IRUCAA@TDC : (1)研究進捗状況報告

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Title

(1)研究進捗状況報告

Journal

歯科学報, 112(6): 685-696

URL

http://hdl.handle.net/10130/2983

プロジェクト８

：

上皮からみた口腔機能の特異性基盤の解明

と疾患制御

１．上皮機能研究グループ ①概要説明 グループリーダー 澁川義幸 上皮機能研究グループ（hrc8-1）では，１）上皮機 能維持に関わる細胞分子動態，２）唾液・上皮細胞 における上皮バリア維持の細胞分子動態，３）粘膜 支配三叉神経節ニューロンの機能分子の代謝機構解 析，４）細菌の歯肉上皮およびインプラント周囲上 皮に対する侵入機序の解析，５）上皮の腫瘍性変化 にかかわる機能分子の同定と，その変化動態解析， ６）核磁気共鳴画像法（MRI）による上皮の評価， ７）唾液分泌に関わる機能分子の探索同定と局在の 微構造解析，等を行っており，これらは複数の研究 者単位で構成される研究ユニットによって運用・構 成されている。以下に，研究ユニットの概要と，そ の研究展開の現状を示す１−１２） 。 １）口腔ガン研究グループ 非侵襲的に採取できる唾液を検体とし，代謝物質 の変動から口腔癌マーカーの検出を試みた。生後４ 週のヌードラットに口腔癌由来細胞を移植し，３週 後に唾液を採取し，メタボローム解析を行った。ま た同時に血漿を採取し，同解析を行い，唾液におけ る変動との相関性を検索した。口腔癌細胞移植ラッ ト の 唾 液 で は methionine sulfoxide（１． ９倍），uro-canic acid（１．９倍），ornithine（１．３倍）が高い値を示 し，trimethylamine N-oxide が低い値を示した（０．７ 倍）。特に ornithine は血漿中でも高値を示した。Or-nithine は乳癌や前立腺癌の血漿中や口腔癌患者の 唾液中の RNA において高値で検出されることか ら，バイオマーカー候補になると考えられた。 また，口腔粘膜診察用機器をモデルとして，簡易 で精度の高い口腔癌早期スクリーニング装置の開発 を行っている。 ２）インプラント周囲上皮研究グループ 4-Nitoroquinoline 1-Oxide（4NQO）を用いた口腔癌 の自然発癌モデルラットにインプラントを埋入し た。肉眼的・病理組織学的所見において，過去の報 告のとおり口蓋正中の後方部には悪性を思わせる所 見がみられたが，インプラント周囲口腔粘膜には明 らかな癌の所見は認められなかった。そこでインプ ラントが口腔粘膜にどういった影響を及ぼすのかを 網羅的な遺伝子解析を行い，正常な口腔粘膜上皮と 比べ，インプラント周囲上皮に特異的な遺伝子を検 索することとした。現在採取した組織の RNA の量 および質の評価を行なっている。インプラント周囲 上皮及び天然歯周囲上皮からのクオリティーの高い RNA の抽出に成功しているが，そのスタートサン プルに問題を有している。その問題を解決するため インプラントデザインの変更及び，実体顕微鏡を用 いたサンプリングを行いスタートサンプルの最適化 に取り組んでいる。 ３）放射線研究グループ 機能イメージングである FLAIR 画像および拡散 強調画像の機能評価性能についてファントム評価を 行った。FLAIR 画像では唾液や血液といった比較 的高い T2 値を有する組織での評価に有用であるこ とが分かった。拡散強調画像では撮像パラメータの 調整により ADC 値による組織識別能が向上するこ とが分かった。今後は高分解能表面コイルによる口 腔粘膜上皮の画像化，機能イメージングとの融合に ついて行う予定である。 ４）上皮膜輸送研究グループ 三叉神経節ニューロン培養細胞におけるアデノシ ン３リン酸（ATP）受容体である P２X 受容体発現を 検索し，それらの受容体活性化によって細胞内に流 入した Ca２＋ が Na＋ -Ca２＋ 交換輸送体（NCX）によって 細胞外へ排出されていることを明らかにした。 象牙質への外的刺激と関連する象牙質形成過程な

平成２３年度 東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ

⑴研究進捗状況報告

６８５

らびに歯髄・象牙質感覚の受容機構における象牙芽 細胞の感覚上皮細胞としての役割を検索した。そ の結果，象牙芽細胞において，transient receptor potential（TRP）family である TRPM8・TRPA1 およ び浸透圧感受性 TRP チャネル（TRPV1，TRPV2， TRPV4）発現が示された。同様に，上皮における遅 順応性感覚受容器であるメルケル細胞にも浸透圧感 受性 TRP チャネル発現が見られた。また，メルケ ル細胞の歯周組織炎症性反応下における細胞動態を 明らかにするために歯周炎動物実験モデルの作成を 試みた。ラット下顎第一臼歯部にキャラジェニン （carrageenin）浸漬絹糸を週に１回，３週間挿入し， 歯槽骨の状態をマイクロ・コンピュータ断層撮影装 置で撮影，計測した。その結果実験群ではコント ロール群に比較して優位に骨の吸収が観察された。 キャラジェニンを用いた本モデルは歯周炎実験モデ ルとして有用であることが示唆された。 加えて，唾液腺細胞の Ca２＋ 排出機構を明らかに するために，K＋ 非依存性（NCX），および K＋ 依存性 （NCKX）Na＋ -Ca２＋ 交換輸送体の発現を検討した。免 疫組織学的に，NCX1，NCX2，NCX3，NCKX1， NCKX2，NCKX3 が，三大唾液腺の筋上皮細胞， 腺房細胞，導管細胞に認められた。これらの結果 は，NCX・NCKX が，唾液分泌過程における Na＋ 再吸収と Ca２＋ ／K＋ 分泌に関連することを示唆してい た。また，三大唾液腺の全てに，TRPM8，TRPA1， TRPV1，TRPV3，TRPV4 チャネル発現が認めら れ，特に，TRPM8 の作動薬が顎下線唾液分泌を濃 度依存的に有意に抑制した。今後，TRPM8 の活性 と唾液分泌の関係を考察する。 Ⅰ型糖尿病マウスにおける唾液腺障害に対する治 療方法についての検討を行った。組織修復効果が あるとされる BMP7 ならびに組織障害効果のある Gremlin を用いて，唾液腺に対してどのような影響 があるのかを調べた。結果として，BMP7 は糖尿病 障害性唾液腺に対して唾液分泌回復効果があること がわかった。このことから，BMP7 は唾液腺障害の 治療に有用であることがわかった。 ②口腔上皮組織を支配する三叉神経節（痛覚特 異的ニューロン群）の特性解明 黒田英孝 カルシウムイオン（Ca２＋ ）は生体内におけるシグナ ル伝達機構に関与しており，細胞内・外 Ca２＋_濃度 は一定に保たれている。侵害刺激や神経障害，炎症 文 献

