンドリア 聞で均一であった ( F i g . 6 ) . 同様の結果は，他の親水性樹 脂である LRGold や LRWhite に包埋したウシ副腎皮 質超薄切片においても認められた〔未発表データ).これ らの結果は， p r e

embedding 法によって報告されている 副腎皮質ミトコンドリアは，同一細胞内ミトコンドリア 間でアドレノドキシンを大量に含むものからまったく含 まないものまで，その酵素含有量において不均一性に富 んでいるという報告

と相反するものであった.そこで 著者も， p r e ‑ e m b e d d i n g 法を用いてアドレノドキシンの 局在を調べてみると，報告されている様に， ミトコンド リアは，同一細胞内ミトコンドリア聞でアドレノドキシ ンを大量に含むものからまったく合まないものまで，そ の酵素含有量において不均一性に富んでいるという結果 が得られた ( F i g . 9 a ) . 用いる免疫電子顕微鏡法の違いに よるこのような結果の食い違いを統一的に解釈するため に，著者は，更に他の免疫電子顕微鏡法を試みた. p o s t

embedding 法

と p r e ‑ e m b e d d i n g 法

の 中 間 の 性 格 を 持っと考えられる凍結超薄切片

を用いた p r o t e i n A‑

g o l d 法においても，全ての実質細胞ミトコンドリア上 に ， ミトコンドリア闘で均一な密度でアドレノドキシン の局在を示す金粒子が認められた ( F i g . 1 0 a )，また，更に 凍結超薄切片を用いて， p r e ‑ e m b e d d i n g 法で用いた染色 方法であるところの， 1 次抗体，ピオチン化 2 次抗体，ス トレプトアピジンベノレオキシダーゼのあと DAB 反応 を 行 う と い う 染 色 方 法 を 行 っ た . こ の 方 法 は p r e ‑ embedding 法と同じく凍結切片であり，その切片の厚さ が p r e ‑ e m b e d d i n g 法の場合 20μm であるのに対して，

凍結超薄切片の場合約 0.1μm と非常に薄いという違い があるだけであり，他の反応は同じである.この場合も，

p o s t ‑ e m b e d d i n g 法と同様にすべての実質細胞ミトコン ドリアに DAB 反応産物が認められた ( F i g 目12).これら の結果から， ミトコンドリア聞の染色性の不均一性は厚 い切片 (20μm) においてのみ認められ，薄い切片〔約 0 . 1 μm) においては，樹脂包埋切片，凍結切片を問わず認め

られないということが明らかになった.副腎皮質ミトコ

ンドリアは，直径約 0.6μm であるので， 20μm の切片 ( p r e ‑ e m b e d d i n g 法〉の場合は，抗体がミトコンドリア内 に到達するために， ミトコンドリアの内膜，外膜の 2 重 の単位膜を通過しなければならなし、

一方，凍結超薄切 片 ( n o n ‑ e m b e d d i n g 法)，あるいは樹脂包埋超薄切片 ( p o s t ‑ 巴 mbedding 法〉の場合は，切片の厚さは約 0.1μm と非常に薄いために， 1 個のミトコンドリアを約 6 枚に 薄切できることになり，このことは，抗体がミトコンド リア内抗原と反応する際， ミトコンドリアの内膜と外膜 による障壁がまったくなく，自由に抗原抗体反応が可能 であることを意味している.したがって， p r 巴 ‑emb 巴 d d i n g 法においてアドレノドキシン陰性のミトコンドリアは，

本来陰性なのではなく，抗体がそのミトコンドリア内に 到達できなかったことに起因して，見かけ上，陰性とな るのではなし、かと考えられる.この仮説を検証するため に ， p r e ‑ e m b e d d i n g 法において，抗原抗体反応をおこな った

リオスタッ卜切片 (20μm) に垂直に超薄切片を作 成し，抗体の切片内部への浸透度を調べてみると，グリ

オスタット切片表面に接したミトコンドリアは切片内部 のミトコンドリアに比べて，約

倍の高頻度でアドレノ

ドキシンに対して反応陽性であることが明らかになった ( F i g . 9 b ) .  

M i t a n i ら 8 ) 9

は ， p r 巴 ‑ e m b e d d i n g 法を用いて，他のミ トコンドリア内 P ‑ 4 5 0 関連酵素である P‑450(SCC 戸 ， P

‑ 4 5 0 ( 1 1 β ) 9 ) およびアドレノドキシンリダクターゼ 8 ) に 関しても， ウシ副腎皮質ミトコンドリアは，これら酵素 を大量に含むものからまったく含まないものまで不均一 性に富んでし、ると報告している.一方， Geuze ら

は non

embedding 法を用いて，ブタ副腎皮質において P‑

4 5 0  (SCC) と P ‑ 4 5 0 ( 1 1 β 〉がすべてのミトコンドリアに 存在していると報告した.著者は， p o s t ‑ e m b e d d i n g 法と non‑embedding 法の両法において，ゥ、ン副腎皮質実質細 胞のすべてのミトコンドリアが， P‑450(SCC) ，  P ‑ 4 5 0 ( 1 1   β〉およびアドレノドキシンリダクターゼに対して反応 陽性であると L 、う所見を得ている〔未発表データ).これ らの結果を見てみると，同一細胞内ミトコンドリア聞に お け る P‑450 関 連 酵 素 含 有 量 の 不 均 一 性 は ， p r e ‑

