，緑膿菌が抗 MRSA 薬を不活化する現象

はじめに

我々は，1992 年よりこれまで，in vitro 実験に よ っ て 緑 膿 菌 が MRSA の 発 育 を 抑 制 す る こ と

，緑膿菌が抗 MRSA 薬を不活化する現象

を 報告してきた．あらゆる臨床材料から緑膿菌や MRSA が検出されるが，緑膿菌と MRSA が同時 に分離される検体は，喀痰がその大半を占めてい

る

．今回我々は，緑膿菌と MRSA が同時に分離 された気道由来の検体を用い，両菌の相互作用，

および緑膿菌の薬剤不活化作用を検討した．

対象および方法

順天堂医院・臨床検査部において，2002 年 12 月から 2003 年 6 月の期間に緑膿菌と MRSA が同 時検出された気道由来の 137 検体から，重複例な どを除いて 63 例の気道分泌物を対象とした． 方法 としては，先行培養した緑膿菌の寒天平板反転法 による MRSA 発育抑制作用の測定， および寒天平

緑膿菌の抗 MRSA 活性および抗 MRSA 薬不活化作用について

―緑膿菌と MRSA 同時検出検体による検討―

1）順天堂大学医学部臨床病理学教室，^2）順天堂大学医学部付属順天堂医院臨床検査部，

3）市川市介護老人保健施設ゆうゆう，^4）順天堂大学医学部附属順天堂東京江東高齢者医療センター臨床検査科，

5）防衛医科大学校検査部，^6）順天堂大学医学部付属順天堂浦安病院

近藤 成美

山田 俊彦

佐藤 尚武

西園寺 克

小栗 豊子

猪狩 淳

（平成 16 年 5 月 17 日受付）

（平成 16 年 6 月 17 日受理）

気道由来の緑膿菌・MRSA 同時検出例を対象として，緑膿菌の抗 MRSA 作用を寒天平板反転法で検 討した．さらに，抗 MRSA 薬の抗菌作用に対する緑膿菌共存の影響については感受性ディスクを用い寒 天平板重層法で検討した．用いた薬剤はバンコマイシン，テイコプラニン，ST 合剤，アルベカシン，ミ ノサイクリンである．実験の結果，緑膿菌，MRSA 同時検出 63 組のうち 56 組（88.9％）で，先行する緑 膿菌の発育による明らかな MRSA の発育抑制が認められた．アルベカシン，ST 合剤，ミノサイクリン の 3 剤は緑膿菌の共存により MRSA に対する抗菌活性が有意に抑制されたが，バンコマイシン，テイコ プラニンは抗菌活性の抑制は認められなかった．

以上の成績より，in vivoにおいても先行・定着する緑膿菌がその産生物質などにより MRSA の定 着・増殖を抑制する可能性が示唆された．緑膿菌と MRSA が同時に存在する場合には，緑膿菌が MRSA 治療薬の抗菌活性を抑制する可能性が示唆されたことから，今後は，治療抵抗症例の分析と共存菌間の 相互作用をさらに検討する必要がある．

〔感染症誌 78：823〜828，2004〕

要 旨

別刷請求先：（〒113―8421）東京都文京区本郷 2―1―1 順天堂大学医学部臨床病理学講座

近藤 成美

indirect pathogen,Pseudomonas aeruginosa, MRSA Key words：

板重層法による抗 MRSA 薬不活化作用の測定を 従来の方法に準じて行った．なお，緑膿菌 （ATCC 27853）および MRSA（ATCC43300）との相互作 用についても検討した．

1．MRSA 発育抑制作用の測定（寒天平板反転 法） （Fig. 1）

緑膿菌の遊走能抑制のため寒天濃度を 3％ に調 整した Mueller-Hinton 寒天培地に，緑膿菌を白金 耳を用いて画線塗抹，好気的に 35℃ で 24 時間培 養した．その後，寒天をスパーテルを用いて無菌 的に裏返し， 緑膿菌に直交する形で MRSA を同じ く白金耳を用いて画線塗抹，さらに 35℃ で 24 時 間〜48 時間培養し，指示菌としての MRSA の発 育阻止直径を測定した．

ここでは便宜的に，緑膿菌との交点付近におい て指示菌が寸断なく発育したもの，および指示菌 の発育が 1 集落も認められない部分が 10mm 未 満のものを発育抑制作用（−）とし，発育阻止直 径が 10mm 以上のものを発育抑制作用（＋）の菌 株とした．また，24 時間，48 時間培養での比較も 行った．

