60. エピゲノム操作の為の標的メカニズムの解明
小布施 力史
Key words：エピジェネティクス，ヒストン修飾， ヘテロクロマチン，不活性 X 染色体北海道大学
大学院先端生命科学研究院
分子細胞生物学研究室
緒 言
ヘテロクロマチンは細胞周期を通して凝縮した染色体構造であり，遺伝子の機能発現制御に深く関与していると考え られている．その主要な構成因子である HP1 はヒストン H3 のメチル化された ９番目のリジン (H3K9me3) を認識 し，様々なタンパク質との結合を介して多様な染色体機能に関与している．われわれは，ヘテロクロマチンの成り立ち と機能を分子レベルで理解するために，ヒト HP1 結合タンパク質を網羅的に探索し，82 種類を同定した．これらの因 子はエピゲノムマークであるヒストン修飾をクロマチン高次構造へと変換するのに不可欠なメカニズムを担っている． われわれは，HP1 結合タンパク質として見いだした HBiX1 が不活性 X 染色体に局在することを手がかりに，60 年以 上謎であった不活性 X 染色体の凝縮（ヘテロクロマチン化）の分子メカニズムが明らかにすることができた．同時に， ヒストン修飾や非コード RNA などの所謂エピゲノムマークが如何にクロマチン構造に変換され，如何に転写抑制に寄 与するのか，分子レベルで理解することが可能となった．今回発見した仕組みは，エピゲノムの破綻が引き起こす疾患 の理解を促すとともに，その破綻を改善するエピゲノム操作の為の標的メカニズムとして，創薬に貢献しうるものと思 われる．方法、結果および考察
男性は X 染色体を１本，女性は２本有している．X 染色体の不活性化とは，発生の初期に女性の２本ある X 染色体 のうち１本を，ほぼ全域に渡って不活性化することにより，見かけの X 染色体の数が男性でも女性でも１本とする， 巧妙な遺伝子量補償機構である．不活性化 X 染色体の研究は，染色した間期核内に，濃く染まる領域（後に'バー小体'と 呼ばれる）が雌特異的に見られるという Barr による 1949 年の報告に始まる (図１ A) 1)．その後，大野や Lyon がバー 小体は不活性化した X 染色体であるという仮説を提唱し，これまでにこの仮説が実証されて，バー小体はヘテロクロ マチン化し凝縮した不活性 X 染色体であると認識されるようになった． 上原記念生命科学財団研究報告集, 28 (2014)図 1． HBiX1-SMCHD1 複合体はバー小体の形成に必要である.
A) DNA 染色で濃く染まるバー小体（矢頭）．女性由来細胞株 hTERT-RPE1 を Hoechst (DNA)，H3K27me3 抗 体で染色．B) HBiX1 はバー小体形成に必要である．矢頭は，H3K27me3 染色から判断できる不活性化 X 染色体 領域．左端は不活性化 X 染色体上の FISH シグナル領域を拡大したもの（左）．不活性化 X 染色体の凝縮状態
るポリコーム群複合体による機構の２つが存在する．われわれは以前，H3K9me3-HP1 の機能を明らかにする目的で， HP1 と結合するタンパク質をヒト細胞から網羅的に同定した2)．この中の未知タンパク質の一つが，不活性化 X 染色
体領域に主に局在したことから，HBiX1 (HP1–binding protein enriched in inactive X chromosome 1) と名付け，解析 を進めた3)．また質量分析器を用い HBiX1 と結合するタンパク質を探索したところ，HP1 に加え，変異マウスの表現
型から X 染色体の不活性化に関わることが報告されている SmcHD1 4)のヒトホモログ SMCHD1 を同定した．これを
手がかりとして，ヒト細胞において，HBiX1 は SMCHD1 と結合し不活性 X 染色体上に濃縮していることが明らかと なった．
HBiX1 の不活性化 X 染色体における機能を明らかにするために，女性由来細胞で HBiX1 を RNAi により阻害した． HBiX1 を阻害した細胞では，バー小体が消失し，不活性化 X 染色体の凝縮がなくなることを見いだした (図 1B)．一 方，不活性化 X 染色体上の H3K27me3 修飾，XIST 局在には影響しなかった (図 1B,C)．また，SMCHD1，PRC2（実 際にはその構成因子である SUZ12），XIST をそれぞれ阻害したところ，SMCHD1 の阻害は HBiX1 を阻害した時と同 じ表現型を示したが，PRC2 を阻害した時は H3K27me3 修飾が消失するにもかかわらず，バー小体形成，不活性化 X 染色体の凝縮状態，XIST 局在に影響しなかった（図 1C）．一方，XIST を阻害した時は，H3K27me3 修飾，不活性化 X 染色体の凝縮（バー小体形成），XIST 局在といういずれの不活性化 X 染色体の特徴も見られなくなった (図 1C)．こ れらの結果を考え合わすと，HBiX1-SMCHD1 複合体は，不活性化 X 染色体の凝縮 （バー小体形成）に必要であるこ と，XIST の下流には HBiX1-SMCHD1 によるバー小体形成経路と PRC2 による H3K27me3 修飾経路の２つが独立に 存在すること，がわかった (図 1D)． 次に，バー小体は HBiX1-SMCHD1 によってどのように形成されているのか手がかりを得るために，HBiX1 や SMCHD1 を RNAi によって阻害した細胞や，変異型 HBiX1 を発現する細胞を用いて，免疫染色法による細胞観察や ChIP-seq（次世代シーケンサー法を用いたクロマチン免疫沈降）法による解析を行った3)． まず最初に，不活性化 X 染色体上におけるヒストン修飾 H3K9me3，H3K27me3 の局在を CHIP-SEQ 法により解析 したところ，既に報告があるように5)，ヒト不活性化 X 染色体上には H3K9me3，H3K27me3 それぞれが覆う領域が互 い違いに存在していた (図 2A)．また，間期細胞核を観察すると，この２つの修飾領域はそれぞれ隣り合ってまとまっ た配置をとり，XIST RNA は H3K27me3 領域に主に局在していた (図 2A)．HBiX1-SMCHD1 複合体の局在に対する相 互依存性を調べたところ，HBiX1-SMCHD1 の局在は，H3K9me3 領域に関しては H3K9me3 を認識する HP1 と HBiX1 との直接結合に依存しており，H3K27me3-XIST 領域に関しては SMCHD1 に依存していた (図 2B)．また RNA 免疫沈 降法により，HBiX1-SMCHD1 複合体は SMCHD1 を介して XIST と相互作用していることがわかった．