１）Yamamoto H, Muramatsu T, Shibukawa Y, Sohn WJ, Kim JY, Tazaki M : Alteration of the cytokeratin expres-sion during palatine rugae development in mice. Journal of Hard Tissue Biology ２０：１７∼２２，２０１１．

２）Haku K, Muramatsu T, Hara A, Kikuchi A, Hashimoto S, Inoue T, Shimono M. Epithelial cell rests of Malassez modulate cell proliferation, differentiation and apoptosis via gap junctional communication under mechanical stretch-ing in vitro. Bulletin of Tokyo Dental College ５２：１７３∼ １８２，２０１１．

３）Muramatsu T, Ryu MH, Hashimoto S, Lee SH, Kim J, Shimono M. Dysplastic odontogenic cyst with the mani-festation of inflammatory radicular cyst ­a case report­ Korean Journal of Oral & Maxillofacial Pathology ３５：１９５ ∼２００，２０１１．

４）Sakamoto J, Sasaki Y, Otonari-Yamamoto M, Nishikawa K, Sano T. Diffusion-weighted imaging of head and neck with HASTE : influence of imaging parameters on image quality, Oral Radiology.

５）Yamamoto H, Yokoyama M, Tamura H, Okumura S, Kawada E, Kuboyama N. Carrageenin-induced periodon-titis as an experimental model in rats analyzed by micro-computerized tomography, Journal of Hard Tissue Biol-ogy, ２０：２２７∼２３２，２０１１．

６）Shibukawa Y. Cortical mechanism of oral somatosen-sory function Journal of Oral Biosciences, in Press. ７）Kato Y, Muramatsu T, Kato M, Shibukawa Y, Shintani

M, Mimura M. Magnetoencephalography Study of Right Parietal Lobe Dysfunction of the Evoked Mirror Neuron System in Antipsychotic-Free Schizophrenia PLoS ONE, ６：e２８０８７，２０１１．

８）Shibukawa Y Ca２＋_{Channels in Odontoblasts Journal of}

Oral Biosciences, ５２：３７１∼３７７，２０１０． ９）Zheng C＊

, Shinomiya T＊

（＊

equal contribution, co-first author）, Goldsmith CM, Di Pasquale G, Baum BJ. Con-venient and reproducible in vivo gene transfer to mouse parotid glands Oral Dis., １７：７７∼８２，２０１２．

１０）Sawaki K, Shinomiya T, Okubo M, Tsukagoshi E, Ogane M, Matsuura M, Yoshikawa M, Kawaguchi M. Proteomic Analysis of Lipopolysaccharide-treated Sub-mandibular Gland in Rat Bull Tokyo Dent Coll., ５２：３１∼ ７，２０１２．

１１）Tsukagoshi E, Kawaguchi M, Shinomiya T, Yoshikawa M, Kawano T, Okubo M, Sawaki K. Diazepam Enhances Production of Diazepam-Binding Inhibitor（DBI）, a Nega-tive Saliva Secretion Regulator, Localized in Rat Salivary Gland J Pharmacol Sci., １１５：２２１∼９，２０１２．

１２）Miyashita T, Okubo M, Shinomiya T, Nakagawa K, Kawaguchi M. Pregnenolone biosynthesis in the rat sali-vary gland and its inhibitory effect on secretion. J Phar-macol Sci. １１５：５６∼６２，２０１２．