2．緑膿菌による抗 MRSA 薬に対する抗菌活性 の抑制作用（寒天平板重層法） （Fig. 2）

直径 150mm の Mueller-Hinton 寒天培地（日本

ベクトン・ディッキンソン社）の表面に緑膿菌を NCCLS に準じた菌量塗抹（10

cfu

ml）し 24 時間 35℃ で培養，その後，直径 85mm の 5％ ヒツジ脱 繊維素血液加 Mueller-Hinton 寒天培地（日本ベク トン・ディッキンソン社）を乗せ，その表面に MRSA を NCCLS に準じた菌量塗抹し，薬剤感受 性ディスクを置いて 24 時間 35℃ で培養し，阻止 円直径を測定した．

コントロールとして，緑膿菌を塗抹していない Mueller-Hinton 寒天培地の上に 5％ ヒツジ脱繊維 素血液加 Mueller-Hinton 寒天培地をのせ，MRSA を NCCLS に準じた菌量塗抹し，感受性ディスク を置いて阻止円直径を測定した．

用いた抗 MRSA 薬は，バンコマイシン （VCM） ， テ イ コ プ ラ ニ ン（TEIC） ，ミ ノ サ イ ク リ ン

（MINO），ST 合剤（ST） ，アルベカシン （ABK） の 5 剤で，使用した薬剤感受性ディスクは日本ベク トン・ディッキンソン社の 1 濃度ディスクであ る．

阻止円直径の統計学的有意差の検定は，Wil- coxon 検定を用いた．

結 果

1．寒天平板反転法による MRSA 発育抑制作用 の測定（Fig. 3）

Fig. 1 In vitro assay for MRSA growth inhibitory activity byP. aeruginosa（Reversed agar plate method）

63 例中 56 例（88.9％）で，緑膿菌が MRSA の発 育を阻止していた．

内訳としては，発育阻止の全く認められないも の（24 時間 7 例，48 時間 5 例）と，発育阻止が大 きく認められるものとの 2 峰性の分布を示し，発

育阻止直径は 24 時間と 48 時間で有意差は認めら れなかった（mean±SD：24 時間 24.4±10.6mm，

48 時間 25.5±10.5mm） ．

2．寒 天 平 板 重 層 法 に よ る，緑 膿 菌 に よ る 抗 MRSA 薬の抗菌活性の抑制作用（Fig. 4）

Fig. 2 In vitro indirect pathogenesis ofP. aeruginosaagainst anti MRSA chemother- apy

Fig. 3 MRSA growth inhibitory activity byP. aeruginosa

バンコマイシン，テイコプラニンの抗 MRSA 活性は緑膿菌の共存で，増強あるいは不変であっ た． ミノサイクリンの抗 MRSA 活性は緑膿菌の共 存で，やや低下〜著しい抑制が認められ，完全抑 制は 86％（48

56）であった．ST 合剤の抗 MRSA 活性は緑膿菌の共存で，不変，やや低下，および 著しい抑制を示し，完全抑制は 50％（31

62）で あった． アルベカシンの抗 MRSA 活性は緑膿菌の 共存で，上昇，不変，やや低下，および著しい低 下で，完全抑制は 17％（11

63）であった．

考 察

緑膿菌と MRSA が同時に分離された気道由来 検体（63 検体）を用い，緑膿菌の MRSA 発育抑制 作用， および緑膿菌による抗 MRSA 薬の抗菌活性 への影響を，in vitro で検討した．

緑膿菌と MRSA，同時検出例においても，約 90％ で緑膿菌が MRSA の発育を抑制しているこ とが明かになった． この緑膿菌の MRSA 発育抑制 作用については，以前にも報告した通り，緑色の 色素であるピオシアニンを中心とした MRSA 発 育 抑 制 作 用 物 質 の 産 生 に よ る も の と 考 え ら れ る

．しかしその場合，MRSA 発育抑制作用物質 はピオシアニン以外の非色素性の物質でも報告が あり

，今回，気道由来の同時検出例を対象に 行った実験でも，約 90％ の緑膿菌株に MRSA 発 育抑制作用が認められたことは，in vivo において も，先 行 し て 定 着 し 共 存 す る 緑 膿 菌 の 存 在 が MRSA の増殖を抑制している可能性が示唆され る

