酸濃度 及 す 影響 酪 酸 酸 酸 抗 作 用 脳内

E

l

に

ん

γ

^{ミ ノ}

^ラ

^ミ

酸 濃度

^に

^ぼ

金 沢 大学 医 学 部小児 科 学 教 室 ( 主 任^: 谷 口 局数 授)

村

( 昭和^{5 8}年3月2 5日受 付)

け^いれ ん系の E ト^マウ^スを使^{い, パ ル}プ^ロ酸 ( 以 下V P A と略) の抗け^いれ ん性機 序^を明ら かにす る 為, 脳 内γア ミ^ノ酪酸(以下G A B A と略), ア^{ス パ}ラギ^ン酸, グ^ルタ ミ^ン酸濃 度に及ぼ す効 果を評 価し た^. 対 照と し て, 脳 内G A B A 濃 度を増 加さ せ て抗けいれ ん作 用を な す^こと が知ら れ て^いる ア ミノオ キシ酢 酸

(以下A O A A と略)の効 果を評 価^{し た. バラン スを}崩す姿勢 刺 激, す な わ ち何回 か の, 1 5^〜2 0c m 空 中^に 放り 上 げ る^こと^によ り, 生後1 2^〜1 3適 齢のE トマ ウ^スは け^いれ ん を お^こす^. V P A 2 5 0 m g/kg ま た は A O A A 2 0 m g/kg を腹 腔 内 注射の後に,放り上 げ刺 激^に対す る反 応の評 価と脳 内G A B A,アス パラギン酸,

グ^)L,タミ ン酸を測 定し た. 小 脳を除^いた脳は液体 窒 素 中^で凍 結し,溶け る前^にすばや く と り出し た. G A B A

, ア^{ス パ}ラギ^ン酸, グ^ルタ ミ^ン酸の濃 度は酵 素 法^によって測った^. V P A(2 5 0m g/kg) の投 与は, E l^‑マ ウ スを放り上 げ刺 激^によ る けいれ ん か ら, 注 射 後1 5 分か ら 9 0分に わ た り阻止 し た. この期 間中, 脳 内アス パラ ギ^ン酸 濃度は 2JL mOl/g湿 重 量 以 下に減 少し て^いた. 対 照 的に, 脳 内G A B A 濃度は, V P A 注射 後1 5 分値で は変 化が な かった^. し^かし注射 後3 0分値で ピ^ー ク^{レ ベ ル に}増加した^. 3耳^{m O}l/g 湿重 量は越え な か

った. アス パラ ギン酸と G A B A の両^{レ ベ ル}は V P A 注射の 6 時 間以 内^に治 療前^{の レ ベ ル}約3^.3_J^L m Ol/_g と 2.2_〟m Ol/g 湿 重 量にも どった. しかし, V P A 投与は脳 内 グ^ルタ ミン酸濃 度^に有 意な変 化を おこさ な かっ

た^. 放り上 げに よ る け^いれ ん は, A O A A (2 0 m g/k_g) 注射 後9 0分か ら 6 時間に わ たり完全に阻止 さ れた.

その期 間 中, 脳 内G A B A 濃 度は 4_JL m Ol/g 湿 重量 以 上に増加し た. これ ら の結 果は E l^‑ マウスに お け る け^いれ ん阻止に必 要と思わ れ る脳 内 濃 度は, G A B A で は 4_JL mOl/g 湿 重 量 以 上, ア^{ス パ}ラギ^ン酸で は 2

〟^m Ol/g 湿 重量 以 下を 示 し て^いた. そ れ故, V P A 投 与^にお け る E l‑^{マ ウス}の け^いれ ん抑 制は, 脳 内G A B A 濃度の増加よ り も ア^{ス パ}ラ ギ^ン酸 濃 度 減 少によ り強く依 存し て^いる と考え た.

B _y w o rds E l m o u s e, Asp^{a r}tic a cid

, γ ^‑A min ob ut y^ric a cid, V al_pr oic a cid^.