東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ ６８６

等は，様々な受容体を介して細胞外より細胞内へ Ca２＋ を流入させる。その内の１つに ATP 受容体が あげられる１） 。アデノシン三リン酸（ATP）は，細胞 内ではリン酸化基質として細胞機能を維持する一 方，細胞外では細胞間情報伝達物質として機能す る。ATP 受 容 体 は 細 胞 外 ヌ ク レ オ チ ド（ATP， ADP，UTP，UDP など）をアゴニストとする細胞 膜上の受容体で，イオンチャネル型 P2X 受容体と GTP 結合タンパク質共役型 P2Y 受容体に大別で き，侵害刺激に伴う急性疼痛や炎症サイトカインの 放出などを介した慢性痛の発現に関与する２，３） 。脊髄 後根神経節や脊髄グリア細胞においては，その生理 学的，神経病理学的役割は多く報告されているが， 三叉神経領域における ATP 受容体の発現や，役割 に関する報告は限られている４） 。 これまでに我々は，ラットより三叉神経節ニュー ロンを急性単離・初代培養５，６） を行い，fura-2 を用い た Ca２＋ イメージング法やリアルタイム RT-PCR 法７，８） を行い，三叉神経節ニューロンにおける P2X 受容体 の検索を行ってきた。その結果，三叉神経節ニュー ロンには P2X 受容体のサブタイプである P2X１， P2X３，P2X４，P2X７が存在することが明らかとなり， 侵害受容の一部を担うことが示唆された９） 。 侵害刺激はこれら P2X 受容体などを介して，細 胞外から細胞内へ Ca２＋ を流入させる１） 。神経細胞に おいて，細胞内 Ca２＋_{濃度は増加すると神経の興奮・} 疼痛を誘発するが，過負荷になると細胞死を引き起 こす１０，１１） 。そのため，細胞膜上には細胞内 Ca２＋ の排 出機構が備わっている。細胞膜上の細胞内 Ca２＋ 排 出機構として，一般的に ATP 加水分解のエネル ギーを利用して Ca２＋ を細胞外へ排出するカルシウ ムポンプや，Na＋ -Ca２＋ 交換輸送体（以下 NCX）が知 られている。NCX は細胞内外のナトリウムイオン （Na＋ ）の濃度勾配を利用して Ca２＋ を細胞外へ排出す る順行性輸送を行うが，心筋虚血再灌流障害などの 病的状態においては逆行性に転じ，細胞外 Ca２＋ を 細胞内へ取り込む１２） 。心筋細胞や中枢神経系におけ る NCX の生理学的または病理学的役割は多く報告 されているものの，末梢神経領域，特に三叉神経に 関する報告は限られている１３） 。 そこで，ラット三叉神経節細胞における NCX 発 現とその機能の検索をリアルタイム RT-PCR 法， 免疫組織化学染色法，Ca２＋ イメージング法を用いて 検討を行った。その結果，口腔組織由来三叉神経節 細胞には機能的な NCX が存在し，それらは神経細 胞の細胞体や樹状突起，軸索いずれの部位にも局在 していることが明らかになった。侵害刺激，神経障 害，炎症による細胞外より細胞内へ流入した Ca２＋ は，NCX を通じて細胞外へ排出され，三叉神経節 ニューロンのカルシウムホメオスタシスにおける重 要な役割を担っている可能性が示唆された。 今後さらなる三叉神経節細胞における他の ATP 受容体，特に P2Y 受容体や，さらなる NCX 機能 の検索を遂行し，痛覚受容タンパク質特性，炎症性 物質による調節過程，シナプス長期増強と口腔粘膜 上皮における侵害受容性疼痛や神経障害性疼痛等に ついて考察していく。 文 献

１）Khakh, B. S. & North, R. A. P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease.Nature ４４２，

５２７∼５３２（２００６）．

２）Wirkner, K., Sperlagh, B. & Illes, P. P2X3 receptor in-volvement in pain states. Mol. Neurobiol. ３６，１６５∼１８３

（２００７）．

３）Burnstock, G. P2X receptors in sensory neurones.Br J

Anaesth ８４，４７６∼４８８（２０００）．

４）Burnstock, G. Purines and sensory nerves. Handb Exp Pharmacol ３３３∼３９２ （２００９）．doi：10.1007/978-3-540-79090-7_10

５）Sahara, Y. Gotoh, M., Konno, K., Miwa, A., Tsubokawa, H., Robinson, HP., Kawai, N. A new class of neurotoxin from wasp venom slows inactivation of sodium current.

Eur. J. Neurosci. １２，１９６１∼１９７０（２０００）．

６）Gotoh, M., Noro, N. & Sahara, Y. Kinetic properties of tetrodotoxin-sensitive and tetrodotoxin-resistant sodium channel currents in neonatal rat trigeminal ganglion neu-rons.J. Med. Dent. Sci. ４９，４３∼５５（２００２）．

７）Livak, K. J. & Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））Method. Methods ２５，４０２ ∼４０８（２００１）．

８）Schmittgen, T. D. & Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C（T）method. Nat Protoc ３，１１０１∼１１０８（２００８）．

９）Kuroda, H., Shibukawa, Y., Soya, M., Masamura, A., Ka-sahara, M., Tazaki, M., Ichinohe, T. Expression of P2X1

and P2X4 receptors in rat trigeminal ganglion neurons.

Neuroreport, July ９．（Epub）

１０）Herchuelz, A., Kamagate, A., Ximenes, H. & Van Eylen, F. Role of Na/Ca exchange and the plasma membrane Ca2+

-ATPase in beta cell function and death.Ann. N. Y. Acad. Sci. １０９９，４５６∼４６７（２００７）．

１１）Bano, D. & Nicotera, P. Ca2+

signals and neuronal death in brain ischemia.Stroke ３８，６７４∼６７６（２００７）．

１２）Blaustein, M. P. & Lederer, W. J. Sodium/calcium ex-change : its physiological implications. Physiol. Rev. ７９，

