新規vacuolar ATPase阻害薬の薬理学的研究
-vacuolar ATPaseのサブタイプの存在の可能性とそ
の阻害薬の骨吸収亢進疾患に対する有用性-著者
新倉 和明
号
497
発行年
2005
URL
http://hdl.handle.net/10097/15789
氏
名(本
籍)
学 位
の 種 類
学 位 記 番 号
学 位 授 与 年 月 日
学 位 授 与 の 要 件
に い く ら かず あ き新
倉
和
明
博
士(薬
学)
薬
第497号
平
成18年1,月18日
学 位 規 則 第4条 第2項 該 当
学 位 論 文 題
目
新 規vacuolarATPase阻
害 薬 の 薬 理 学 的 研 究 一vacuolarATPase
の サ ブ タ イ プ の 存 在 の 可 能 性 とそ の 阻 害 薬 の 骨 吸 収 充 進 疾 患
、
に 対 す る 有 用 性 一
論 文 審 査 委 員
授
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教
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葡
住
雄
章
康
和
内
沼
泉
大
永
大
論 文 内 容 要 旨
骨 で は 絶 え ず 骨 形 成 と骨 吸 収 が 繰 り返 され て い る が,両 者 が バ ラ ン ス を と っ て い る こ とで 骨 量 は 維 持 され て い る 。 骨 粗 嶺 症 を 始 め と した 骨 減 少 を 伴 う様 々 な 疾 患 は,そ の 引 き 金 と な る 要 因 は 異 な っ て い て も,最 終 的 に は 骨 吸 収 量 が 骨 形 成 量 を 上 回 る こ と に よ っ て 引 き 起 こ され る 。 従 っ て,骨 形 成 を 阻 害 す る こ と な く,骨 吸 収 を 抑 制 す る こ と が で き れ ば 多 く の 骨 吸 収 充 進 疾 患 に 対 し て 有 益 で あ る と思 わ れ る 。 骨 吸 収 過 程 に お い て,骨 表 面 に 破 骨 細 胞 が 接 着 し た 後,そ こ に 酸 性 環 境 が 作 り出 され る こ とが 骨 の 主 要 成 分 で あ るcoHagenとhydroxyapatiteの 分 解 に 重 要 な 意 味 を 持 っ て い る 。 液 胞 型ATPase(V-ATPase)は, 破 骨 細 胞 の 細 胞 膜 上 に 存 在 し,Arpの エ ネ ル ギ ー を 基 にH+を 放 出 し,酸 性 環 境 を作 り出 す 役 割 を 担 っ て い る 。 し か し,V-ArPaseは 破 骨 細 胞 の 細 胞 膜 の み な らず 広 く 分 布 し て お り,そ の 阻 害 薬 の 臨 床 応 用 は V-ArPaseに 対 す る 選 択 性 が 鍵 と な る 。 本 研 究 で は 骨 吸 収 抑 制 を 目 的 と し た 新 規 構 造 を 有 す るV-ATPase 阻 害 薬(FR化 合 物;FR167356,FR202126)の 薬 理 研 究 を 通 し,化 合 物 に よ るV-ArPase阻 害 の 選 択 の 実 現 が 可 能 で あ る こ と を 示 す と と も に,臨 床 応 用 へ の 改 良 点 を 明 ら か に した も の で あ る 。 第1章V-ATPase阻 害 薬 の 各 種H+輸 送 性ArPaseに 対 す る 阻 害 作 用 マ ウ ス 破 骨 細 胞 の 細 胞 膜(V-ATPase),マ ウ ス 肝 臓 ミ ト コ ン ド リ ア 内 膜(F-ArPase)及 び ウ サ ギ 胃 粘 膜 ミ ク ロ ソー ム(P-ATPase)を 用 い,H+輸 送 活 性 を 測 定 した 。 本 研 究 で 用 い たFR化 合 物(FR167356, FR202126)はV-ArPaseのH+輸 送 活 性 を 濃 度 依 存 的 に 阻 害 す る 一 方,V-ArPaseのH+輸 送 活 性 を100 %抑 制 す る 濃 度 に お い て もF一 及 びP・ATPaseを 全 く 阻 害 せ ず,新 し い 骨 格 を 有 す るV-ATPase特 異 的 な 阻 害 薬 で あ る こ と が 示 さ れ た 。V-ArPaseは 多 く の サ ブ ユ ニ ッ トか ら構 成 され て お り,湖rP分 解 活 性 (ATPase)部 位 に よ っ て 得 ら れ る エ ネ ル ギ ー を 基 にH+輸 送 部 位 でH+輸 送 を 行 っ て い る 。