メキシコイトスギ培養細胞中で生産されるモノテル ペン類

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

メキシコイトスギ培養細胞中で生産されるモノテル ペン類

藤田, 弘毅

九州大学大学院農学研究院森林資源科学部門

松永, 洋子

ハリマ化成

https://doi.org/10.15017/11064

出版情報：九州大学極低温実験室だより. 5, pp.3-8, 2004-08. Cryogenic Laboratory, Faculty of Science, Kyushu University

バージョン：

権利関係：

メキシコイトスギ培養細胞中で生産されるモノテルペン類

大学院農学研究院森林資源科学部門 藤田弘毅

       （株）ハリマ化成 松永洋子

要旨

       A ncvel moneterpeite， （IS， 2S， 6S）ww（＋）一i，6rmepgxy−4（8）一p−

meE）then−2−gl， was isolated frcm an elicitGrwwtreated cell cultxj］re ef

Cifpressifs 2ifsitaftica （Mexican cypress）． Teit kitowit monoterpenes ne limeBene，

myycene， B−ocimenc， sabineite， terpinolene， 4−terpineel， c￥一terpineo｝，

4（8）一pwweeentheR−1，2−die｝， 4−hydrexyphellaftdric acid methy｝ester aftd 5−

thujapliciit methylethey 一 were a！so identified． Regieselective ncetabolisms

ef mgpaterpenes were ebserved in this cglture．

   エリシターを作用させたメキシコイトスギ（Cmprsssas 2usitanica）培養 細胞が生産するモノテルペンを同定した。既知のテルペン類、1imeitene， myrceRe，

6−ecimene， sabinene， terpinelenq 4−terpineol， g−terpineol， 4（8）一p−

meitthen−1，2−diol， 4−hydrexyg）heXardric acid met｝r｝ylester， B−tha」gjag）1iciR

methyle￡herとともに未報告のモノテルペン、（1S，2S，6S）一 （＋）一1，6−epoxy−

4（8）一p−me ntken−2−olが見いだされた。本培養細胞におけるテルペン類の代謝 反応はレギオ選択的であった。

L はじめに

   メキシコイトスギ培養細胞がヒノキチオール（β 一一tY｝ujapliciR）を生産す

ることは既に報告されている1 4。ヒノキチオールはトロボロン骨格というユニ ークな構造を持ったモノテルペンであり、様々な生理活性を持つことが知られ ている5。その生合成においては、ゲラニルニリン酸を出発物質とし、多くの モノテルペン生合成で見られる場合と同様に6員環モノテルペンを中間体とし て生成すると示唆されている6−7。この生合成経路を決定するに当たり、さらな

る知見を得るべくこの細胞が生産するモノテルペン類の同定を試みた。

2．実験

  B5固体培地上で4週間毎に植継ぐことで維持した培養細胞を実験に用い た。既報に従い3・ 8、部分精製した酵母抽出物をエリシターとして、ヒノキチオ

ール生産能を上げる改変B5液体培地で、8日間、25℃、暗所、72rpm

でしんとう培養を行った。培養後、培地と細胞は別々にジエチルエーテルで抽 出し、必要ならばNaOHaqあるいはHCIaqによる分画を行い、 GC蒲S（Shimadz｛g QP−500◎）分析を行った。一部モノテルペンは標品とのリテンションタイムお よびMSスペクトルの比較により同定を行った。標品との一致が得られなかっ

たサンプルについては、三相および逆相HPLCを用いて単離し、 MSスペク

トルおよびNMR（JEOL AL−400）スペクトルから同定を行った。また、揮発 性物質をトラップする能力がある臨glyo19を培地に加えて同様の実験を行った。

そのとき、謹glyolはシリカゲルカラムクロマトグラフィーで除去した。

xo

Me ＝g 3．結果考察

  メキシコイトスギ培 養系のジエチルエーテル

抽出物から順相HPLC

を用いた分画により無色 のオイル状物質が得られ

た。この物質のE1−M

Sはm／z＝168（M ）を示し

た。また、NMRデータ

（IH， 13C， DEPT， i｝1−1｝｛

COSY，撒BC，翻QC）を

Tableのようにまとめ、

Figeに示す1， 6−epoxy−

4（8）一p一鵜enthe登一2−olと

同定した。これはSTN

＋u闘

弘長

A

     ㌔

  一三慧灘紹竃駈

6

鍔亀?pξ鞠 s

   9

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4

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7 2

3

⑪闘

晦趣鞠鞠鰯搬

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窓

誤断ユΩ

Fig． Structuxe ef（IS， 2S， 6S）一（＋）一i，6−epexy−4（8）一p−menthen−2−

ol鑓d△δvalues◎f i寛s MTPA es辻ers．△δva1鵬s綴e expressed溢 Hertz （40eMHz） with underlines． CDC13 was Egsed as a soivent．

データベースにない化合物であった。さらにNeESY測定とIYi Mosher法10によ る絶対配置決定を行った。NOESY測定において、 H−6とH−10の間にクロスピー クが見られ、H−2とH−IOの間にはシグナルが見られないことから、エポキシ酸 素と水酸基の配置はむ遊紹の関係にあるとした。新Mesher法による△δ値はFig．