③Ⅰ型糖尿病マウスにおける BMP7 と Grem-lin の発現動態

四宮敬史 目 的：Bone morphogenetic protein（BMP）はTGFβ のファミリーに属するタンパク質で，サブタイプの BMP7 は糖尿病による臓器機能不全を軽減すること が腎臓，網膜などで報告されている１） 。我々はすで に糖尿病態下における唾液腺の分泌機能低下に対し て BMP7 が改善する効果があることを報告した。 一方，gremlin は DAN 遺伝子ファミリーに属する タンパク質で，BMP7 と受容体を拮抗することが報 告されている。近年，gremlin が糖尿病腎症で増加 し，糖尿病性線維症の原因となることが明らかにさ れた１） 。我々の研究では，BMP7 の隔日投与を一週 間続けると唾液分泌低下が改善した２） 。糖尿病にお いてはインスリン不足，インスリン感受性の低下は， 糖代謝異常を引き起こし，全身の症状としては，多 尿，全身脱水が生じる。唾液腺においては，唾液腺 細胞で受容体変化，細胞シグナリング変化により水 分泌，アミラーゼ分泌減少が，脂肪蓄積，細胞構造 変化により耳下腺肥大が生じる。これらは口腔乾燥 症，感染症，齲蝕，歯周病などの原因になることか ら，糖尿病性唾液腺障害においては，唾液腺の分泌 機能の改善が重要となる。先述の通り，BMP7 が糖 尿病態下における唾液腺分泌機能低下に対して改善 効果があるが，gremlin が悪化させる可能性がある ことから，BMP7 と gremlin が唾液腺において相互 的に作用していることが考えられる。そこで本研究 では，唾液腺組織（耳下腺，顎下腺，舌下腺）の糖尿 病ストレスに対する抵抗性の違いと，糖尿病態下に おける BMP7 ならびに gremlin の変動を調べた。 方 法：動物は４週齢の雄性 ddY マウスを用いた。 マウスは生理食塩液投与群，ストレプトゾトシン投 与群（STZ），ストレプトゾトシン・インスリン投与 群（STZ/INS）の３群に分けた。生理食塩液投与群 には生理食塩液を２週間腹腔内投与，STZ ではス トレプトゾトシン６０mg/kg を腹腔内に単回投与， STZ/INS ではストレプトゾトシン６０mg/kg を腹腔 内に単回投与７日後から１４日後にかけてインスリン を１日２回，６U/kg を腹腔内投与した。糖尿病の 評価は，尿試験法と血糖値の測定により行った。糖 尿病による組織構造の変化は，オイルレッド O 染 色にて行った。各群の臓器摘出は，初回投与１４日後 に行った。臓器摘出後，絶対定量的 RT-PCR 法に て組織での BMP7 と gremlin mRNA 発現の解析を 行った。細胞の mRNA 発現は，レーザーマイクロ ダイセクション法による細胞回収後に絶対定量的 RT-PCR 法にて解析を行った。絶対定量的 RT-PCR 法では，１，０００βアクチン当たりの mRNA 量をコ ピー数で算出した。 結 果：ストレプトゾトシンを投与したマウスで は，投与７日目には尿試験紙で尿糖陽性で，血糖値 が４００mg/dl を超えていた。糖尿病マウスの耳下腺 では脂肪滴沈着が見られたが，顎舌下腺では沈着は 見られなかった。絶対的 RT-PCR 法による mRNA 解析では，BMP7 は耳下腺に多く存在し，gremlin はどの組織にもほぼ同等に存在すること，管上皮細 胞に多く分布することが明らかになり，糖尿病スト レス下の唾液腺組織では，耳下腺，顎下腺，舌下腺 の腺房細胞，導管細胞において BMP7 の著しい減 少が見られたのに対して，gremlin の顕著な増加が 観察されたが，インスリン投与により BMP7 の増 加，gremlin の減少が見られた（図）。 考察および結論：糖尿病マウスの耳下腺において脂 肪滴沈着が見られた。これはトリグリセリドの沈着 によるものと考えられている。顎舌下腺に見られな かった理由としては，構造の違いであると考えられ るが明らかではない。糖尿病マウスでは，BMP7 減 少と gremlin 増加が認められ，糖尿病マウスにイン スリン投与を行うと，BMP7 増加と gremlin 減少が 認められた。これらの結果から，BMP7 が糖尿病を 改善，gremlin が増悪させることがわかった。これ は，BMP7 の ALK 受容体への結合が gremlin によ り抑制されている上に，発現が減少し，組織の障害 が起こりやすい状態になっていることを裏付けるも のである。 ７６３∼８５４（１９９９）．

１３）Gover, T. D., Moreira, T. H. V., Kao, J. P. Y. & Wein-reich, D. Calcium homeostasis in trigeminal ganglion cell bodies.Cell Calcium ４１，３８９∼３９６（２００７）．

文 献

１）Wang S. N., Lapage J., Hirschberg R. : Loss of tubular 東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ

④ラット唾液腺における侵害受容タンパク質 TRP channels の発現と機能検索 Ubaidus Sobhan，佐藤正樹 序 論：唾液は消化液としての作用の他，口腔粘膜 の保護や洗浄，殺菌，抗菌，排泄などの作用があ り，緩衝液としての作用はう蝕の予防にも関与して いる。そのため，唾液の分泌が抑制されるシェーグ レン症候群などは，口腔内恒常性が維持できなくな ることで，様々な全身性疾患の原因となることが知 られている。一方，唾液の分泌は自律神経系により 支配されていることが知られているが，外的・内的 要因による分泌の促進・抑制についてはほとんど明 らかにされていない。そこで生体に広く分布し，口 腔内においても多くのサブファミリーが発現する侵 害 受 容 膜 タ ン パ ク 質 transient receptor potential （TRP）channels に注目した。TRP channels はポリ モーダル膜タンパク質としての性質を持つため，発 現部位による活性条件など不明な点が多い。本研究 は唾液腺における TRP channels の発現検索を行 い，さらに唾液分泌との関係を検索した。 方 法：TRP channels の発現検索にはオスのウィ スターラット（２５０ g B.W.）を用いた。ラットは麻酔 後舌下腺，顎下腺および耳下腺を摘出し，４％パラ ホルムアルデヒドで固定した。各腺はパラフィンも しくは OCT コンパウンドで包埋し，抗原抗体法を 用いて蛍光染色した。機能検索には９週齢のオスの ウィスターラット（ST）を用いた。麻酔後，背臥位 に固定したラット頸部を切開して，顎下腺の動脈， 静脈と唾液腺導管にシリコンチューブを挿管した。 細胞外液にはハンクス緩衝液を用い，各試薬溶液は 動脈側から顎下腺を経て，静脈へと０．５ ml／分で潅

bone morphogenetic protein-7 in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Nephrol., １２⑾，２３９２∼９，２００１．