FRI67356は V-ArPaseのArPase活 性 を 阻 害 した の で,FR167356のH+輸 送 阻 害 作 用 はATPase活 性 の 阻 害 に 基 づ く こ と が 判 明 し た 。 一 方,破 骨 細 胞 の 細 胞 膜 以 外 のV-ArPaseに 対 して もFRI67356は 阻 害 作 用 を 示 し た が, そ れ ら の 中 で ラ イ ソ ソー ム のV一 湖rPaseに 対 す る 阻 害 作 用 は 破 骨 細 胞 の 細 胞 膜 のV-ArPase阻 害 作 用 に 比 べ て 弱 か っ た 。 こ の こ と は ,FR167356がV-ATPase阻 害 作 用 に お い て ラ イ ソ ソー ム のV-ArPaseに 対 す る 阻 害 は 弱 い と い う選 択 性 を 持 ち,既 報 のV-ATPase阻 害 薬(SB242784)に は な い 特 徴 を 有 し て い る こ と が 示 され た 。 そ れ と 同 時 に ラ イ ソ ソー ム のV-ArPaseは 他 のV-ArPaseと は 異 な っ て お り,V-ArPase に は サ ブ タ イ プ が 存 在 す る こ と が 示 唆 され た 。 第2章 細 胞 レベ ル で のV-ATPase阻 害 選 択 性 の 検 証 ま ず,一 過 性 に 酸 性 化 さ せ た 破 骨 細 胞 か ら のV-ATPase活 性 に 基 づ くH+放 出 を,細 胞 内pHを モ ニ タ ー す る こ と で 測 定 し た。 こ の 細 胞 内pH変 化 をFRI67356が 阻 害 し た こ と か ら,FRI67356は 細 胞 レ ベ ル で も 破 骨 細 胞 の 細 胞 膜 のV-ArPaseを 抑 制 で き る こ と が 示 さ れ た 。 次 に,破 骨 細 胞 のV-ArPaseのin vitroで の 機 能 に 対 す る 作 用 を 調 べ た 。 新 生 児 マ ウ ス の 頭 蓋 冠 器 官 培 養 系 に お い て,PTHを 添 加 す る と骨 吸 収 が 充 進 し て 培 地 中 のCa濃 度 が 上 昇 す る が,こ れ をFR化 合 物 は 阻 害 し た 。 さ ら に,invitroで 分 化 させ た 破 骨 細 胞 を 象 牙 切 片 上 で 培 養 して 形 成 さ れ る 骨 吸 収 窩 形 成 を,FR167356は 抑 制 し た 。 以 上 よ りFR化 合 物 は 破 骨 細 胞 の 細 胞 膜 のV-ArPaseを 阻 害 す る こ と に よ り,invitroの 骨 吸 収 を 抑 制 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 次 に,マ ク ロ フ ァー ジ に お け るLDL由 来 のcholesterolester蓄 積 あ る い は 肝 細 胞 に お け る LDL分 解 を 測 定 し,細 胞 レベ ル で の ラ イ ソ ソ ー ム のV-ArPaseの 機 能 に 対 す るFR茎67356の 作 用 を解 析 し た 。FR167356は,V-ArPaseに 基 づ く破 骨 細 胞 のinvitro機 能 を ほ ぼ100%抑 制 す る濃 度 に お い て も, cholesterolester蓄 積 あ る い はLDL分 解 に 対 し て は 弱 い 抑 制 効 果 し か 示 さ な か っ た 。 従 っ て,FR167356 は 細 胞 レベ ル に お い て も ラ イ ソ ソ ー ム のV-ArPaseを 阻 害 す る 作 用 は 弱 く,第1章 に 述 べ た 結 論 が 細 胞 レベ ル に お い て も 再 現 され た 。 第3章 骨 吸 収 抑 制 薬 と し て のV-ATPase阻 害 薬 の 特 徴 一 既 存 薬 との 比 較
