he- patocyte growth factor（HGF）の 発 現 が 亢 進

緒 言

子宮腺筋症は，子宮筋層内に子宮内膜基底層 由来の腺上皮および間質細胞が侵入し，周囲筋 層の反応性増殖を伴う病変が局在性あるいはび まん性に子宮を腫大させる病態と定義され，疫 学的には，３５歳から５０歳までの経産婦に多いと される〔１，２〕．子宮内膜症と子宮腺筋症との相 違は，由来する子宮内膜の性状（機能性あるい は基底層）および病変が存在する解剖学的部位

（子宮外あるいは子宮内）であるが〔２〕，その 発症機序や進展に関する病態は必ずしも明らか ではない．子宮腺筋症の発生病理については諸 説があり，ミューラー管遺残組織の

de novo

化生，血管あるいはリンパ管経由の細胞浸潤，

あるいは子宮内膜・筋層境界における組織スト レスなどである〔１，３―５〕．現在もっとも支持さ れているものとして，子宮内膜基底層の筋層へ の直接浸潤により病巣が形成される説が挙げら れる〔１〕．一方で，基底層内膜が筋層深部へ浸 潤する機序については未だ不明な点が多い．

E―カドヘリンは，複数の遺伝子ファミリー

で構成される膜貫通型糖蛋白で，上皮細胞間あ るいは上皮細胞と周囲結合織間の結合性を維持 する「接着ジッパー」として作用する〔６〕．子 宮内膜症の上皮細胞では，E―カドヘリンの発 現が低下していることが報告されている〔７〕．

また乳癌，膀胱癌あるいは肝腫瘍細胞では，

he- patocyte growth factor（HGF）の 発 現 が 亢 進

することによりカドヘリンによる細胞接着性が

低下し，周囲間葉系組織への浸潤に関与してい るとされる〔８〕．最近の報告では，エストロゲ ン に よ る 上 皮 細 胞 の

epithelial-mesenchymal transition（EMT，上皮間葉転換あるいは上皮

間葉系移行）が子宮腺筋症の発症・進展あるい は悪性腫瘍細胞の転移能に関連していることが 示されている〔９，１０〕．エストロゲンのメディ エータである多能性増殖因子の

HGF

は，エス トロゲンと同様に

EMT

作用をもち，子宮腺筋 症における筋層への腺上皮の浸潤に関与してい る可能性がある．

私どもはこれまでに，子宮腺筋症由来細胞あ るいは組織において，

HGF

と

E

―カドヘリンの 遺伝子および蛋白発現が逆相関することを報告 した〔１１〕．また，

HGF

の添加により，子宮内膜 腺上皮細胞（

EEC

）で遊走能が亢進し，

E

―カドヘ リンの発現が低下することが認められた〔１１〕．

これらの結果から，今回，子宮腺筋症あるいは 非 腺 筋 症 女 性 由 来 の

EEC

に お い て

HGF

と

EMT

の関連を検討した．まず，HGFが細胞形 態および細胞遊走能に与える影響を検討した．

次に，

HGF

と

E

―カドヘリンあるいはビメンチ ンの組織発現の関連を検討した．また，E―カ ドヘリン遺伝子の発現抑制因子である

Slug

と

Slain

の遺伝子および蛋白発現のエストロゲン

あるいは

HGF

による変化を検討した．

方 法

当科で子宮全摘術を施行した１５例の子宮腺筋 症女性（平均年齢４５．３歳，範囲３７〜５２歳）およ

〔ワークショップ ／子宮腺筋症の基礎と臨床〕

子宮腺筋症の発生病理における肝細胞増殖 因子（HGF）と E―カドヘリンの関与

）長崎大学医学部産科婦人科学教室

）済生会長崎病院婦人科

カーン・カレク^１），北島 道夫^１），平木 宏一^１）

藤下 晃^２），増﨑 英明^１）

び１２例の非腺筋症コントロール女性（平均年齢 ４２．３歳，範囲３５〜５２歳）から子宮内膜から筋層

・漿膜にいたる全層組織生検を行った．コント ロールの手術適応は筋層内および漿膜下子宮筋 腫であった．子宮腺筋症の診断は症状，婦人科 的診察および

MRI

の所見から診断し，最終的 に病理組織学的診断で確認された．対象のうち，

例の局在性腺筋症症例において，内膜・筋層 境界の組織を病巣が存在する子宮壁と存在しな い対側の子宮壁から採取した．また， 例のび まん性腺筋症症例では前壁あるいは後壁から組 織を採取した．