巴 mbedding 法においてのみ認められ，他の方法 ( p o s t ‑ embedding 法や non‑embedding 法〉では認められない

ことがわかる.また p r e ‑ e m b e d d i n g 法においても，クリ オスタット切片表面の，切削によりミトコンドリア内，

外両膜が破壊されたミトコンドリアは，切片内部のミト

コンドリアより高頻度で染まっている ( F i g . 9 b ) . これら

の事実から，この不均一性は， p r eembedding 法におい

て抗体のミトコンドリア中への浸透の不均一性に起因す

るのではないかと考えられる.すなわち， p r e

embedding 法においては，抗原抗体反応を行う前に，切削，凍結，

融解，風乾等の物理的破壊，固定，その他のなんらかの 原因で， ミトコンドリア内，外両膜に抗体(I gG 目 約 8 n m ' ) ) が浸透可能な程度に破壊，亀裂が生じたミトコン

ドリアだけが，アドレノドキシン，および他の P ‑ 4 5 0 関 連酵素に対して反応陽性となるのではないかと考えられ た

ミ卜コンドリア内局在部位

本研究において，アドレノドキシンの局在部伎が，

トコンドリア内のマトリッグスとミトコンドリア内膜で あることが示された ( F i g ム 4 ふl l a ) . この成績は，生化学 的な細胞分画法による結果

と一致している.過去の報 告によると， M i t a n i ら

は ， p r e . e m b e d d i n g 法により束 状帯と網状帯を調べて，アドレノドキシンはミトコ

ド

リア内膜にのみ存在していると報告している.しかし，

束状帯，網状帯のミトコンドリアはクリステが豊富であ り，マトリックスの領域は非常に狭い.また， DAB 反応 産物は障害物が無いと直径約 50nm にもなる粒状を呈 する ( F i g . l 2 b ) . この大きな DAB 反応産物が成長する 際 ， ミトコンドリアのクリステの障壁によってクリステ 外面に蓄積したために，クリステに沿ってより濃い反応 産物として観察されるのではないかと考えられる.著者 は，マトリッグスの領域が束・網状帯よりも広い球状帯 ミトコンドリアにおいて，アドレノドキシンのマトリッ グスにおける局在を確認した ( F i g .4).また束・網状帯に おいても，まれに認められるミトコンドリア内のマトリ

ッグスの比較的広い部分において，アドレノドキシンの マトリックスにおける局在を観察した ( F i g . 2 ) . 以上の局 在観察の結果，および他の生化学的データ

からすると，

アドレノドキシンは通常状態においてはマトリックスに 存在しているが， ミトコンドリア内膜酵素である P ‑ 4 5 0

(SCC) あるいは P ‑ 4 5 0 ( 1 l β 〉と相互作用する際に， ミト コンドリア内膜表面に接触しているものと考えられる.

アドレノドキシンの局在を示す金粒子は，丸く電子密 度の高いミトコンドリア内穎粒上にも認められた ( F i g . 3 ， 4 ， l l b ) . その特異性は，精製アドレノドキシンを用いた 吸収実験によって確かめられた ( F i g . 7).このミトコンド リア内穎粒は， Kai ら叫が，ウシ副腎皮質球状帯に大量 に存在するものとして報告しているが，著者は，球状帯 のみでなく束状帯外層部においても，球状帯に比べて頻 度が少ないが，多量に存在することを観察した.このミ

トコンドリア内頼粒は，その外観が脂肪滴に似ているこ とから，脂質性のものであろうことが推察されていたが，

Kai ら

は，タンパク質分解酵素を作用させることによ

り消失すること，およびアミドブラックにより染色され ることから，タンパク質を含むことを報告した.しかし，

その分子的実態は cytochromec  o x i d a s e 活性を持たな い

こと以外には不明のままであった.今回，著者がこ のミトコンドリア内穎粒がアドレノドキシンを含むこと を示したことにより，この構造物が，ステロイド水酸化 反応の新たな場である可能性が考えられる.この仮説を 検証するためには，生化学的には細胞分画法により単離 したこのミトコンドリア内頼粒

におけるステロイド 水酸化活性を測定すること，または細胞化学的アプロー チとしては，ステロイド水酸化に必要な他の構成要素，

すなわちアドレノドキシンリダクターゼ， P‑450(SCC) ，  P ‑ 4 5 0 ( 1 1β) ，更に可能であれば NADPH の存在を，免 疫電子顕微鏡法により，もしくは酵素細胞化学的に調べ ることが必要であろう.このミトコンドリア内頼粒は，

副腎皮質内で層によって異なった分布をしており，副腎 皮質は各層において異なるステロイドホノレモンを産生す ることが知られている

ことと考え合わせれば，ある種 のステロイド(例えばアノレドステロン〉のみを合成する場 所であることも推測可能である.