ま ず,FR化 合 物 はPTH以 外 のIL-1あ る い はIL-6に よ るinvitroの 骨 吸 収 も 阻 害 し,骨 吸 収 因 子 に 左 右 さ れ な い 骨 吸 収 阻 害 作 用 が 確 認 され た 。 次 に 骨 吸 収 阻 害 薬 と し て 既 に 臨 床 応 用 さ れ て い るelcatonin 及 びbisphosphonateとFR化 合 物 の 作 用 をinvitro及 びinvivoの 実 験 で 比 較 し,V-ArPase阻 害 薬 の 特 徴 に つ い て 解 析 した 。 頭 蓋 冠 器 官 培 養 系 に お い て,い ず れ の 化 合 物 と も 骨 吸 収 抑 制 作 用 を 示 し た が, bisphosphonateと 培 養 し た 頭 蓋 冠 は,そ の 後 薬 剤 を 培 地 中 か ら 除 去 して も 骨 吸 収 が 抑 制 され た ま ま で あ っ た 。 こ れ はbisphosphonateが 骨 に 強 い 結 合 力 を 持 っ て い る こ と に 起 因 す る と考 え られ,bisphosphonate に 暴 露 され た 骨 で は 骨 代 謝 回 転 が 停 止 し て し ま う恐 れ が あ る と考 え られ た 。 一 方,FR化 合 物 を 除 去 す る と 阻 害 作 用 は 発 現 せ ず,骨 吸 収 阻 害 はFR化 合 物 の 存 在 に 依 存 し て い た 。 次 に,雌 性 ラ ッ トの 甲 状 腺, 副 甲 状 腺 及 び 卵 巣 を 摘 出 し,Ca制 御 を 行 う 内 因 性 の ホ ル モ ン を枯 渇 さ せ,そ こ へretinoicacidを 投 与 す る こ とで 高 カ ル シ ウ ム 血 症 モ デ ル を 作 製 し,invivoで の 骨 吸 収 阻 害 作 用 を 調 べ た 。 こ の モ デ ル に お い て FR化 合 物 を 経 口 投 与 す る と,投 与 後 よ り経 時 的 に 血 清Ca濃 度 が 低 下 し,invivoに お い て も速 や か に 骨 吸 収 阻 害 効 果 を 示 す こ と が 示 唆 され た 。 一 方,bisphosphonateは,単 回 投 与 で は 有 効 性 を 示 さず,連 続 投 与 に よ っ て の み 作 用 を 示 し,骨 吸 収 抑 制 効 果 の 発 現 が 遅 い こ と が 明 ら か に な っ た 。 ま た,ペ プ チ ドホ ル モ ン の 誘 導 体 で あ るelcatoninは,経 口投 与 が で き ず,注 射 に よ る 投 与 し か 行 え な い た め,速 や か な 骨 吸 収 抑 制 効 果 は 表 れ る も の の,そ の 持 続 時 間 が 非 常 に 短 か っ た 。 以 上 の よ うに,FR化 合 物 は 骨 へ の 蓄 積 性 の な い 点 及 び 即 効 性 で 薬 効 が 持 続 す る 点 で,bisphosphonateやelcatoninよ り も優 れ て い る こ と が 示 唆 さ ' れ た 。 第4章 骨 粗 霧 症 モ デ ル ラ ッ トの 骨 密 度 減 少 に 対 す るV-ATPase阻 害 薬 の 作 用 骨 粗 嶺 症 に お け る 骨 量 低 下 は 骨 吸 収 充 進 が 原 因 で あ る と さ れ て お り,ラ ッ トの 卵 巣 摘 出 に よ る 病 態 モ デ ル でFRI67356を 評 価 し た 。 骨 粗 嶺 症 モ デ ル に お け る 骨 量 減 少 に 対 し,FR167356の 投 与 は 著 し い 改 善 効 果 を 示 し た 。FR167356は,骨 吸 収 マ ー カ ー で あ る 尿 中deoxypyhdinolineレ ベ ル を 低 下 させ,ま た 骨 形 態 計 測 の 結 果 と合 わ せ て 考 え る と,FR167356に よ る 骨 量 回 復 は 骨 吸 収 抑 制 に よ っ て も た ら され た と考 え
られ た 。SB242784で もFR167356と 同 様 に 骨 量 回 復 が 認 め られ た が,体 重 増 加 抑 制 や 血 漿 生 化 学 検 査 に お け る 異 常 が 誘 発 され た 。 しか し,FR167356で は そ の よ う な 所 見 は 認 め られ ず,そ れ は ラ イ ソ ソ ー ム の V一湖rPaseに 対 す る 阻 害 作 用 が 弱 い た め で あ る 可 能 性 が 示 唆 され た 。 ま た,正 常 ラ ッ トにFR167356を 投 与 し た 場 合 で も 骨 量 増 加 が 認 め られ,FR167356は 骨 形 成 に は 影 響 を 及 ぼ さず,骨 吸 収 の み を 抑 制 で き る こ と が 示 唆 さ れ た 。 第5章 歯 周 病 モ デ ル ラ ッ トの 歯 槽 骨 破 壊 に 対 す るV-ATPase阻 害 薬 の 作 用 V-ArPase阻 害 薬 の 他 の 疾 患 へ の 適 応 を 探 る 目 的 で 歯 周 病 モ デ ル で の 歯 槽 骨 破 壊 に 対 す る 作 用 を 調 べ た 。 