すべての生検組織は，ヘルシンキ宣言に沿っ て施設倫理委員会の承認を受け，対象からイン フォームド・コンセントを得て採取した．

採取した組織から抽出した子宮内膜腺上皮細 胞（EEC）および

Ishikawa

細胞における

HGF, E―カドヘリン，Slug

および

Slain

の遺伝子発現

を

RT―PCR

で検討した．それぞれの遺伝子産

物に対するセンスおよびアンチセンスプローブ はこれまでの報告から作成した〔６，８，１０〕．

β

―

Actin

に対するセンスおよびアンチセンスプロ

ー ブ を

internal control

に 使 用 し た〔１２，１３〕．

EEC

の分離・抽出，初代培養細胞の評価につ いての手法は，これまでの報告を参照にされた い〔１２―１４〕．HGF（H―１４５，Santa Cruz， ： ５０），

E―カドヘリン（NCH―３８， Dako， ：１００），

N

―カドヘリン（６

G

１１，

Dako

， ：１００），ビメ ンチン（V９，Dako， ：５０），Slug（ab１２８４８５，

abcam， ：５０），Snail

（ab５３５１９，abcam， ； ５０）の子宮内膜組織中の発現局在を免疫組織化 学的手法により検討した．免疫染色手法の詳細 はこれまでの報告を参照されたい〔１２，１３〕．子 宮内膜・筋 層 境 界 領 域 の 組 織 を

Polytron ho- mogenizer（Kinematics, Luzern, Switzerland）

により細切均等化し，その上清を採取し組織中

HGF

濃度を

ELISA

により測定した．

成 績

EEC

に対する

HGF

の細胞分離・遊走の亢進 作用が認められ，HGFと

E―カドヘリンの遺伝

子および蛋白発現の逆相関が既報のごとく認め

られた〔１１〕．E―カドヘリン

mRNA

の発現は，

培養２４および４８時間後（pre-confluent to conflu-

ent

）で最も増加し，これらの発現は

HGF

の添 加により低下した〔１１〕．これら

HGF

と

E―カ

ドヘリンの発現の逆相関は子宮腺筋症のないコ ントロール群では認められなかった．子宮内膜

における

N―カドヘリンの発現は，子宮腺筋症

の有無にかかわらず認められなかった．局在性 腺筋症の病変が存在する同側の子宮壁あるいは びまん性腺筋症の前壁および後壁から採取した 組織の子宮内膜・筋層境界領域における

HGF

の発現は，局在性腺筋症の対側子宮壁あるいは 腺筋症のないコントロールのそれらと比較して 有意に亢進していた．

EEC

の形態変化を検討したところ，分離培 養

EEC

への

HGF（１００ ng／ml）の添加により，

敷石状の

EEC

が４８時間培養後までに時間経過 とともに間葉系細胞の形態（伸長・紡錘状）へ と変化した（図 A）．ボイデンチャンバーに よる細胞遊走の検討では，HGFはチャンバー 上層の