各層におけるミトコンドリア内局在密度

著者は，本研究においてアドレノドキシンのミトコン ドリア内局在密度が，副腎皮質各層において具なってい ることを観察し，更にミトコンドリア単位断面積当りの 標識された金粒子数を数えることにより，東状帯ミトコ ンドリアは球状帯ミトコンドリアに比べて， 2‑3 倍高密 度でアドレノドキシンを含有していることを見つけた ( F i g . 6 ) . 一方，束状帯ミトコンドリアと網状帯ミトコン ドリアのアドレノドキシン含有密度はほぼ同程度であっ た ( F i g ム 5 ) . 球状帯と束・網状帯のミトコンドリアの形 態には，はっきりとした違いが認められ，球状帯ミトコ ンドリアは楕円形で，クリステは層板状ないし小管状で あるが，東・網状帯ミトコンドリアはほぼ球形で，クリ ステは小胞状ないし小管状である

ミトコンドリア 内膜(グリステ〉の量は，束・網状帯ミトコンドリアにお いて球状帯ミトコンドリアよりも多く，今回示された 束・網状帯ミトコンドリアは球状帯ミトコンドリアより アドレノドキシンの含有密度が高いという結果からする と ， ミトコンドリア内膜の量は，ステロイド水酸化酵素 の量に対応しているのかもしれない.光学顕微鏡レベノレ では，ウシ副腎皮質

( F i g . l)およびラット副腎皮質問に おいて，球状帯は束・網状帯に比べてより弱くアドレノ ドキシンに対して染色される. この層による染色強度の 違いの原因として，1)細胞内ミトコンドリア量の違いと，

2)

ミトコンドリア内アドレノドキシン存在密度の違いの

2 つが考えられるが，今回， 2 ) のミトコンドリア内アドレ ノドキシ

存在密度の違いが証明された.

種々の免疫電子顕微鏡 i 去の比較

著者は， ミトコンドリア内酵素であるアドレノドキシ ンの局在様式を知るために，現在大きく分けて 3 種存在 する免疫電子顕微鏡法の 3 穫とも試みることになったの で，それらの特徴，長所，短所を，著者の考えを交えて 比較してみると以下のようになる.

1 .   試科の観察可能面積: p r e ‑ e m b e d d i n g 法は，まず 光学顕微鏡用切片〔クリオスタット切片，ヴィブラトーム 切片〉において免疫反応をおこなうために，観察可能面積 が最も広く， 30mm

程度，場合によっては 100mm

でも 可能である . p o s t . e m b e d d i n g 法においては約 1mm

ま でであるが，光学顕微鏡レベノレで、の銀増感法 C F i g . 1)と組 み合わせると， 10mm

程度まで観察可能である . n o n .   embedding 法においては，最も観察可能面積が狭く，約 0.3mm

程度まで観察可能である.

2 .   検出感度:凍結切片を用いる p r e

embedding 法 ， non 司 巴 mbedding 法の方が，樹脂包埋切片を用いる p o s t ‑ embedding 法より感度が高い.これは，1)アルコール脱 水，樹脂包埋の過程が抗原性を減少させていること，お よび，

凍結切片においては切片内部の抗原もある程度 反応可能であることによると考えられる.同じ p r o t e i n A‑gold 法で凍結超薄切片 Cnon‑embedding 法〉と Lowi‑

c r y l  K4M ‑ J t I J 片 ( p o s t ‑ e m b e d d i n g 法〉におけるアドレノ ドキシンの検出感度を比べると，凍結超薄切片の方が約 1 . 5 倍弱，標識金粒子数が多かった.

3 .   解像度 p r o t e i n  A  ‑ g o l d 法の場合， IgG を 8nm ， p r o t e i n  A を 5nm ，金粒子を 5nm とすると，抗原から 最大 18nm 以内の解像度をもっ

これは，ベノレオキシダ ーゼを用いた DAB 反応産物が，障壁が無い場合，約 5 0 nm である ( F i g . 1 2 b ) のに比べて，より解像度が高い.小

さな金粒子を用いると，大きな金粒子を用いる時よりも 解像度は高くなると共に，標識密度も高くなる長所があ るが，電子顕微鏡下で高倍率にしないと確認できなくな る欠点がある.

4 . 定 量 化 : p o s t ‑ 巴 mbedding 法 あ る い は non‑

embedding 法において，検出に金粒子を用いると，単位 断面積〔 μm

当り，あるいは単位膜長 (μm) 当りの金粒 子数として定量化が可能である.この場合，全く切片内 部へは浸透せず切片表面における抗原のみを検出する p o s t ‑ e m b e d d i n g 法の方が，切片内部へ少しではあるが 浸透し，切片内部の抗原をも検出する non‑embedding 法よりも正確であると考えられる.

5 .   固定: 1‑4% paraformaldehyde に ， g l u t a r a l d e ‑

hyde を含まない固定液と，種々の濃度 ( 0 . 0 5 % ， 0 . 1 % ，   O .  

5% ，  1% ，  1 . 5% ，  2%) で含む固定液を検討したが， p o s t ‑ embedding 法と non

embedding 法では，アドレノドキ シン標識密度に顕著な差は認められなかった.一方 p r e

embedding 法では，わずか 0 . 0 5 % の g l u t a r a l d e h y d e で も著しい反応の減退が認められた.このことから，

g l u t a r a l d e h y d e によってアドレノドキシンの抗原性そ のものは低下しないが，二価のアノレデヒドである g l u t a r ‑ a l b e h y d e によって細胞内分子が架橋され，抗体の切片 (ミトコンドリア〉中への浸透が著しく阻害されるため に ， p r 巴 田 emb 巴 d d i n g 法において反応の消失が認められた と考えられた. p o s t ‑ e m b e d d i n g 法と non.embedding 法 では，切削により切片表面に抗原が露出されるため，反 応の減退は認められなかったと考えられる.