バルブ^ロ酸( 以 下V P A と略) は, は じ め溶 剤と し て 使わ れ て^いた が, 1 9 6 3 年M e u nie r^l)らによ り抗けいれ ん作用 が発 見さ れ た. 現在 難 治 性の小発 作て ん か ん群 を は じ め と し て, 大 発 作, 純 粋 小発 作 等と広 範^に使わ れ, す ぐ れ た抗け^いれ ん作用 を 示 し て^いる^2ト6)

そ の抗けいれ ん作用 は抑 制 性 神 経 伝 達 物 質の γ^‑ア ミ ノ酪 酸( 以下G A B A と略) ^の脳 内 濃度 増 加 作用^によ る ものと考え ら れ て^いる⁷⁾. しかし, 治療 域で の使用量

では脳 内^{G A B A} 濃 度の増 加は充 分で な^いと^いう^. 近 年, 興 奮性 神経 伝 達 物 質の アス パラギ^ン酸^の脳 内 濃度

を減 少さ せ る作 用も報 告さ れ て^いる^8)9).

そこで, 著 者は V P A の抗け^いれ ん作 用の機 序を解 析す る為, 放り上 げ刺 激^によ り人 間^の大 発 作と よく 似 た発 作を^{お こ}すこと が知ら れ て^いる, E l‑ ^{マウス1 0)に}

V P A を腹 腔 内 注射^{し た. そ し て, その}脳 内G A B A, ア ス パラ ギ^ン酸, グ^ルタミ ン酸 漉 度の変 化を調^べた.

V P A の脳 内アス パラ ギ^ン酸 濃度 減 少 作用 が, そ の抗 け^いれ ん作 用と よ く相 関す る^こと を見 出し た.

材 料 と 方 法

E ffe cts of V al_pr oic A cid o n Seiz u r e T hr e sh olds a nd Br ain C o n c e ntr atio n s of _γ^‑A min o^‑

but y^ric A cid_, A sp^{a r}tic a cid a nd G luta m ic a cid in E l m o u s e^. Yuich i M u r ata

, Dep^{a r}t^‑ m e nt of Pediat^ric s,(^{D ir e cto r : Pr of. N . T a ni}g^{u c}h i)^{, Scho ol of M ed icin e, K} a n a z a w a Uni^‑

V e r Si_{t y}.

E l^‑マ ウスは, 1 9 5 4 年^に発 見さ れ, 1 9 5 9年に国 立予 防 衛 生 研究 所の今 泉によ り, 当初^ep^{‑ マ}ウスと し て報 告さ れ た特 殊 系マウスで あ る^{. 1}9 64 年^に国際 登 録^によ り E ト^マ ウスと命 名さ れ た. こ のマ ウ^スは外 観上,他の 健 常^{なヤウスと は}変ら な^いが, 生 後8 週以降 頃よ り,

平 衡感 覚を失わ せ る様な刺 激^によ り容 易^に痙 攣^が誘 発 さ れ る よ うにな る. しかも痙 撃によ り 死^{ぬ こ}と は な^い. 今回 の実験には, こ の E l^‑ マウスの F 7 8 ^〜 F 8 0 で, 週 齢1 2 ^〜1 3週^のも の を雌雄 関係な く使用 し た. 2 8 日齢 ま で は, そ の 匹数にか か わ らず 同 ^一 ケ^ー ジ内^に, 同^一 腹の仔と母 親と と も^に飼育し た. 2 9 日齢 以降は親^から 離し て, 雌 雄 別^々と し, 1 ケ ^ー ジ内に3 ^〜 5 匹の飼育 数と し た^. 飼 育 条 件は, 温 度2 3^±2⁰C, 湿 度6 8% , 人 工照 明 ( 明期^: 6 ^〜1 8時, 暗期^{: 1}8 ^〜 6 時) と し た^. 実験は 1 4 ^〜2 4時^の間^に行っ た.