EEC

を下層へ濃度依存的（ ，５０，１００

ng ／ ml

）に遊走させた（図 BおよびC）．

局在性腺筋症病変が存在する同側あるいは病 変のない対側の子宮壁において，上皮系細胞マ ーカーとして

E

―カドヘリン，間葉系細胞マー カーとしてビメンチンの発現・局在を検討した ところ，対側子宮壁の子宮内膜基底層あるいは 機能層の

E

―カドヘリンおよびビメンチンの発 現には差が認められなかった（図 ）．一方，

腺筋症が存在する同側子宮壁の子宮内膜基底層 では，

E

―カドヘリンとビメンチンの発現に逆 相関が認められた．これらの変化は同側子宮壁 の子宮内膜機能層では認められなかった（図

）．また，びまん性腺筋症の前後壁から採取 した子宮内膜においても同様に，E―カドヘリ ンとビメンチンの発現の逆相関が認められた．

Ishikawa

細胞では

ER

が発現し，エストロゲ ン（E２）の添加・非添加いずれでも

HGF

の受 容体である

c―Met

の発現が認められた．E２と

HGF

は

Slug

あるいは

Slain

の

mRNA

発現を濃 度依存的に有意に亢進させ（P＜０．０５

vs

非添

Changes in cell（EECs）morphology（HGF-100ng/ml ）

cobblestone-like

appearance cell dissociation reduced cell-cell contact

elongated spindle-shape

0 hour 12 hour

a A

number of migrated cells

0 50 100

dose of HGF（ng/mL）

＊

B C ＊

Cell migration

b c d

24 hour 48 hour

600 500 400 300 200 100 0

E-cadherin

functional layer（contralateral）

basal layer（contralateral）

functional layer（ipsilateral）

basal layer（ipsilateral）

Vimentin E-cadherin

Vimentin

図 A : HGFに対する培養子宮内膜上皮細胞の形態の経時的変化（a―d）を示す．HGF（１００ng／

ml）添加により，敷石状の形態であった培養子宮内膜細胞は時間経過とともに伸展し４８ 時間後に紡錘状の形態を示した．

B：ボイデンチャンバー法による細胞遊走の評価所見を示す．

C : HGF（ ，５０，１００ng／ml）に対する遊走細胞数をボイデンチャンバー法により計測し

た．HGF（５０，１００ng／ml）は非添加培養細胞に比して有意に遊走細胞数を亢進させた

（＊p＜０．０５）．

図 局在性子宮腺筋症の病変が存在する同側の子宮内膜および病変のない対側の子宮内膜の機 能層（上段）および基底層（下段）における上皮細胞のマーカーであるE―カドヘリンと間葉 系細胞のマーカーであるビメンチンの免疫染色による発現局在を示す．病変と同側の子宮 内膜基底層では，E―カドヘリンの発現は減弱し，一方でビメンチンの発現は増強していた．

検討したその他の部位の子宮内膜での両者の発現には明らかな相違は認められなかった．

SLUG SNAIL β-actin

452bp

300bp 516bp

E2（M）

HGF（ng/ml）

0 0

10⁻⁸ 50 0 50 B cont

M

Relative expression

SLUG SLAIN C

0 0

10⁻⁸ 50 0 50

E2（M）

HGF（ng/ml）

＊

＊

＊＊

＊ ＊

＊＊

c-Met-E2 stimulated pre-confluent control c-Met-basal

A

Ishikawa cells

10⁻⁸

0 10⁻⁸

0 10

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 E2 HGF E2＋HGF

加群），

E

２と

HGF

には相乗作用が認められた

（図 B，C）．

E

２あるいは

HGF

の作用は，

Slain

に比して

Slug

に対して有意に作用していた．

局在性子宮腺筋症の対側の子宮壁から採取し た子宮内膜基底層および機能層における

Slug

の発現は，E―カドヘリンの発現局在と同様の 傾向を示した（図 ）．一方，腺筋症病変と同 側の子宮壁から採取した子宮内膜の基底層で は，Slugの発現は亢進しており，これらでは

E

―カドヘリンの発現は低下していた．また，

機能層内膜では

Slug

および

E―カドヘリンの発

現はいずれも亢進していた（図 ）．Slainの子 宮内膜での発現・局在は認められなかった（図

挿入写真）．

考 察

本研究で，私どもはこれまでで初めて，HGF を介した

EMT

が子宮腺筋症の発症病態に関与 している可能性を示した．これまでの報告と異 なり，今回の検討では，局在性とびまん性の子 宮腺筋症に分けて子宮組織および分離培養子宮

内膜細胞を用いた．びまん性あるいは局在性の 子宮腺筋症の病変と同側の子宮内膜基底層由来 の内膜組織および

EEC

では，HGFと

E―カド

ヘリンの遺伝子および蛋白発現は逆相関が認め られた．これらは，組織中の

HGF

の発現亢進 が，上皮細胞のマーカーである

E―カドヘリン

の発現低下と関連していることを示唆してい る．一方で，これらでは間葉系細胞のマーカー であるビメンチンの発現が亢進していた．

これまでの私どもの検討では，

EEC

では間 葉系細胞のマーカーである

N―カドヘリンの遺

伝子発現が亢進していることが認められたが，

その蛋白発現は認められなかった〔１１〕．この 結果には，組織中の転写後の蛋白分解が関与し ている可能性がある．局在性の子宮腺筋症の病 変と同側から採取した子宮内膜あるいはびまん 性子宮腺筋症の前壁あるいは後壁から採取した 子宮内膜組織での