6  抗 体 の 浸 透 性 : post‑embedding 法 と non‑

embedding 法では，切片〔厚さ約 0.1μm) の表面だけ抗 原抗体反応可能であればよいため， ミトコンドリアを含 めすべての細胞内小器官において抗体の浸透性の問題は 無いが， p r e ‑ e m b e d d i n g 法の場合は，切片〔厚さ 6‑20 μm) の内部へ抗体が浸透することが要求されるため，抗 体が単位膜(脂質二重層〉を通過する際，おそらくどこか 膜の破れた(亀裂の入った〉部分から進入せざるを得ない ために， ミトコンドリアのように二重の単位膜に閉まれ た細胞内小器官は，その局在観察が最も困難なものとな る

7 .   p r o t e i n   A  ‑ g o l d の浸透性:小さな金粒子 (3‑5 nm) で、あっても， p r o t e i n  A  ‑ g o l d の組織への浸透性は，

抗体(I gG) ，ベノレオキシダーゼ、標識 IgG ， FITC 標識 IgG 等に比べて極めて低い.こ〆のことは，光学顕微鏡用標本

〔凍結切片，ヴィフラトーム切片〉において p r o t e i n A  g o l d 法の後，銀増感をおこなってみると，切片表面しか 反応していないこと，および凍結割断面(凍結超薄切片を 作成した後のプロック〉を用いて p r o t e i nA  ‑ g o l d 法でア ドレノドキシンを検出した際，切削表面にしか金粒子が 検出されなかったことからもわかる〔未発表データ).

p r o t e i n  A( 分子量 4 2 ， 0 0 0 ) の大きさは最大で 5nm と推 定されへ金粒子を 3‑5nm とすると， p r o t e i n  A  ‑ g o l d の 大きさは 8‑10nm となり，抗体(I gG: 分子量 1 5 0 ， 0 0 0 ) の大きさ(約 8nm

とあまり違わないので，抗体(I gG) はタンパク質であり分子の形態が可塑的であることが，

組織内への浸透性を高めていると思われる.金粒子はそ の性質上，剛性が高く硬い粒子であることが組織内への 浸透性を低くしていると思われる.この金粒子の浸透性 の悪さは，最近 1nm の金粒子が利用可能となっており，

これによって克服されるかもしれない.

結 論

光学および電子顕微鏡レベルでの種々の免疫組織細胞 化学的手法を用いて，ウシ副腎皮質におけるアドレノド キシンの局在および分布を検討したところ以下の結果が 得られた.

1 )   免疫組

織化学的には，球状帯，束状帯，網状帯の 実質細胞細胞質にアドレノドキシン陽性反応が認めら れ，球状帯細胞質における反応は，束状帯，網状帯に比 べてより弱かった.

2 )   ミトコンドリア聞の染色性:① p o s t ‑ e m b e d d i n g 法により，実質細胞のすべてのミトコンドリアがアドレ

ノドキシンを含んでおり，その含有密度はミトコンドリ ア 間 で 統 計 的 に 均 ー で あ っ た . ② n o n ‑ e m b e d d i n g 法

C i m m u n o ‑ c r y o u l t r a m i c r o t o m y ) においても実質細胞の すべてのミトコンドリアがアドレノドキシンを含んでお り，その含有密度は同一細胞内ミトコンドリア間で均ー であった.③ p r e

embedding 法においては，同一細胞内 ミトコンドリア闘で濃く染色されるものからまったく染 色きれないものまで，アドレノドキシンに対する染色強 度が不均一性に富んでいた.しかし ! l リオスタット切 片の切片表面に接したミトコンドリアは切片内部のミト

コンドリアに比べて約 2 倍，染まるミトコンドリアの割 合が高く，このミトコンドリア聞の不均一性は， p r e ‑ embedding 法における抗体の浸透の不良に起因するこ

とが明らかになった.これらの結果は，同一細胞内ミト コンドリア間で P ‑ 4 5 0 関連酵素の含有量は均一である ことを支持していた.

3) 

ミトコンドリア内局在部位・アドレノドキシンは 副腎皮質実質細胞ミトコンドリアのマトリックスおよび ミトコンドリア内膜に局在していた.また，球状帯，束 状帯の外層部のミトコンドリア内に頻繁に認められる丸 く一様に電子密度の高い穎粒中にも，アドレノドキシン は局在していた.

4) 

各層におけるミトコンドリア内局在密度:ミトコ ンドリア単位断面積当りのアドレノドキシンの含有密度 は球状帯において，束・網状帯よりも低く，定量免疫電 子顕微鏡法によると，球状帯ミトコンドリアにおいて束 状帯ミトコンドリアの 2‑3 分の l であった.

本研究の要旨は，第 9 2 回日本解剖学会総会 0987 年 4 月〉および第 4 4 回日本電子顕微鏡学会学術講演会 0988 年 6 月〉において発表した.

本研究は，文部省科学研究費補助金・重点領域研究・チ トクローム P ‑ 4 5 0 の分子生物学 ( n o . 6 3 6 3 5 5 0 5 ， n O . 0 1 6 3 5 5  

0 9 ) によって補助を受けた.

謝 辞

稿を終えるにあたり，終始，御懇篤なる御指導，御校 闘を賜わりました高楠彰教授に深謝を捧げると共に，御 校閲，御助言を賜わりました生化学教室神谷知調教授，

第 2 解剖学教室山本浩司教授に深謝致します.またアド レノドキシン抗血清および精製アドレノドキシンを御供 与くださった九州大学大村恒雄教授，相良康弘博士に深 謝致します.