第5 週 齢日 よ り, 週1 回 の放り 上げ刺 激を行^い, 容 易^に発 作を^{お こ}す よ う^に した. 痩 攣発 作を簡 単に記 述 す る と, 以 下^のよ うに経 過す る. マウ^スを 上下^に軽く 放り 上げる と ピ グ ピ ク と^いう動 作と と も^に, チュ ッチ

エ ッ ^{… …} と疇 泣し て突 然横 転す る. 次^いで強 直 性 痙 攣 期, 間 代性 痩 攣 期^を経て 回復し て^いく. これ以 外で途

中で と ん坐す る も の は不 完 全発 作と し た.

V P A は鐘 紡 株 式 会 社よ り原 末^の提 供を受け た^. 原 発を生理食 塩 水で 0^.3^〜0^.4 ml が約2 5 0 m g/k_{g に} な

る よ う^に調整し^, E トマウスの腹 腔 内^に注射し た. 一 方, G A B A ト ラ^{ン ス}ア ミ ナ ^ー ゼ を選 択 的^に阻 害 し, 脳 内G A B A 濃 度のみ を増 加さ せ ること が知ら れ て^いる ア ミ^ノオ キシ酢酸 (以下A O A A と略) ^{1 1)}を, 脳 内 G A B A 濃 度の み を増 加さ せ た場 合の抗け^いれ ん作 用 を知る た め の対 照と し た. そ し て,約2 0 m g/kg を腹 腔 内 注射し た.

各 薬物の注射 前, 注射 後¹5 分, 3 0 分,6 0 分,9 0 分,

1 2 0 分, 6時 間^の各^々の時 間^に, 5 0 回^の放り 上げ刺 激 ( 高さ 1 0^〜2 0c m 位) を行っ た. 刺激の直 後, ま た は,

け^いれ ん発 作を^{お こ}し た時は間代 性 痙 撃 期か ら そ^の直 後^にか け て断 頭し, 液 体 窒素 申で凍 結し た. 同時^に断 頭 部よ り ^ヘパリン採血 を し た.脳は凍 結し て^いる間に,

速や かに小脳と臭 球を除^いた全脳を と り出し て測定し た. 脳 重 量は 2 7 0m g 前 後^であ^っ た.

抽 出は 3 M ^一過 塩 素酸^{で ホモジ ナ イ ズ し}, 3,0 0 0 G,

1 5分 間遠 心し た^. その後, 上 清を 2 M ^‑K H C O3でpH 6^〜7^に調 整し, 1時 間, 水 冷 静 置の後10,0 0 0 G, 1 0分 間 遠心 し た^.そ の上 清^を測 定^まで,

‑20⁰C で凍 結 保 存し た^. 血祭も同様^に保 存し た^.

血 柴 中の V P A 濃 度は酵 素 免 疫 法の E M I T 法で測 定し た. 脳 内G A B A, ア^{ス パ}ラ ギ^ン酸, グ^ルタ ミ^ン酸 は, これ ら の ア^{ミ ノ}酸の代謝と関 与す る酵 素反 応を利

用 し た ^"酵 素 的微 曇 測 定 法^{' ' に}よ^って測^っ た. す な わ ち, 加 藤 尚彦^{1 2)}と G^{r a}ha m ^{1 3})ら の方 法を ^一部 改 変し て 測 定し た.

まずG A B A は, 過 剰 羞^{の α ‑} ケ ト グ^ルタル酸と N A D P⁺の存 在 下^でG A B A を下 記の2 ^つ の反応によ り N A D P H ^に転 換し, その螢 光を測 定す る方 法で あ る.

(1) G A B A ^十二α‑ケ ト グ^ルタ^ル酸^{トラン スア ミナー ゼ}

コ

㌫

警 ^三 ; 孟 ^: ‡ ;ニ ニ … :‡ 孟 諾

^{墜 墜}

コ ^ハ ク酸⁺ N A D P H + H ⁺

反 応 液と して,ピロ リ^ン酸塩 綬 衝 液(0.1 M ,pH 8.4) 3 ml, G A B A S E[^{0.0 7 5 M ‑リン}酸 緩 衝液^に2 5%(v/^v) グリセロ ^ー ルを含む もの に1単位/^ml の割 合^に溶解]