雄 性 ラ ッ トの 下 顎 第 一,第 二 臼 歯 間 にwireを 挿 入 し,炎 症 に 基 づ く歯 槽 骨 破 壊 モ デ ル を 作 製 し た 。 本 モ デ ル に お い てFR202126を 経 口投 与 す る こ と に よ り,歯 糟 骨 の 破 壊 を 抑 制 で き る こ と が 明 らか に な っ た 。 一 方 ,collagenase阻 害 作 用 を 基 に 臨 床 で 歯 周 病 に 用 い られ て い るdoxycyclineは,本 モ デ ル に よ る 歯 槽 骨 破 壊 を 全 く 抑 制 で き な か っ た 。 第6章 血 液 酸 塩 基 平 衡 に 対 す るFR化 合 物 の 作 用
.FR化 合 物 はinvitroで 腎 臓 のV-ArPaseに 対 して も 阻 害 作 用 を有 し て い た た め,invivoで そ の 阻 害 効 果 が ど の よ うな 影 響 を 及 ぼ す か に つ い て 解 析 し た 。 腎 臓 のV-ATPase機 能 はH+排 泄 を 司 る こ とか ら,血 液 の 酸 塩 基 平 衡 を 指 標 と し て 調 べ た 。 そ の 結 果,FR167356あ る い はFR202126を ラ ッ トに 投 与 して も, 血 液 の 酸 塩 基 平 衡 に 影 響 を 与 え な か っ た 。 従 っ て,腎 臓 のV-ArPaseを 阻 害 し て もinvivoに お い て は 他 の 機 構 が 補 う こ と に よ り,血 液 の 酸 塩 基 平 衡 に 影 響 を 与 え な い と 考 え られ た 。 本 研 究 を 通 じ,新 規 構 造 を 持 つV-ATPase阻 害 薬FR167356は 破 骨 細 胞 の 細 胞 膜 のV-ArPaseを 強 く 阻 害 す る も の の ラ イ ソ ソ ー ム のV-ATPaseに 対 す る 阻 害 作 用 が 弱 い と い う選 択 性 が あ る こ と が 示 さ れ た 。
こ の こ と は 同 時 に ラ イ ソ ソー ム のV-ArPaseは 他 のV-ATPaseと は 異 な る 構 造 を 有 し て お り,V」ArPase に は サ ブ タ イ プ が 存 在 す る こ とが 示 唆 され た 。 骨 吸 収 に 至 る ま で の 過 程 が ど の よ う な も の で あ ろ う と も, V-ATPaseは 骨 吸 収 の 最 終 過 程 に 関 与 し て い る た め,FR化 合 物 は 様 々 な 因 子 に よ る 骨 吸 収 を 顕 著 に 阻 害 す る こ と が で き た 。 ま た,既 存 の 骨 吸 収 阻 害 剤 と 比 べ て,優 れ た 特 徴 を 有 す る こ と も 明 ら か に な っ た 。 こ の 様 な 骨 吸 収 阻 害 作 用 に 基 づ き,FR化 合 物 は 骨 粗 籟 症 モ デ ル に お け る 骨 量 低 下 や 歯 周 病 モ デ ル に お け る 歯 槽 骨 破 壊 を 抑 制 す る こ と が で き た 。 一 方,FR化 合 物 を 投 与 し て も 血 液 の 酸 塩 基 平 衡 は 影 響 さ れ な か っ た こ と か ら,腎 臓 のV-ATPaseを 阻 害 す る こ と はinvivoに お い て は 大 き な 問 題 に は な ら な い こ と が 示 唆 され た 。SB242784も 骨 粗 霧 症 モ デ ル ラ ッ トに 投 与 す る と骨 量 改 善 作 用 を 示 した が,副 作 用 所 見 も 随 伴 し た 。 こ れ は,SB242784はFR化 合 物 と は 異 な り,ラ イ ソ ソ ー ム のV-ArPaseも 阻 害 し,V-ArPase阻 害 に お い て 選 択 性 が な い た め で あ る と考 え られ る 。 特 に ラ イ ソ ソー ム のV-ArPas6の 役 割 を 考 慮 す る と, V-ArPase阻 害 薬 の 臨 床 応 用 に お い て ラ イ ソ ソ ー ム のV-ArPase阻 害 作 用 と の 分 離 を 行 う こ と が 重 要 で あ る こ とが 示 唆 され た 。
審 査 結 果 の 要 旨