文 献

1 )   S a t o ，  R .   and  Omura ，  T . :   Cytochrome  P ‑ 4 5 0   Kodansha ，  Tokyo ，  1 9 7 8 .  

2 )   Omura ，  T . ，  S a n d e r s ，  E

E s t r a b r o o k ， R.W. ，  Cooper ，  D.Y. and R o s e n t h a l ，  O . ・ I s o l a t i o nfrom  a d r e n a l  c o r t e x  o f   a  nonheme i r o n  p r o t e i n   and  f l a v o p r o t e i n   f u n c t i o n a l   a s   a r e d u c e d   t r i p h o s ‑ p h o p y r i d i n e   n u c l e o t i d e ‑ c y t o c h r o m e   P  ‑4 5 0   r e d u c t a s e .   A r c h .   B i o c h e m .   B i o p h y s .  1 1 7 :   6 6 0 ，  1 9 6 6 .  

3 )   Nabi ，  N. and Omura ，  T . :  I n   v i t r o  s y n t h e s i s  o f   a d r 巴 n o d o x i nand a d r e n o d o x i n  r e d u c t a s e :  E x i s

t e n c e   o f   a p u t a t i v e   l a r g e   p r e c u r s o r   form  o f   a d r e d o d o x i n .  B i o c h 巴 m.B i o p h y s .   R e s .  Commun  9 7 :  6 8 0 ，  1 9 8 0 .  

4)

渡辺慶一，中根一穂，編.酵素抗体法.学際企画，

東京， p 1 3 7 ‑ 1 6 7 ，  1 9 8 5 .  

5 )   Roth ，  J . :   The p r o t e i n  A  ‑ g o l d  ( p A g )  t e c h n i q u e   A  q u a l i t i v e   and  q u a n t i t a t i v e   a p p r o a c h   f o r   a n t i g 巴 n l o c a l i z a t i o n   on t h i n   s e c t i o n .   i n   T e c h ‑ n i q u e s  i n   i m m u n o c y t o c h e m i s t r y   ( B u l l o c k ，  G.R  andP 巴 t r u s z ， P . ， 巴 d s . ) .v o l 1 ，  Acad 巴 micP r e s s ，  N  ew  Y  o r k ，  p 1 0 8 ‑ 1 3 3 ，  1 9 8 2 .  

6 )   Roth ，  J . ，  Bendayan ，  M. and O r c i ，  L . :  Ul t r a s ‑ t r u c t u a l  l o c a l i z a t i o n  o f  i n t r a c e l l u l a r  a n t i g 巴 n sby  t h e  u s e  o f  p r o t e i n  A  ‑ g o l d  c o m p l e x .     ， J H i s t o c h e m .   C y t o c h e m .  2 6 :  1 0 7 4 ， 1 9 7 8 .  

7 )   Tokuyasu ，  K . T . :  I m m u n o ‑ c r y o u l t r a m i c r o t o m y .   i n   I m m u n o l a b e l i n g   f o r 巴 l e c t r o n m i c r o s c o p y   (Poak ，  ，M. and V J a r n d e l l ，  I . M. ，  e d s . ) .   E l s e v i e r ，  Amsterdam ，  p 7 1 ‑ 8 2 ，  1 9 8 4 .  

8 )   M i t a n i ，  F . ，  I s h i m u r a ，  Y . ，  I z u m i ，  S .   and 

Watanabe ，  K . :   I m m u n o h i s t o c h e m i c a l   l o c a l i z a

t i o n  o f  a d r e n o d o x i n  and a d r e n o d o x i n  r e d u c t a s e  

i n   b o v i n e  a d r e n a l  c o r t e x .  Acta E n d o c r i n o .   l 9 0 ・

3 1 7 ，  1 9 7 9  

9 )   M i t a n i ，  F . ，  Shimizu ，  T . ，  Ueno ，  R . ，  I s h i m u r a ，  Y . ，  I z u m i ，  S . ，  Komatsu ，  N.  and  Watanabe ，  K . :   Cytochrome  P ‑ 4 5 0

and  P ‑ 4 5 0

i n   a d r 巴 n a l c o r t e x :  Z o n a l   d i s t r i b u t i o n   and  i n t r a m i t o c h o n .   d r i a l  l o c a l i z a t i o n  by t h e  h o r s e r a d i s h  p e r o x i d a s e .   l a b e l e d   a n t i b o d y   m e t h o d .   J .   H i s t o c h e m .   C y t o .   c h e m .  3 0 :  1 0 6 6 ，  1 9 8 2 .  

1 0 )   M i t a n i ，  F . ，  I i z 叫 r a ， T . ，  Ueno ，  R . ，  I s h i m u r a ，  Y. ，  Kimura ，  T . ，  I z u m i ，  S . ，  Komat 自 u ， N.  and  Watanabe ，  K .  :  R e g u l a t i o n  o f  cytochrome P ‑ 4 5 0   a c t i v i t i e s   i n   a d r e n o c o r t i c a l   m i t o c h o n d r i a   from  normal r a t s  and human n e o p l a s t i c  t i s s u e s .  A d v .   Enzyme Regu l .   2 0 :  2 1 3 ，  1 9 8 2  

1 1 )   I s h i m u r a ， K . ，   Y  o s h i n a g a ，  T . ，  Fu j i t a ，  H. ，  Sugano ，  S . ，  Okamoto ，  M.  and  Yamano ，  T . :   L i g h t   and  e l e c t r o n   m i c r o s c o p i c   immunocyto‑

c h e m i s t r y  on t h e  l o c a l i z a t i o n  o f  cytochrome P‑

4 5 0   o f   t h e  s i d e   c h a i n   c l e a v a g e   s y s t e m   and o f   c y t o c h r o m e   P ‑ 4 5 0   o f   1 1 β ‑ h y d r o x y l a s e   i n   t h e   b o v i n e  a d r e n a l  c o r t i c a l  c e l l s .   A r c h .  H i s t o l

] p n . 4 8 :  5 4 1 ，  1 9 8 5 .  