２）Izumi M., Watanabe M., Sawaki K., Yamaguchi H., Kawaguchi M. : Expression of BMP7 is associated with resistance to diabetic stress : comparison among mouse salivary glands. Eur J Pharmacol., ３１；５９６（１∼３）：１∼ ５., ２００８．

図 三大唾液腺の腺細胞における BMP7 と Gremlin mRNA の局在

流した。唾液分泌を誘導するために１０−６ M カルバ コールによるムスカリン受容体刺激を行った。TRP channel 関連試薬の影響は，分泌された唾液の重量 を測定し，カルバコール刺激により分泌された唾液 重量に対する割合として評価した。 結 果：全ての唾液腺と唾液腺を構成する細胞（腺 房細胞，筋上皮細胞と導出管細胞）において，熱温 感受性のあるvanilloid subfamilyのTRPV１とTRPV４ の発現が見られた。また冷感受性のある melastatin subfamily の TRPM８，ankyrin subfamily の TRPA１ の発現が見られた。顎下腺への灌流刺激は，熱感受 性のあ る TRPV１の ア ゴ ニ ス ト（１μM，capsaicin） は分泌を増加し，冷感受性のある TRPM８のアゴニ ス ト（０．５μM，WS１２）及 び TRPA１の ア ゴ ニ ス ト （１００μM，allyl isothiocyanate）は唾液分泌量を減 少した。体温付近に活性をもつ TRPV４のアゴニス ト（１μM，RN‐１７４７）は分泌量に有意な変化を示さ なかった。 考 察：唾液腺における水分泌は，アセチルコリン による細胞内 Ca２＋ の増加によることが既に知られ ている。検索した TRP channels は，Ca２＋ を選択的 に細胞内に取り込むことが報告されている。一方， TRPM８と TRPA１を介した細胞内 Ca２＋ の増加は唾 液分泌を有意に抑制した。TRPM８と TRPA１を含 め，TRP channels は 複 数 の 刺 激 を 受 容 す る ポ リ モーダル膜タンパク質であることが知られている。 唾液腺に発現する TRP channels の生理的条件下に おける活性については不明な点が多く，検索を行っ た温度感受性の TRP channels の活性閾は TRPV４ の２７−３５℃付近を除き，TRPV１は４３℃付近，TRPM８ は２５−２８℃付近，TRPA１は１７℃付近となっており， 核心温度と大きく異なる（図１）。そのため唾液分泌 が温度依存的に増加，減少する可能性は少ないと考 えられる。一方，唾液分泌を抑制するシェーグレン 症候群，炎症関連メディエーターである ATP やブ ラジキニンによる TRP channels の閾値低下が示唆 されており，唾液腺における各 TRP channels の活 性物質および条件については，さらなる検討が必要 である。TRP channels の活性機構の解明は，唾液 分泌を減少させるシェーグレン症候群の治療につな がる可能性がある。今後は TRP channels の生体活 性物質の同定が必要であり，Ca２＋ 以外の陽イオンの 細胞内挙動についても検索が必要である。また唾液 腺 と 同 じ 外 分 泌 器 官 で あ る 膵 臓 の 腺 ガ ン で は TRPM８の過剰発現が報告されている。他の TRP channels においてもガンによる過剰発現の報告が ある。しかし唾液腺ガンにおける TRP channels の 検索はまだ報告がなく，この研究は唾液腺と TRP channels を繋ぐ全く新しい研究であり，TRP chan-nels が病態のマーカーになる可能性が示された。 口腔内における TRP channels の発現・機能の両面 からの検索は，基礎と臨床を繋ぐ非常に重要な研究 である。 ２．免疫機能・トランスレーショナル研究グ ループ ①概要説明 グループリーダー 阿部伸一 上皮組織を標的とした病態因子により進行する歯 科口腔疾患の制御を目的とし，動的な生理・病態代 謝過程における細胞組織の超微構造変化を解析す る。また上皮組織の常態維持とその破綻機構ならび に上皮免疫機構に関して検討する。以上の内容を５ つのグループに分れ研究を遂行している。 １）細菌感染における細胞の動態に関する研究 我々は，これまで病原性に関与しないとされてき た口腔レンサ球菌の一部が口腔上皮細胞へ付着侵入 する能力を持ち炎症性応答を生じさせることを明ら かにした。そこで付着侵入能力に関与すると考えら 図１ 温度感受性 TRP channels（富永真琴，日本生理学会 誌 ２００３より改図） 東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ ６９０

れる菌体表層タンパクのうち，線毛 pili の機能を検 討している。 ２）細菌における免疫回避機構の解明 歯周病原菌の歯周ポケット内での生息を優位にさ せているポケット上皮への付着，バイオフィルム形 成機構などの定着様式について，さらには上皮バリ アーの破壊，上皮細胞への侵入機構のメカニズムを 解析している。 ３）炎症性サイトカインに対する細胞動態の研究 ヒト歯根膜細胞において低濃度 TGF-β1 において のみ骨分化が促進され，低濃度・複数回および高濃 度で TGF-β1 を投与すると骨分化が抑制されること を明らかにした。 ４）上皮・間葉ハイブリッド型細胞シートの創製 口腔粘膜細胞シートと骨格筋細胞シートをハイブ リッドさせた積層シートの開発を試みている。現在 我々は，両シート接着部分の構造維持に必須なタン パクの発現について検証している。 ５）生体素材に対する上皮免疫回避に関する研究 抗酸化アミノ酸誘導体は生体材料の生体親和性を 向上させる効果を有するとともに，細菌増殖抑制効 果も有することが示され，骨移植で用いられるコ ラーゲンスキャッホルドへ応用することで，上皮細 胞内への病原性細菌の侵入を防ぎ，骨再生部位への 細菌感染を予防できることを明らかにした。 【これまでの業績】