0^.5ml, N A D P⁺(¹ m M/L, pH 7.0)0.5 ml, αMケ ト グ^ルタ ミ^ン酸(6 0 m M/L, pH 7^.0)0^.5ml, 0･4%2‑^メ

ルカ プ ト^エタノ ^ー ル0.5 ml の混 合液を調 整す る. この 反 応 液5 0〝1 と試 料1 00_/Jl と を混 合し, 室 温で 4 5 分 間反応さ せ た後, 0⁰C^で1 N ^‑NaO H l O_JLl を加え て,

6 0⁰C で 15 分 間温浴^によ り, N A D P H を保 存して基質 を破 壊す る. その後, O^OC で 0^.0 3% H202‑^{9 N ‑NaO H}

3 2 0ノ^Jl を加え,6 げC ^{で 1}0分 間温 浴し,弓卓アルカ リによ る螢 光 増 加を し た後, 日立2 0 4 形 分 光け^い光 光 度計^に よ り, 3 4 0 m 〟の波 長で励 起し, 4 5 0 m 〟 で測 定し た^.

ア^{ス パ}ラ ギ^ン酸は, 過 剰量 の^α‑^{ケ ト グルタル}酸と N A D H の存 在 下^に, 下 記の2 つ の反応によ り ア^{ス パ} ラギ^ン酸を N A D^{+ に}転 換し, そ^の螢 光を測 定す る方法

で あ る. ト ラ^{ン ス}

(1) アス パラ ギン酸十α‑^{ケ ト グルタル酸 乙主土二}皇

オ キ ザ^ル酢 酸⁺ グルタ ミン酸

(2) オ キ ザル酢 酸⁺ N A D H + Ⅲ⁺ 脱 水 素 酵 素

らリ^ン

ゴ酸⁺ N A D⁺

反 応 液は, 2 0 0 m M ^‑イ ミ ダ ゾ^{ー ル}塩 酸 (pH 7.0) 3

ml, α^‑ケ ト グルタ ミン酸(6 0 m M/L, pH 7^.0)0^,5^ml,

N A D H (1m M/L) 0^.5ml, G O T ( 2m g/^ml) 1 0 0_〟1,

リ^{ン ゴ}酸 脱 水素 酵素 (5 m g/ml)2 0_/バ, 0 .4% 2‑^メルカ

プ ト^エタノ^ー ル0^.5 ml を調整す る^. こ の反応 液50_〟l と試 料^{5 0}/^∠1 と を混合し, 室温で⁴5分 間反応させる^. そ の後, O^OC で 1 N‑^{H Cl l O}J^Ll を加え, 室 温^{で3 0} 分間 放 置す る. す な わ ち N A D⁺ を保 存し,基 質を破 壊す る.

その後 再び 0⁰C中^で9 N‑^{N aO H 2 0 0}/^Jl を加え て,

38⁰C 30 分 間温 浴^で螢 光増 加を行う. その後,340 ^m〟 で

励起し, 4 5 0 m/^J で測 定す る^.

グ^ルタ ミ^ン酸は, 過 剰量 の N A D^十の存 在 下^でグ^ルタ ミン酸を下記の反 応^によ り N A D Il ^に転 換し, そ^の螢 光

芸 警 誓 て : 慧 ^{志 望 こ 迩 準}

酸⁺ N H³⁺N A D H 十H⁺

反応 液と し て,2 0 0 m M ^‑ト リ^ス塩 酸緩 衝 液(pH 8 ･4) 2^.5 ml, N A D⁺(1 5 m g/5 ml緩 衝 液)1 ^･O ml, A D P(26

m g/5 ^ml綬衝 液)0^･5 ml, グ^ルタミ ン酸脱 水 素酵 素(1 0

m g/^ml) 0^･4 5 ^ml, 0･4%2‑^{メ ルカ プ トユタノー ノレ0･5}

ml の混 合 液を調 整す る. この反 応 液5 0〟1 と試 料50

〟1 と を室 温で40 ^〜4 5 分 間混合 反応の後, 0⁹C中^で1 N

‑N aO H 2 0〟1 を加え^, 70 ^〜8 0⁰C で温 浴す る^ことによ り, N A D H を保 存し, 基 質を破 壊す る^. その後, 0⁰C