1 2 )   B e e s l e y ，  J  . E . :   Recent  advances  o f   m i ‑ c r o b i o l o g i c a l   immunocytochemistry.  i n   1m

m u n o l a b e l l i n g  f o r  e l e c t r o n  m i c r o s c o p y C P o l a k ，  J .   M. and V a r n d e l l ，  I . M. ，  e d s . ) .   E l s e v i e r ，  A m s t e r ‑ dam ，  p 2 8 9 ‑ 3 0 3 ，  1 9 8 4 .  

1 3 )   Hatano ，  0 . ，  Karasawa ，  R . ，  Matsumoto ，  H. 

Tohno ，  S . ，  Tohno ，  Y .  and T a k a k u s u ;  A . ・ A p p l i ‑ c a t i o n   o f   p o s t ‑ e m b e d d i n g   immunostaining  method t o  e l e c t r o n  m i c r o s c o p i c  d e m o n s t r a t i o n  o f   p h e n o b a b i t a l ‑ i n d u c i b l e   cytochrome  P  ‑4 5 0   i n   g u i n e a  p i g  l i v e r .   J .   N  a r a  Med. A s s .  3 6 :  6 8 7 ，  1 9 8 5 .   1 4 )   Suhara ，  K . ，   Takemori ，  S .   and  K a t a g i r i ，  K . :   Improved p u r i f i c a t i o n   o f   b o v i n e   a d r e n a l   i r o n ‑ s u l f u r  p r o t 巴 i n .B i o c h 巴 m.B i o p h y s .  Acta 2 6 3 ・ 2 7 2 ， 1 9 7 2 .  

1 5 )   Oha

h i ， M. and  Omura ，  T . :  P r e s e n c e   o f   t h 巴

NADPH‑cytochrome P ‑ 4 5 0  r e d u c t a s e  s y s t e m  i n   l i v e r   and k i d n y  m i t o c h o n d r i a .   J .   B i o c h e m .  8 3 :   2 4 9 ，  1 9 7 8 .  

1 6 )   S l o t ，  J.W. and Geuze ，  H . J . :  A new method o f   p r e p a r i n g  g o l d  p r o b e s  f o r  m u t i p l e ‑ l a b e l i n g  c y t o

c h e m i s t r y .  Eu r .   J .   C e l l  B i o l .   3 8 :  8 7 ，  1 9 8 5

1 7 )   Geuze ，  H . J . ，  S l o t ，  J.W. ，  Y a n a g i b a s h i ，  K . ，  McCracken ，  J . A . ，  Schwartz ，  A . L .  a n d  Ha   ， ! l P .   F .  :  Immunogold c y t o c h 巴 m i s t r yo f   c y t o c h r o m e s   P ‑ 4 5 0  i n   p o r c i n e  a d r e n a l  c o r t e x .  Two enzymes  C s i d e ‑ c h a i n   c l e a v a g e   and 1 1   b e t a ‑ h y d r o x y l a s e )   a r e  c o

l o c a l i z e di n  t h e  same m i t o c h o n d r i a .  H i s t o ‑ c h e m i s t r y  8 6 :   5 5 1 ，  1 9 8 7  

1 8 )   Kai ，  0 . ，  F u j i o k a ，  T .  and Yasuda ，  M.: I n t r a m i t o ‑ c h o n d r i a l  b o d i 巴 si n   b o v i n e  a d r e n o c o r t i c a l  c e l l s   C e l l  T i s s u e  R e s .   1 8 5 :  6 9 ，  1 9 7 7 .  

1 9 )   Kai ，  0 . ，  F u j i o k a ，  T .  and Yasuda ，  M. 目Li g h tand  e l e c t r o n   m i c r o s c o p i c   s t u d i e s   o f   i n t r a m i t o c h o n ‑ d r i a l   b o b i e s   i n   b o v i n e   a d r e n o c o r t i c a l   c e l l s   by  p r o t e o l y t i c   d i g 巴 s t i o n . H i s t o c h e m i s t r y  5 6 :   2 1 7   2 2 1 ，  1 9 7 8 .  

2 0 )   Kai ，  T . ，  Fu j i o k a ，  T .  and Yasuda ，  M.: I s o l a t i o n   o f  i n t r a m i t o c h o n d r i a l  b o d i e s  i n  b o v i n e  a d r e n o c o r ‑ t i c a l   c 巴 I I sby  d e n s i t y   g r a d i e n t   c 巴 n t r i f u g a t i o n . Hi s t o c h e m i s t r y  5 9 :  3 0 5 ，  1 9 7 9 .  