HBiX1-SMCHD1 複合体は，男性由来細胞でも発現しており，ChIP-seq 解析から X 染色体以外でもいくつものドメ インを形成して局在していることがわかった3)．このことは，染色体上のいたる所に，バー小体に類似したミニ不活性 化 X 染色体様構造が形成され，遺伝子発現の制御に寄与していることを示唆している．実際，SMCHD1 の変異が，常 染色体に由来する異常な転写産物によって引き起こされる顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー２型の原因の一つとして， 最近同定された6)．おそらく，HBiX1-SMCHD1 が形成するヘテロクロマチン形成が脆弱になることによるものと思わ れる． さらなる解析によって，染色体の高次構造形成によるエピジェネティックな遺伝子発現制御の解明につながることが 期待できる．また，今回発見した仕組みは，エピゲノムの破綻が引き起こす疾患の理解を促すとともに，その破綻の改 善や細胞を人為的に操るためのエピゲノム操作の標的メカニズムとして，創薬に貢献しうるものと思われる．
共同研究者
本研究は，北海道大学大学院先端生命科学研究院分子細胞生物学研究室の長尾恒治講師，野澤竜介，柴田幸子，奥田将 旭，九州大学生体防御医学研究所ゲノム機能制御学部門エピゲノム制御学分野の佐渡 敬准教授，大阪大学大学院生命 機能研究科細胞核ダイナミクス研究室の木村 宏准教授と共同で行った．最後に，本研究にご支援を賜りました上原記 念生命科学財団に深く感謝いたします．文 献
1） Barr, M. L. & Bertram, E. G. : A morphological distinction between neurones of the male and female, and the behaviour of the nucleolar satellite during accelerated nucleoprotein synthesis. Nature, 163 : 676, 1949. 2） Nozawa, R. S., Nagao, K., Masuda, H. T., Iwasaki, O., Hirota, T., Nozaki, N., Kimura, H. & Obuse C. : Human
POGZ modulates dissociation of HP1α from mitotic chromosome arms through Aurora B activation. Nat. Cell. Biol., 12 : 719-727, 2010.
3） Nozawa, R. S., Nagao, K., Igami, K. T., Shibata, S., Shirai, N., Nozaki, N., Sado, T., Kimura, H. & Obuse, C. : Human inactive X chromosome is compacted through a PRC2-independent SMCHD1-HBiX1 pathway. Nat. Struct. Mol. Biol., 20, 566-573, 2013.
4） Blewitt, M. E., Gendrel, A. V., Pang, Z., Sparrow, D. B., Whitelaw, N., Craig, J. M., Apedaile, A., Hilton, D. J., Dunwoodie, S. L., Brockdorff, N., Kay, G. F. & Whitelaw, E. : SmcHD1, containing a structural-maintenance-of-chromosomes hinge domain, has a critical role in X inactivation. Nat. Genet., 40 : 663-669, 2008.
5） Chadwick, B. P. & Willard, H. F. : Multiple spatially distinct types of facultative heterochromatin on the human inactive X chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101 : 17450-17455, 2004.
6） Lemmers, R. J., Tawil, R., Petek, L. M., Balog, J., Block, G. J., Santen, G. W., Amell, A. M., van der Vliet, P. J., Almomani, R., Straasheijm, K. R., Krom, Y. D., Klooster, R., Sun, Y., den Dunnen, J. T., Helmer, Q., Donlin-Smith, C. M., Padberg, G. W., van Engelen, B. G., de Greef, J. C., Aartsma-Rus, A. M., Frants, R. R., de Visser, M., Desnuelle, C., Sacconi, S., Filippova, G. N., Bakker, B., Bamshad, M. J., Tapscott, S. J., Miller, D. G. & van der Maarel, S. M. : Digenic inheritance of an SMCHD1 mutation and an FSHD-permissive D4Z4 allele causes facioscapulohumeral muscular dystrophy type 2. Nat. Genet., 44 : 1370-1374, 2012.