HGF

の発現亢進は，それら 組織中の

HGF

濃度の有意な上昇と関連してい た．さらに，子宮内膜組織中の

HGF

濃度は，

図 A : Ishikawa細胞におけるHGFの受容体であるc―Metの免疫染色による発現を示す．エ

ストロゲン（E２）非添加（basal）および添加後（E２stimulated）いずれもc―Metの 発現が認められた．

BおよびC : RT―PCRによるIshiklawa細胞におけるSlug／SlainのmRNA発現のE２ある いはHGF添加の有無による相違を示す．SlugおよびSlainの発現は非添加コントロー ルに比してE２およびHGF添加により亢進した（B）．βアクチンに対する相対的 mRNA発現量はE２およびHGF添加後に有意に亢進し（＊p＜０．０５），同時添加群に おいては，両者の相乗作用が認められた（C）（＊＊p＜０．０５；単独添加群vs.同時添 加群）．

E-cadherin

functional layer（contralateral）

basal layer（contralateral）

functional layer（ipsilateral）

basal layer（ipsilateral）

SLUG SLAIN

SLAIN

SLAIN

SLAIN E-cadherin

SLUG

子宮腺筋症のないコントロールおよび局在性の 子宮腺筋症で病変のない対側の子宮壁では低下 していた．

これまでの報告から，組織中

E―カドヘリン

発現の低下とビメンチンあるいは

N―カドヘリ

ンの発現亢進は，細胞の表現形が上皮細胞から 間葉細胞へと移行するのに不可欠である．

EMT

は悪性腫瘍細胞の転移に関連しているとされる が〔８〕，その機序は子宮腺筋症の病態に関与し ている可能性がある．今回，細胞形態ならびに 細胞遊走の変化に着目して検討を行った．HGF は時間経過に沿って，敷石状の

EEC

を紡錘状 の細胞に形態変化させた（図 ）．HGFによる

EMT

作用は，ボイデンチャンバー法による細 胞遊走の亢進によっても確かめられた．これら の知見は，元来エストロゲンのメディエーター

（estromedin）であり，また，多能増殖因子で ある

HGF

が〔１２，１５〕，EECに お い て

EMT

作 用をもち，また子宮内膜基底層に作用して子宮 腺筋症の病態に関与していることを示唆してい る．

E―カドヘリンの発現には，転写調節因子とし

て，Slug，Slain，SIP―１

／Zeb

２，E１２

／E

４７および

Twist

が関与しており，それらは

EMT

にも関連 している〔１６，１８〕．それらのなかで，

Slug

と

Slain

は

E―カドヘリンのプロモーター領域の近位端

E―box

に作用することが示されており〔１６〕，

いくつかの細胞系列で

E

―カドヘリンと

Slug ／

Slain

の発現が逆相関することが報告されてい

る〔１６，１７〕．

Bolos

らは〔１７〕，

Slug／Slain

の上皮 における局所的な発現亢進が細胞の遊走性ある いは浸潤能を亢進させ

EMT

を生じさせること を示している．最近の報告では，E―カドヘリン の発現低下において，エストロゲンが

Snail

お よび

Slug

の発現に影響し卵巣癌細胞において 転移能を惹起させることが示されている〔１０〕．

今回の研究では，エストロゲンをメディエート する増殖因子である

HGF

が，Ishilkawa細胞に おいて，Slug／Slainの発現をエストロゲンとと もに協働的に調節していることが認められた．

今回，E―カドヘリンと

Slug

の間の発現の逆相 関が認められたが，Slainとの間には認められ なかった．また，これらの逆相関は局在性子宮 腺筋症の病変と同側の子宮内膜基底層において 図 局在性子宮腺筋症の病変が存在する同側の子宮内膜および病変のない対側の子宮内膜の機

能層（上段）および基底層（下段）における上皮細胞のマーカーであるE―カドヘリンとそ の転写抑制因子であるSlugおよびSlainの免疫染色による発現の相関を示す．病変と同側 の子宮内膜基底層では，E―カドヘリンの発現の減弱とSlugの発現の増強が認められた．こ