2 1 )   Nussdorfer ，  G . G . :  C y t o p h y s i o l o g y   o f   t h e   a d r e n a l  c o r t e x .  I n t .   R e v .  C y t o l .   9 8 :   1 ‑ 3 9 4 ，  1 9 8 6 .   2 2 )   F u j i t a ，  H. :  A d r e n a l  c o r t 巴 x . i n   F u n c t i o n a l  mor

p h o l o g y  o f  e n d o c r i n e  g l a n d s C K u r o s u m i ，  K .   and  F u j i t a ，  H . ，  e d s . ) .   I g a k u ‑ S h o i n ，  Tokyo ，  p 2 9 9 ‑ 3 4 2 ，  1 9 7 4 .  

2 3 )   Baron ，  J . ，  Redick ，  J . A . ，  Kapke ，  G . F .  and Van 

Orden ，  L . I I I :   Immunocytochemical l o c a l i z a t i o n  

o f  a d r e n a l  f e r r e d o x i n  and d i s t r i b u t i o n  o f  a d r e n a l  

f 巴 r r e d o x i n and  c y t o c h r o m e   P ‑ 4 5 0   i n   t h e   r a t  

a d r e n a l .   B i o c h e m .  B i o p h y s .  Acta 5 4 0 :  4 4 3 ;  1 9 7 8 .  

E x p l a n a t i o n s  o f  f i g u r e s .  

F i g .  1 .   L i g h t ‑ m i c r o s c o p i c   i m m u n o c y t o c h e m i s t r y   o f   a d r e n o d o x i n   i n   b o v i n e   a d r e n a l   c o r t e x .   S e m i t h i n  s e c t i o n s  o f  L o w i c r y l  K4M‑embedded s p e c i m e n s  were s t a i n e d  f o r  a d r e n o d o x i n   u s i n g  p r o t e i n  A  ‑ g o l d  t e c h n i q u e  f o l l o w e d  by s i l v 巴 re n h a n c 巴 ment

a ， b .   The p a r e n c h y m a l  c e l l s   i n   z o n a  g l o m e r u l o s a ( G ) ，  z o n a  f a s c i c u l a t a ( F ) ，  and z o n a   r 巴 t i c u l a r i s ( R )a r e  s t a i n e d  f o r  a d r e n o d o x i n .  The c a p s u l e s ( C )  o f  t h e  g l a n d s  and t h e  c e l l s   o f  t h e  medulla(M) a r e  u n s t a i n e d .  x 4 0 .  Bar

0.2mm.

c .   A  h i g h e r  m a g n i f i c a t i o n  o f  F i g . 1 a .  The c y t o p l a s m  o f  t h e  p a r e n c h y m a l  c e l l s  i s  s t a i n e d  f o r   a d r e n o d o x i n .  Non‑parenchymal c e l l s  a r e  n o t  s t a i n e d .  x 1 5 0 .  Bar=O.l m m  

F i g . 2 ‑ 5  a n d  7 .   E l e c t r o n ‑ m i c r o s c o p i c a l l o c a l i z a t i o n  o f  a d r e n o d o x i n  i n  b o v i n e  a d r e n a l  c o r t e x  by  t h e  p o s t ‑ 巴 mbeddingmethod i n  c o m b i n a t i o n  w i t h  t h e  p r o t 巴 i nA‑gold t 巴 c h n i q u e . F i g . 2

Par 巴 nchymalc e l l s   o f   t h e   z o n a   f a s c i c u ! a t a .   A l I   t h 巴 m i t o t o c h o n d r i a a r e   l a b e l e d   f o r  

a d r e n o d o x i n .  I n  t h e  m i t o c h o n d r i a ，  m a t r i x  ( a r r o w h e a d )  and i n n e r  m i t o c h o n d r i a l  mem‑

b r a n e  a r 巴 l a b e l d .x 4 8 0 0 0 .  Bar=200 nm 

F i g . 3 a  ‑ c .  Parenchymal c 巴 l I so f  t h e  zona f a s c i c u l a t a .  Round and e l e c t r o n ‑ d e n s e  i n t r a m i t o c h o n ‑ d r i a l  b o d i e s   ( a r r o w s )  a r e  l a b e l e d  f o r  a d r e n o d o x i n .  N u c l e i ( N ) ，  L i p i d  d r o p l e t ( L ) ，   a n d   r o u g h  e n d o p l a s m i c  r e t i c u l u m  a r e  n o t  l a b 巴 l e d .x 4 8 0 0 0 .  Bar=200 nm. 

F i g . 4 a ム Par 巴 nchymalc e l l s  o f  t h e  zona g l o m e r u l o s a .  Th 巴 m a t r i xo f  t h e  m i t o c h o n d r i a  ( a r r o w ‑ h e a d s ) ，  i n n e r  m i t o c h o n d r i a l  membrane ，  and e l e c t r o n ‑ d e n s e  i n t r a m i t o c h o n d r i a l  b o d i e s   ( a r r o w s )  a r e  l a b e l e d  f o r  a d r e n o d o x i n .  N u c l e i ( N )  

a .   x 3 6 0 0 0 .  Bar ニ 2 0 0nm. b .   x 4 8 0 0 0 .  Bar=200 nm 

F i g .  5 .   Parenchymal  c e l l s   o f   t h e   z o n a   r e t i c u l a r i s .   A l l   t h e   m i t o c h o n d r i a   a r e   l a b 巴 l e d f o r   a d r e n o d o x i n .   I n   t h e   m i t o c h o n d r i a ，  m a t r i x   and  i n n 巴 rm i t o c h o n d r i a l   membrane a r e   l a b e l e d .  N u c l e i ( N ) .  x 4 8 0 0 0 .  Bar=200nm 