に示すようにH−2，H−6， H−IO側はすべて正の値であり、その反対側、 H−4， H−

5，H−8， H−9ではすべて負の値であることから、絶対配置を含め（IS，2S，6S）一

（＋）一1，6−epoxy−4（8）一p−mentheR−2−olであると決定した。旋光度は［ or ］ 58g． 3＝＋

14。9。であった。

Tab璽e 13C（豊OOMH：z）魏d lH（聡OMHz）NMR s国法幽撮da捻◎f 1，6−ep◎xy−4（8）ナme舳en−2一◎1

C SC

^{δH（」無Hz》}

^{｝IMBC NOESY}

i 60．3

2  フO．9

3 33．8

ag a 22．0

5 2g．2

6 62．2

7  豆269

g 20．3 9 20．0

互0 19．6

3．76， m

2．a4， dd （8．7， B．3）

2．4i， dd （4．9， B．4）

2．S2， dd （3．4， a 7． a）

2．64， dd （g．2， g 7 i）

3．g＆ dd （i．2， 3．4）

1．67， s

互．64，S 互．44，s

C−1， C−2， C4， C−7 C−i，C−2， C−4， C−5， C一フ，

C−a， C一一4， C−6， C−7

C−3． C4  

Cag， C−5

C−4， C−7

C−4，Cフ

C−g， C−2， C−6

H3 ct

｝1−3＃， 8

猛6，9

ff−6， 9

H一一iG 5

亙｛3α EI−S ff−6

    Miglyo！を用いない培養で、培養系のジエチルエーテル抽出物から、

4−terpineol， or 一terpiiteolがGC／MSにおいて標品との比較で同定された。さ

らに、標記との比較では不明であった物質を順相および逆相HPLCによる分

画・精製し、そのMSスペクトルおよびNMRスペクトルの既報との比較から、

4（8）一p−mentheR−1，2vedie！i ， 4thhydroxyphellandric acid methylesteri2， B−

thujaplicin methylether13が同定された。

    Miglyolを用いた培養系からは、1抽oneむe， myrcene，β 一〇cimene，

sabinene， terpinoleneがGC／MS上の標品との比較で同定された。いずれも揮

発性の高い炭化水素モノテルペンであることから、瞳gly・1が存在しない場合 は培養期間中に揮発してしまうものと思われる。

      植物の二次代謝においてはアリル位のレギオ選択的な水酸基化や、C

＝C二重結合のステレオあるいはエナンチオ選択的な酸化が報告されているK。

また、h拠G麹eneのシトクロームP−450依存酸化反応も報告されている15。今回

培養細胞中に見られた含酸素テルペン類も4−hydroxyphellandric acid

methylesterを除いてその構造はterPinoleiteが同様に酸化したものとして解 釈できる。その場合、4（8）一p一㈹th腔1，2，6−triG1の存在が予想され、また、

その可能性がGC蒲S分析において示唆されたが、完全な同定には至らなかった。

ヒノキチオールのメチル化が既に示されていることから13、4−

hydroxyphellandric acidは培養中に速やかにメチル化されるため見られなか

ったと思われる。

      これらモノテルペン類は、エリシターが存在しないときには観察され なかったことから、これら成分は植物中でヒノキチオールと同様ファイトアレ キシンとして作用していると考えられる。

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NNIR（4Ce M｝｛Z， CDCI3）， 6 ！e 25 （3ff， S）， ie 38wwle 47（1｝｛） M）， le 69（3｝｛e S）， le 7e（3ffp

s）， i．71−1．73G｝｛， m）， 1．95nt2． e7（2H， m）， 2．38−2．45（g｝｛， m）， 2．72（IH， dd，

」＝4e 2， 13e 9 HZ）g 3・45（IE｛g dd， 」＝4e 2s l i 5 ｝｛Z）； i3C−NMR （100 MHZs CDCI3） 6 2Ce 35（CH3）， 2 i e 29（CH3）， 2・6e 30（CH2）s 34e 31（CH2）， 37・60（CH2）） 73 29（C）e 76e 57（CH）， 124・85（C）， ！26e 66（C）e

［｝2］ Spectral data for 4−hydirexypheilaRdric acid methylester： EI−MS m／z

198（M ）； iH−NMR （400 MHZ， CDCI3）， 60a 95（3｝ls d， 」＝6e 8 HZ）， O・97（3H， dp 」＝7e O

｝｛Z）） 1 51−ie 58（1｝｛p M）7 1 66−le 7i（2H， M）， 2・17−2di 20（IH， M）， 2e 3e−2・37GHo nc）s 2 e 38ww 2 44（2｝1， M）， 3 e 75（3｝｛， S）， 6 e 91（1｝｛， dds 」＝17， 3．4 ｝｛Z）； i3CwwNMR

（100 MKZs CDCI3） S 16e 68（C｝E｛3）， 16・73（CH3）， 2 i 27（CH2）s 3Ce 47（CH2），

35．26（C｝｛，）， 36．93（C｝｛）， 51．50（CH，）， 71．48（C）， 129．65（C）， 136．90（CH），

167e 29 （C）e

R3］ 」． Yatwada， K Fujita and K． Sakai （20e2）． Phytcchem， 60（5）， 447−

45e．

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4（8）一P−menthen−1，2一（豊i◎亘      4一薮y dr◎xyp簸e豊亙andric aci《i me重簸y旦ester        i，6−epoxy−4（8）一p−menthen2−oi