１）Shima H, Matsuzaka K, Kokubu E, Inoue T. Regenera-tive capability of dental pulp cells after crown fracture. Dental Traumatology 2012.［in press］

２）Khan SZ, Kokubu E, Matsuzaka K, Inoue T. Behavior of rat cultured dental pulp cells in 3-D collagen type-1 gel in vitro and in vivo. Australian Endodontic Journal, An-aerobe 2012.［in press］

３）Hosaka Y, Saito A, Maeda R, Fukaya C, Morikawa S, Makino A, Ishihara K, Nakagawa T. Antibacterial activ-ity of povidone-iodine against an artificial biofilm of Por-phyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum. Arch

Oral Biol, 2012（in press : doi : 10.1016/j.archoralbio. 2011.0 9.005）．

４）Abe S, Suzuki M, Cho K-H, Murakami G, Cho B-H, Ide Y. CD34-positive developing vessels and other structures in human fetuses : an immunohistochemical study. Surgi-cal and Radiologic Anatomy, 33, 2012.（in press） ５）Abe S, Kikuchi R, Nakao T, Cho B-H, Murakami G, Ide

Y. Nerve Terminal Distribution in the Human Tongue Intrinsic Muscles : An Immunohistochemical Study Using Mid-term Fetuses. Clinical Anatomy, 24, 2012.（in press） ６）Yang J-D, Hwang H-P, Kim J-H, Rodríguez-Vázquez J,

Abe S, Murakami, G. Development of the rectus

abdomi-nis and its sheath in the human fetus. Yonsei Medical Journal, 2012.（in press）

７）Nakao T, Abe S, Cho K-H, Yamamoto M, Yamane S, Murakami S, Ide Y. Site-dependent characteristics in sympathetic nerve fibers running along muscle-inner-vating nerves : an immunohistochemical and morphomet-rical study using donated elderly cadavers. European Journal of Anatomy, 2012.（in press）

８）Okahashi N, Okinaga T, Sakurai A, Terao Y, Nakata M, Nakashima K, Shintani S, Kawabata S, Ooshima T, Nishihara T.Streptococcus sanguinis induces foam cell

for-mation and cell death of macrophages in association with production of reactive oxygen species. FEMS Microbiol Lett. ３２３：１６４∼１７０，２０１１．

９）Satake Y, Higa K, Tsubota K, Shimazaki J. Long-term Outcome of Cultivated Oral Mucosal Epithelial Sheet Transplantation in Treatment of Total Limbal Stem Cell Deficiency. Ophthalmology, １１８：１５２４∼１５３０，２０１１． １０）Ishizaki K, Sugita Y, Iwasa F, Minamikawa H, Ueno T,

Yamada M, Suzuki T, Ogawa T. Nanometer-thin TiO２

en-hances skeletal muscle cell phenotype and behavior. Int J Nanomedicine ６：２１９１∼２２０３，２０１１．

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②Treponema denticola の細胞侵入に対する Malassez 上皮遺残細胞の細胞動態

国分栄仁 偏性嫌気性スピロヘータであるTreponema denti-cola は，Porphyromonas gingivalis お よ び Tannerella forsythiaとともに慢性歯周炎病巣から高頻度に検出 される。T. denticola の病原性として組織内への侵 入性，プロテアーゼによる組織破壊１，２） ，あるいは 免疫抑制および増殖抑制３） など挙げられ歯周炎の発 症に関与している。また，歯周病原性細菌を中心と した口腔内バイオフィルム細菌は，誤嚥による呼吸 器感染症や細菌性心内膜炎など様々な全身疾患を起 こすことが知られている４） 。今回の研究では，T. den-ticola の上皮細胞に対する病原性を明らかにするた め，T. denticola の病原性遺伝子欠損株を用い，マ ラッセ上皮遺残細胞に対する作用を分子学的および 組織学的に検索した。 細胞はブタ由来マラッセ上皮遺残細胞を７継代培 養したものを用いた。細胞は１週間培養後，T. denti-cola の 野 性 株（ATCC35405），表 層 プ ロ テ ア ー ゼ （PrtP）あ る い は Major outer sheath protein（Msp）

欠損株の３種をそれぞれ MOI 1：１００（Multiplicity of Infection）となるように細菌数を調整して感染さ せた。感染３０分，３，６，１２および２４時間後に培養 細胞から mRNA を採取し，RT-PCR 法にて Inter-leukin（IL）6，IL-1，β-defensin-2，heat shock protein 70（HSP）および NOD-1 mRNA 発現量を検索した。 また，細胞を固定後，走査型電子顕微鏡（SEM）に て形態観察を行い，さらに蛍光免疫法にて IL-1，IL -2，HSP70 の１次抗体を用いてタンパク発現を共焦 点レーザー顕微鏡にて観察した。さらにT. denticola の感染をリアルタイムで観察する為，GFP ラット から採取した培養口腔粘膜上皮に感染させて蛍光顕 微鏡にて撮影を行った。 SEM による組織学的観察では，感染３０分後から T. denticola が細胞内に侵入する像や，細胞と培養 皿との間に潜り込む像を観察した（Fig. 1）。蛍光抗 体法による観察では，IL-6 タンパク発現量は非感染 細胞と比較すると野性株を感染させた場合に強く発 現が認められ，DMSP 株では若干発現を認めた。BD

have plasticity and potential utility for cell therapy. Hu-man Cell, ２４：３０∼３４，２０１１．