液 胞 型ArPase(V-ATPase)はArPの エ ネ ル ギ ー を 基 にH+を 輸 送 す る 酵 素 で,細 胞 外 へ のH+排 出 や 細 胞 内 小 器 官 を 酸 性 化 す る 役 割 を 通 じ,さ ま ざ ま な 生 理 作 用 に 関 わ っ て い る 。V-ArPaseのsubunitに は subtypeが 存 在 し,そ の 局 在 に つ い て も組 織 特 異 性 が あ る こ と が 報 告 され 始 め て い る こ とか ら,申 請 者 は 細 胞 あ る い は 細 胞 小 器 官 特 異 的 なV-ATPase阻 害 薬 を 見 い 出 す こ と が で き れ ば,特 定 の 生 理 機 能 を 抑 制 す る 作 用 機 序 を 持 っ 新 規 治 療 薬 を 開 発 す る こ と が で き る 可 能 性 を 考 え た 。 本 研 究 に よ り申 請 者 が 見 い 出 し たV-ATPase阻 害 薬 のFRI67356は,新 規 の 構 造 を 有 す る だ け で は な く IysosomeのV-ArPaseに 対 す る 阻 害 が 弱 く,こ れ ま で に な い 阻 害 選 択 性 の あ る 化 合 物 で あ る 。 そ の 特 性 を 解 析 す る に 当 た り,申 請 者 は 最 も 適 切 な 測 定 系(H+輸 送 系)を 導 入 し,さ ら に 細 胞 レ ベ ル で の 確 認 も 行 う な ど 系 統 立 っ た 解 析 を 行 っ て お り,そ れ に よ っ て 得 られ た 結 果 に は 十 分 な 信 頼 性 が あ り,ま た 得 ら れ た 結 果 に 対 す る 考 察 は 大 変 優 れ た も の で あ る 。 申 請 者 は,従 来V-ATPase阻 害 選 択 性 が あ る と報 告 さ れ て い たSB242784に は 阻 害 選 択 性 が な い こ と を 明 ら か に し,さ ら にFR167356を 用 い た 解 析 結 果 か ら, 薬 理 学 的 解 析 に よ っ て も 細 胞 内(pV-ATPaseにsubtypeが 存 在 す る こ と を 示 す こ と に 始 め て 成 功 し た 。 す な わ ち,lysosomeのV-ArPaseを 構 成 す るsubunitの 中 で 他 のV-ArPaseと は 異 な るlysosome特 異 的 とも い うべ きsubunitの 有 無 に つ い て は,KOマ ウ ス の 報 告 と免 疫 組 織 学 的 研 究 の 報 告 に 矛 盾 点 が あ り明 確 な 見 解 は 得 られ て い な か っ た が,申 請 者 が 行 っ たFR167356を 用 い た 解 析 結 果 は,薬 理 学 的 な 見 地 か ら lysosomeに 特 異 的 なsubunitが 存 在 す る こ と を 予 見 し た も の で あ る 。 V-ArPase阻 害 薬 の 治 療 薬 と し て の 可 能 性 に つ い て,申 請 者 は 骨 吸 収 充 進 疾 患 に 着 目 し,FR化 合 物 に はinvitro及 びinvivoの 実 験 系 で 骨 吸 収 阻 害 作 用 が あ る こ と を 示 した 。 ま た,骨 吸 収 充 進 疾 患 の 代 表 的 な 疾 患 で あ る 骨 粗 嶺 症 及 び 歯 周 病 の そ れ ぞ れ の モ デ ル を 活 用 し てFR化 合 物 の 有 効 性 を 示 す と と も に, 他 の 作 用 機 序 を も っ 既 存 の 治 療 薬 と の 比 較 を 行 い,そ れ ら に 対 す るFR化 合 物 の 優 位 性 を 明 ら か に し た 。 ま た,前 述 の 阻 害 選 択 性 の な いSB242784と の 比 較 を行 う こ と に よ り,V-ATPase阻 害 薬 を 医 薬 と し て 開 発 す る に はlysosomeのV-ATPaseを 阻 害 しな い こ とが 重 要 で あ る こ と を 示 し た 。 ま た,腎 臓 のV-ATPase を 阻 害 し て も 代 償 機 構 が 働 く た め に 生 体 に は 影 響 が な い こ と を 示 す こ とに よ り,臨 床 応 用 す る こ と が 可 能 なV-ArPase阻 害 薬 の 特 性 に つ い て 明 ら か に し,こ の 分 野 の 研 究 の 今 後 の 発 展 の た め に 役 立 っ 大 き な 研 究 成 果 を 残 し た 。 以 上,一 連 の 研 究 成 果 を鑑 み,本 論 文 は 博 士(薬 学)の 学 位 論 文 と し て 合 格 と認 め る 。