のようなE―カドヘリンとSlugの発現の逆相関はその他の部位の子宮内膜組織では認めら

れなかった．Slainの発現は今回検討した子宮内膜組織では認められなかった（挿入写真）．

明瞭に認められたが，対側子宮壁由来の子宮内 膜や内膜機能層では認められなかった．

子宮腺筋症由来の子宮内膜では，組織中

HGF

濃度が高く，HGFを介した

Slug／Slain

の発現 亢進により

E―カドヘリンの発現低下が認めら

れ，一方で

HGF

は子宮内膜腺上皮細胞を形態 的に線維芽細胞様に変化させ，上皮系の細胞マ ーカーの発現が間葉系へと変化し，細胞遊走能 の亢進を促した．これらの結果は，

HGF

が子 宮腺筋症の病態に

EMT

作用を介して関与して いることを示唆している．HGFは，エストロ ゲンと協働的に作用して，内膜・筋層境界に存 在する細胞に

EMT

を惹起して筋層深部へ細胞 侵入を生じさせる機序を担っていることが推察 さ れ る．選 択 的 エ ス ト ロ ゲ ン 受 容 体 阻 害 剤

（SERM）で あ る

raloxifene

は，エ ス ト ロ ゲ ン が惹起する

EMT

を低下させる作用があること が報告されている〔１０〕．エストロゲン依存性 疾患での

HGF

が介在する

EMT

に対するエス トロゲン拮抗物質の作用は検討しなければなら ない課題であろう．

文 献

〔１〕Bergeron C et al. Pathology and pathophysiology of adenomyosis. Best Practice & Research Clini- cal Obstetrics and Gynecology２００６；２０⑷：５１１

−５２１

〔２〕Ota H et al. Is adenomyosis an immune disease?

Hum Reprod Update１９９８； ⑷：３６０−３６７

〔３〕Ferenczy A. Pathophysiology of adenomyosis.

Hum Reprod Update１９９８； ⑷：３１２−３２２

〔４〕Ridley JH. The histogenesis of endometriosis, A review of facts and fancies. Obstet Gynecol Surv １９６８；２３： −３５

〔５〕Nishida M et al. Development of adenomyosis.

Sanfujinka no Sekai１９９４；４６⑼： −１５（Japap- nese）

〔６〕Shapiro L et al. Structural basis of cell-cell adhe- sion by cadherins. Nature１９９５；３７４：３２７−３３７

〔７〕Gaetje R et al. Nonmalignant epithelial cells, po- tentially invasive in human endometriosis, lacks the tumor suppressor molecule E-cadherin. Am J

Pathol１９９７；１５０：４６１−４６７

〔８〕Hiscox S et al. HGF／SF regulates the phospho- rylation of β-catenin and cell-cell adhesion in can- cer cells. Proc Am Assoc Cancer Res１９９８；３９：

５００−５０１

〔９〕Chen YJ et al. Estrogen-induced epithelial- mesenchymal transition of endometrial epithelial cells contributes to the development of adeno- myosis. J Pathol２０１０；２２２：２６１−２７０

〔１０〕Park SH et al. Estrogen regulates Snail and Slug in the down-regulation of E-cadherin and induces mestastatic potential of ovarian cancer cells through estrogen receptorα. Mol Endocri- nol２００８；２２：２０８５−２０９８

〔１１〕Khan KN et al. a possible mechanism of gland invagination into myometrium. J Jap Soc En- dometriosis２０１１；３２：７９−８３

〔１２〕Khan KN et al. Estrogen and progesterone re- ceptor expression in macrophages and regula- tion of hepatocyte growth factor by ovarian ster- oids in women with endometriosis. Hum Reprod ２００５；２０：２００４−２０１３

〔１３〕Khan KN et al. Regulation of hepatocyte growth factor by basal and stimulated-macrophages in women with endometriosis. Hum Reprod２００５；

２０：４９−６０

〔１４〕Koga K et al. Demonstration of human angio- genin in human endometrium and its enhanced expression in endometrial tissues in the secre- tory phase and the decidua. J Clin Endocrinol Metab２００１；８６：５６０９−５６１４

〔１５〕Khan KN et al. Multifunctional role of hepato- cyte growth factor in the development of pelvic endometriosis. WES e-journal（review article）

２００８；１３−２０

〔１６〕Cano A et al. The transcriptional factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by re- pressing E-cadherin expression. Nat Cell Biol ２０００； ：７６−８３

〔１７〕Bolos V et al. The transcription factor Slug re- presses E-cadherin expression and induces epi- thelial to mesenchymal transitions : a compari- son with Snail and E４７ repressors. J Cell Sci ２００３；１１６：４９９−５１１

〔１８〕Acloque H et al. Epithelial-mesenchymal transi- tions : the importance of changing cell state in development and disease. J Clin Invest２００９；

１１９：１４３８−１４４９