F i g .  6 .   Histogram o f  d e n s i t i e s  (μmり o fg o l d  p a r t i c l e s  on e a c h  m i t o c h o n d r i o n  o f  p a r e n c h y m a l   c e l l s  i n  t h e  z o n a  f a s c i c u l a t a  and t h e  z o n a  g l o m e r u l o s a .  Mean : t S . D .  o f  d e n s i t i e s :  z o n a   f a s c i c u l a t a ，  4 2 2 . 8 : t 5 9 . 3   (N=10); z o n a  g l o m e r u l o s a ，  1 7 3 . 5 士 4 2 . 8 ( N

1 2 ) .P<O.OO 1 .   G o l d   p a r t i c l e s  a r e  homogenously d i s t r i b u t e d  among t h e  m i t o c h o n d r i a  i n  e a c h  z o n e .  D e n s i t y  o f   g o l d  p a r t i c l e s  on t h e  m i t o c h o n d r i a  i n  t h e  z o n a  f a s c i c l a t a  i s  two t o  t h r e e  f o l d  h i g h e r  t h a n   t h a t  i n  t h e  zona g l o m e r u l o s a .  

F i g . 7 a ム C y t o c h e m i c a lc o n t r o .   l Parenchymal c e l l s   o f  t h 巴 z o n af a s c i c u l a t a  w 巴 r et r e a t e d  w i t h  

p r e ‑ a d s o r b e d  a n t i ‑ a d r e n o d o x i n  serum f o l l o w e d  by p r o t 巴 i nA  ‑ g o l d .  G o l d  p a r t i c l e s  a r e  n o t  

s e e n  on t h e  t y p i c a l  m i t o  

a .  S t a i n e d  and u n s t a i n e d  m i t o c h o n d r i a  a r e  i n t e r m i n g l e d  w i t h i n  a  s i n g l e  p a r e n c h y m a l  c e l l .   x 1 8 0 0 0 .  Bar=500 nm. 

b .  T r a n s v e r s e  u l t r a t h i n  s e c t i o n s  wer 巴 p r e p a r e dfrom c r y o s t a t  s e c t i o n s .  The a r r o w s  show  t h e  m i t o c h o n d r i a  i n  c o n t a c t  w i t h  t h e  s u r f a c 巴 o ft h e  c r y o s t a t  s e c t i o n .  x l 0 8 0 0 .  Bar=lμm. 

F i g . 1 0 ， l 1 .   Parenchymal c e l l s   o f   t h ^巴 z o n a f a s c i c u l a t a   s t a i n e d   f o r   a d r e n o d o x i n  by immuno. 

c r y o u l t r a m i c r o t o m y  i n  c o m b i n a t i o n  w i t h  t h 巴 p r o t e i nA  ‑ g o l d  t e c h n i q u e .  

F i g .  1 0 .   a .   A l l  o f  t h 巴 m i t o c h o n d r i aa r e  s t a i n e d .  The smooth e n d o p l a s m i c  r e t i c u l u m  i s  u n s t a i n e d .   x 2 7 0 0 0 .  Bar=300 nm. 

b .   The G o l g i  a p p a r a t u s  C a r r o w h e a d s )  a r e  u n s t a i n e d .  x 3 6 0 0 0 .  Bar=300 nm. 

F i g .  1 1 .   a .   The m a t r i x  and t h 巴 i n n 巴 rm i t o c h o n d r i a l  membrane a r e  l a b e l e d  w i t h  g o l d  p a r t i c 1 e s

x 5 4 0 0 0 .  Bar=200 nm. 

b .   l n t a m i t o c h o n d r i a l  b o d i e s  a r e  l a b e l e d .  x 4 8 0 0 0 .  Bar=200 nm. 

F i g

1 2

Parenchymal c e l l s   o f   t h e   zona  f a s c i c u l a t a   s t a i n e d   f o r   a d r e n o d o x i n   by  immuno. 

c r y o u l t r a m i c r o t o m y  i n  c o m b i n a t i o n  w i t h  p e r o x i d a s e . l a b e l e d   s t r e p t a v i d i n . b i o t i n  m e t h o d .   a .   A l l  o f  t h e  m i t o c h o n d r i a  a r e  s t a i n e d .  x 7 2 0 0 .  Bar= 1μm. 

b .   3 ， 3 ' ‑ d i a m i n o b e n z i d i n e  r e a c t i o n  p r o d u c t s  a r e  s e e n  a s  e l e c t r o n . d e n s e  p a r t i c 1 e s  w i t h  a 

mean d i a m e t e r  o f  5 0  nm. x 2 4 0 0 0 .  Bar =  5 0 0  nm 

慎抱

四 岨 溜 掴 閣

閣 官

Z 官

u o Z

聞

ω

日 誌 同

¥

問

︒ 同

U

刑 判

‑M

何 色 唱 } [

︒ 凶 刷

︒

﹄

@

﹄ 園 田

E

12 

Fig.6.  Histogram  o f   densities of gold  particles  on  each 皿 itochondrion i o   zona  glo

erulosa ( 闘 ) and  zona  fasciculata  ( 悶 )

11 

1 日

4  5 6 7  B 

Each  mitochondrion  2 

1 

日