２０）Yamada M, et al. Enhancement of adhesion strength and cellular stiffness of osteoblasts on mirror-polished ti-tanium surface by UV-photofunctionalization. Acta Bio-mater. ６：４５７８∼４５８８，２０１１．

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東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ ６９２

-2 タンパク発現は，野性株で発現を認めた。また， HSP70 の発現はすべての群においてタンパク発現 を 認 め た。RT-PCR 法 を 用 い た 検 索 で は，IL-1 mRNA 発現量は全ての群，期間においても変化は 認められなかったが，IL-6 mRNA は感染群におい て６時間例で非感染群と比較すると有意差を持って 高い値を示した。また，BD-2 mRNA 発現量は野性 株を感染させた２４時間例で有意差を持って高い値を 示し，それにつづき DMSP 群の２４時間例で増加が 認められた。HSP70 mRNA 発現量は，感染後３時 間例で増加し，６時間をピークに有意差を持って増 加したが，ピークの値は感染群で差は認められな かった。NOD-1 mRNA 発現量 は 感 染 に よ り 増 加 し，欠損株では発現量が増加した。リアルタイムに よる共焦点レーザー顕微鏡を用いた観察では，細胞 からT. denticola が脱出するように出てきている像 を認めたが，細胞と菌体の一部がつながったままで あった（Fig. 2）。 T. denticola の表面に存在す る MSP お よ び prtP は外膜を形成する主要タンパクであり，上皮細胞に 対して付着因子および細胞障害性因子としての機能 が あ る５，６） 。今 回 の 実 験 で はT. denticola 野 性 株 の ATCC35405，dentilisin 欠 損 株 の K1，Msp 欠 損 株 の DMSP を用いてマラッセ上皮遺残細胞に対する 病原性を検索した結果，IL-6 発現量が野性株の感染 後１時間でピークを示し，HSP70 は感染後３時間 から増加した。prtP および msp 欠損株共に HSP70 mRNA 発現は減少し，IL-2 発現は msp 欠損株で減 少した。これらの結果より，T. denticolaは感染によ りマラッセ上皮残遺細胞のストレスタンパクおよび サイトカイン産生を引き起こし，そのプロセスに Msp および PrtP が関与する事が示唆された。 http：//mic.sgmjournals.org/content/early/2012/ 02/07/mic.0.055939-0.abstract ③ N-アセチルシステインの組織再生のための 創傷感染予防効果 山田将博 Ⅰ．目 的 創感染は組織再生や生体材料埋入術を成功させる 文 献

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Fig. 2 共焦点レーザー顕微鏡にて観察後，imaris にて画 像処理

Fig. 1 SEM による形態学的観察

うえで最も重要な問題の一つである。黄色ブドウ球 菌（S. aureus）は代表的な創感染菌として知られて おり，骨移植材料をはじめとする生体内へ埋入され た生体材料の細菌感染の主要な原因菌と考えられて いる。生体材料の細菌感染を防ぐために，生体材料 埋入部位上の軟組織閉鎖促進が効果的である。 細胞内活性酸素種（ROS）レベルの上昇と抗酸化物 質レベルの低下によって引き起こされる酸化ストレ スは様々な疾患の発症と進行に関与する。紫外線や 放射線の照射，有害な化学物質や細菌感染に細胞が 曝されると細胞内 ROS が過剰に産生され，グルタ チオン（GSH）をはじめとした細胞内抗酸化物質を著 しく消費する。酸化ストレスはファゴサイトーシス とも関連する。創感染菌は細胞のファゴサイトーシ スメカニズムを利用して細胞内へ侵入することも知 られ，ファゴサイトーシス過程 で ROS 発 生 が 生 じ，マクロファージや線維芽細胞および骨芽細胞に おいて，酸化ストレスを介した細胞死や機能障害が 引き起こされる。 抗酸化アミノ酸誘導体（AAD）は，直接的に ROS を消去し，かつ，短時間で細胞内に取り込まれ GSH の前駆物質に代謝されることで細胞内抗酸化物質の 供給する，細胞内外で働く強力な抗酸化剤である。 加えて，過去の細菌学的研究で，AAD は Staphylo-coccus epidermidis，StaphyloStaphylo-coccus warneri，Strep-tococcus pneumonia，Acinetobacter baumannii と いった各種グラム陽性および陰性菌のバイオフィル ム形成を抑制することが報告されている。また， AAD は咽頭上皮細胞への肺炎連鎖球菌やインフル エンザウィルスの侵入を防ぐ効果を示すことが細胞 培養実験で示されている。そのため，AAD は，黄 色ブドウ球菌をはじめとする代表的な創感染菌に抗 菌活性を示すこと，生体材料に応用した際創感染菌 の存在下でも細菌感染を防止し，組織形成細胞の酸 化ストレスや細胞死，機能障害を防ぎ，材料上の組 織再生を促進することが考えられる。本研究の目的 は，AAD は S. aureus に対して抗菌活性を示すか ど う か，ま た，AAD を 添 加 し た コ ラ ー ゲ ン ス キャッホルド上の歯肉線維芽細胞または骨芽細胞 は，S. aureus との共培養下においても，細菌感染 や酸化ストレス，細胞死，機能障害から保護され， 細胞外基質を産生するかどうかに関して検証するこ とである。 Ⅱ．方 法 黄色ブドウ連鎖球菌（Staphylococcus aureus 209 菌株：S. a）を Brain Heart Infusion（BHI）で培養し た。各 種 濃 度 の AAD 溶 液（０，２．５，５．０，１０．０ μM）を培地中に滴下した。培養４，８，１２時間後の 培地中の ATP 活性を測定し，AAD 未添加培地中 の値と比較して菌増殖を評価した（n＝３）。ラット 口蓋歯肉から採取した歯肉線維芽細胞または大腿骨 骨髄から採取した骨芽細胞を AAD 含浸もしくは非 含浸させたコラーゲン膜またはスポンジ上にそれぞ れ 播 種 し，Multiplicity of infection（MOI）が６．２５と なるように菌懸濁液を滴下し菌−細胞共培養モデル とした。歯肉線維芽細胞培養においては，培養１日 後に DCFDA による細胞内 ROS レベルの定量およ び培養２日後，７日後に Calcein による付着生存細 胞数の定量を行った。また，播種前に CTC 生菌染 色でラべリングした菌を同様の MOI で添加し，共 培養一日後に，Calcein-CTC 二重染色を併用した共 焦点レーザー顕微鏡観察および the standard anti-biotic protection assay を行うことで，細胞への S. a の感染程度を評価した。骨芽細胞培養において は，培養７日後のアルカリフォスファターゼ（ALP） 染色を行い，培養２１日後に von Kossa 染色を行っ た（n＝３）。 Ⅲ．結果と考察 AAD 未添加のS. a 菌培養液中の ATP 活性は１２ 時間培養後に２００倍に増加した（図１）。一方，AAD 添加菌培養液中では，AAD 濃度依存性に ATP 活 性の増加は抑えられた。１０．０μM の AAD 添加培地 の ATP 活性は AAD 未添加培地中の値の３０％程度 にとどまった（図１）。菌共培養２日後および７日後 図１ 東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ ６９４