[

∃

≡

○

⊃

ぎ

t

内

⊃ S

ェ

y

01 1^, 2^.5 5 7.5 10 GA B^A c o n c (Z ntratlo n

( ^×灯⁸ m o 川0 0_〃l)

F ig^,1. Relatio n ship betw e e n 8u o r e s c e n c e of the

N A D P^十pr odu ct p^{r o}du c ed fr o m the c o n v e r sio n of N A D P H b_y al kalin e‑p^{e r O X}ide tr e atm e nt a nd G A B A le v elsin thel^Xl O ^{1 0}tolX l O ⁸ m olr a nge.

01 1^. 2 ^.5 5 A^sp^artate c o n ⊂e ntratio n

(

⁾

F ig^･2･ Relatio n ship betw e e n flu o r e s c e n c e pr odu ct to N A D⁺in str o ng al kali a nd a spa rtatele v elsin the lx1 0^{‑1 0}to 5^×1 0‑⁹ m ole r a nge.

中で 0^.0 3% H202‑^{9 N ‑NaO H 20 0Jバ を混 合し, 6 00C}

で 1 0 分 間 温 浴によ り螢光 増 加を行う. その後,3 4 0m 〟 で励 起し, 4 5 0 mJ^J で測 定し た^.

な お測 定 成績は, 平 均値^±標 準偏 差^で表わ し, 有意 差検 定^には, tテ^ス ト法を 用^いた.

結 果

図1, 2 , 3に示 し て あ る よ う^に, 脳 内G A B A, ア ス パラ ギ^ン酸, グルタ ミン酸濃 度を測 定す る為^に, 既 知^の標 準 試料の吸 光度を測 定し て標 準曲 線を得た^. 抽

出し た試 料は全て, この標 準 曲線 内^{に入っていた.} E l ^‑マ ウ^スの け^いれ ん発 作は, V P A 約2 5 0 m g/k_g 注射の後, 5 0 回放り 上げ刺 激にも か か わ らず, 注 射 後 1 5分か ら 9 0 分^{に か}け て抑 制さ れ た. し か し 1 2 0 分 以 降は抑 制さ れ なかっ た^{. 一} 方A O A A 約20 m g/kg 注 射 群^{では 3 0}分 後よ り, け^いれ ん発 作の域 値の上昇が み ら れ た^. 90 分 以降は 5 0 回の放り 上げ刺 激^にも か か わ ら ず, 発 作は抑 制さ れ た^.

V P A 2 5 0 m g/kg 注射 後の血祭中V P A 濃 度 ( 図4) は 1 5分 後に 5 58 ±9 7JJg/ml と急激^に上昇し た. 3 0分 後も 5 4 0±1 3 4_J^J_g/^ml と, ほ ぼ同^{一 レ ベル}を保ち,そ の 後 減少し た. 6時 間後には, 血 祭 中か ら は検 出で き な か^っ た^. 発 作と 血祭 中のV P A レ ベ ルと の関 係を み る と, 血 集 中^の V P A 濃度が, 約1 7 0_/Jg/^ml 以 上 で発作 は抑 制さ れ て^いた.

脳 内G A B A 濃 度 ( 図5) は注射 前の^コ ント^{ロ ー} ル群

で2^.24 ±0^.2 7_ルm Ol/g湿重量で あった^. 注 射 後1 5分 値で は 2.12±0^.17/^Jm Ol/g 湿重量 と変 化し な かった.

01 1^. 2 ^.5 5 7^.5 G Luta m atc c o n c e nt^rat io n

(

灯

)

F ig^.3. Relatio n sh ip betw e e n N A D H flu o r e s e n c e a nd gluta matele v elsin thel^Xl O^{‑1 0}to 7.5^×1 0 ⁹

m ole r a nge.