．それゆえ，今回の結果はあくまでも

のものであるが，起炎菌としての緑膿菌を除菌・

Fig. 4 Inactivation of anti-MRSA agents byP. aeruginosa

治療する場合，MRSA の環境および生体内での除 菌を優先し，皮膚・粘膜への定着部位や器具付着 部の除菌・洗浄を心がけるべきであろう．

緑膿菌共存により，抗 MRSA 薬である MINO に対し 86％，ST に対し 50％，ABK に対し 17％

の緑膿菌株で，著しい抗菌活性の抑制を示した．

緑膿菌による， 抗 MRSA 薬の抗菌活性の抑制メカ ニズムは不明であり，今後さらなる検討が必要で ある．

今回の結果はあくまでも

のものである が，MRSA と緑膿菌が共存している場合，たとえ 感受性試験で感性と判定されても，薬剤選択には 細心の注意が必要であろう．とくに，検出頻度の 高い緑膿菌については，慢性気道感染症における 直接病原菌としてのみならず，薬剤不活化作用な どによる間接病原菌として作用している可能性が あり，MRSA などの細菌感染症の治療時に治療抵 抗性を示す場合，共存菌としての緑膿菌などの存 在も考慮すべきであろう．

この論文の要旨は，第 52 回日本感染症学会東日本地方 会総会（平成 15 年，横浜）にて，発表した．

文 献

1）荻野 純，山田俊彦，後藤 領，菊島一仁，藤森 功：臨床材料より分離される緑膿菌の黄色ブド ウ球菌に対する発育抑制作用．感染症誌 1992；

66：909―13.

2）近藤成美，佐藤尚武，山田俊彦，宮崎彩記子，小

栗豊子，猪狩 淳：臨床材料より分離される緑膿

菌の抗 MRSA，抗 Candida 作用について．感染症 誌 2002；76：231―7.

3）佐藤尚武，近藤成美，山田俊彦，西園寺克，清水 彩加，小栗豊子，他：抗 MRSA 薬の in vitro 抗菌 作 用 に 対 す る 緑 膿 菌 共 存 の 影 響．感 染 症 誌 2004；78：829―34.

4）近藤成美，山田俊彦，佐藤尚武，小栗豊子，猪狩 淳：緑膿菌と MRSA が同時に分離された喀痰の 肉眼的性状と共存菌について，第 37 回緑膿菌研 究会講演記録，2003；86―9.

5） Schoental R ： The nature of the antibacterial agents present in Pseudomonas pyocyanea cul- tures. Br J Exp Pathol 1941；22：137―47.

6）Zyskind JW, Pattee PA, Lache M：Staphylolytic substance from a species of Pseudomonas . Sci- ence 1965；147：1458―9.

7）Machan ZA, Pitt TL, White W, Watson D, Taylor GW, Cole PJ,et al.：Interaction between Pseudo- monas aeruginosa and Staphylococcus aureus：

description of an anti-stphylococcal substance. J Med Microbiol 1991；34：213―7.

8）Machan ZA, Taylor GW, Pitt TL, Cole PJ, Wilson R：2-Heptyl-4-hydroxyquinoline N-oxide , an an- tistaphylococcal agent produced by Pseudo- monas aeruginosa . J Antimicrob Chemother 1992；30：615―23.

9）Wilson R, Skyes DA, Watson D, Rutman A, Tay- lor GW, Cole PJ：Measurement of Pseudomonas aeruginosa phenazine pigments in sputum and assessment of their contribution to sputum sol toxicity for respiratory epithelium. Infect Immun 1988；56：2515―7.

Bacterial Interaction and Indirect Pathogenesis of

at the Growth of MRSA

Shigemi KONDO

, Toshihiko YAMADA

, Naotake SATOH

, Katsu SAIONJI

, Toyoko OGURI

＆ Jun IGARI

1）Department of Clinical Pathology, Juntendo University School of Medicine,

2）Department of Clinical Laboratory, Juntendo University Hospital,^3）Ichikawa City, Health Service Facility for the Aged,^4）Department of Clinical Laboratory, Koto Geriatric Medical Center, and^5）Department of Laboratory Medicine, National Defense Medical College,^6）Juntendo University Urayasu Hospital

Bacterial interactions such as methicillin-resistant

tion or inactivation of anti-MRSA antibiotics by

as an indirect pathogen were tested by in vitro assay.

Paired strains,

and MRSA, used in this experiment were isolated from 63 respira- tory samples at Juntendo University Hospital from 2002 to 2003. Growth inhibitory activities against MRSA by

were tested with reversed agar plate method. Inactivation of anti-MRSA anti- biotics by

were assayed with disk diffusion method using agar over lay technique.

Fifty-six（88.9％）out of 63 samples showed the significant MRSA growth inhibitory activity by co-existed

. Anti-MRSA antibiotics such as trimetoprim-sulfamethoxazole combination

（ST） , arbekacin（ABK）and minocycline（MINO）except Vancomycin （VCM）and Teicoplanin （TEIC）

were inactivated by the co-existed

Our data suggests that

may play not only as a chronic respiratory pathogen but

also as an indirect pathogen. Further, the most

with anti-MRSA activity isolated respira-

tory sample may play as a modulator of MRSA infection.