の CM 上の生存歯肉線維芽細胞数は，非菌共培養 中の値の３０％未満にとどまった。しかし，AAD を コラーゲン膜へ事前添加することで，菌共培養下に も関わらず，膜上の生存付着細胞数の低下は抑えら れた。菌共培養２日後および７日後の AAD 添加コ ラーゲン膜上の生存細胞数は，AAD 未添加膜の値 よりもそれぞれ２倍および３．７倍大きく，非菌共培 養の値と同程度であった。培養１日目の生存線維芽 細胞内 ROS レベルは，非菌共培養のコラーゲン膜 上よりも，菌共培養下の AAD 未添加膜上で１．６倍 であった。AAD 事前添加は細菌による細胞内 ROS 産生を非菌共培養の値と同程度のレベルにまで抑え た。培養１日後の共焦点レーザー顕微鏡２次元観察 により，菌共培養下の，AAD 未添加膜上の Calcein 陽性線維芽細胞は小さな球形を呈し，CTC でラベ ルされた菌で満たされた（図２）。対照的に，AAD 添加膜上では，線維芽細胞は比較的大きく伸展して おり，CTC の細胞集積はほとんど認められなかっ た（図２）。線維芽細胞中の CTC 蛍光強度は AAD 添加膜上よりも未添加膜上で１５倍以上大きかった。 コラーゲンスポンジ上の ALP 陽性面積率は７日 間菌と共培養した骨芽細胞培養中で２％だった。一 方，菌と共培養した AAD 含浸コラーゲンスポンジ 上は５０％の ALP 陽性面積率を示し，非菌共存培養 中の値と同程度であった。培養２１日目において，コ ラ ー ゲ ン ス ポ ン ジ 上 で の 骨 芽 細 胞 培 養 中 の von Kossa 陽性面積率は，非菌共存培養下の９０％とは大 きく異なり，菌共存培養下では２５％程度であった（図 ３）。しかし，AAD のスポンジへの事前添加によ り，AAD 含浸コラーゲンスポンジ上の値は菌共存 培養下にもかかわらず９０％の von Kossa 陽性面積 率を示した（図３）。 本研究結果により，抗酸化アミノ酸誘導体は，膜 や骨移植材料をはじめとするスキャッホルドに含有 させることで，黄色ブドウ連鎖球菌などの創感染菌 の増殖抑制およびそれら細菌による細胞内酸化スト レスの防止により，歯肉組織や骨組織の再生障害を 引き起こす細菌感染と細菌感染性の細胞死および細 胞機能障害を防ぎ，骨再生に有用な細菌感染予防効 果を有することが示された。上述の結果に，化膿性 連鎖球菌への効果や他の細胞生物学的実験結果を追 加し，原著論文としてまとめ，Biomaterials 誌で紙 上発表した（The inhibition of infection by wound pathogens on scaffold in tissue-forming process us-ing N-acetyl cysteine. Yamada M, Ishihara K, Ogawa T, Sakurai K. Biomaterials. 2011 Nov；３２

図２

図３

：８４７４∼８５．）。今後，肺炎連鎖球菌や歯周病原性 細菌などの他の菌種への静菌効果や口腔粘膜上皮へ の感染予防効果を検証したい。 また，この抗酸化アミノ酸誘導体は骨移植材料や レジン材料をはじめとした生体材料の細胞親和性を 著しく亢進させることが判明し，その全容は複数の 国際雑誌に投稿し掲載済みである。さらに，このア ミノ酸誘導体は，直接的に骨芽細胞の骨基質産生能 および石灰化能発現のレベルと速度を著明に向上さ せることが判明しており，現在投稿論文を作成中で ある。このように，抗酸化アミノ酸誘導体は，その ユニークな薬理学的作用により，生体材料を多機能 化する可能性が示されており，今後，抗酸化アミノ 酸誘導体を応用した Smart Bone Biomaterial の開 発を行っていく。

東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ ６９６