博 士 （ 薬 科 学 ） 渡 邊 康 紀
学 位 論 文 題 名
Structural and functional analyses of receptor proteins, Atg19 and Atg34, and the membrane‑forming factor,
Atg18, in selective autophagy
（選択的 オートフ ァジーに おける受容 体 Atg19 ， Atg34 及び 膜形成因子 Atg18 の 構造機能 解析）
学位論文内 容の要旨 J
【序論】
オ ートファジ ーは出芽酵母から 高等動植物まで真核 生物において広く 保存された大規模 な 分解 システムで ある．オートファ ジーが誘導されると ，細胞質中に隔離 膜と呼ぱれる脂質 膜 構造 が出現し， 分解対象を取り囲 みながら伸長し，閉 じてオートファゴ ソームと呼ぱれる 二 重膜構造体を形 成する：その後オ ー卜ファゴソーム の外膜は液胞ノリソソームと融合し，内膜 ごと内容物は液 胞／リソソーム内 の加水分解酵素に よって分解される，オートファジーは飢餓 等に応じて細胞 質の一部を無作為 に液胞／リソソー ムに輸送し分解することで，細胞内成分の 再構 成に関わっ ている，しかし近 年，オートファジー は状況に応じてミ 卜コンドリアやべ ル オキ シソームな どのオルガネラ， タンバク質凝集体， 細胞内に侵入した バクテリアなどを 特 異的 に認識し， それらの分解，除 去にも関与している ことが明らかにな った，このような 選 択的 オートファ ジーは癌，神経変 性疾患，感染症など 様々な疾病に関与 しているが，基本 的 なメ カニズムで ある「分解対象の 認識機構」及び「オ ートファゴソーム の形成機構」に関 す る知 見 は乏 しい ． 出芽 酵母 において現在30種類以上のオート ファジー関連(Atg)夕ンパク 質 が同 定されてい る．本研究では選 択的オートファジー の基本的メカニズ ムを明らかにする た め，これらAtgタンバク 質のうち，認識に関 与するAtg19，Atg34及びオートファゴソームの形 成に関与する．Atg18に 焦点を当て，構造機 能解析を行なった ．
選択的オート ファジーにおいて 積荷が液胞／リソ ソームヘ輸送されるには積荷を認識する受 容体 夕 ンバ ク質 が 重要 な役 割を担っている ，出芽酵母では， 液胞酵素であるa‑mannosidase (Amsl)，aminopeptidaseI (Apel)は選択的オートフ ァジーによって液胞へ輸送されることが知 られており，こ れらニつの積荷の 液胞への輸送には 受容体夕ンバク質Atg19，Atg34が関与して いる ．細胞質中 でAtg19はAmsl，Apelを，Atg34はAmslを直接認識し，そ の後，Atg19，Atg34 は隔 離 膜上 に局 在 して いるAtg8と 結合 す るこ とでAmsl，Apelの選択的 囲い込みを実現し て いる ， 本研 究で はAtg19及びAtg34のAmsl結合 ドメ イ ン(ABD)を 同定 し ，両者の立体構造 を NMR法に よ り決 定し た ．ま た，Amslの 遊離 型 及びAtg34 ABD結 合型 の結 晶 構造 解析 を 行な い，Amslの詳細 な認識機構を明ら かにした．
出 芽 酵母 にお い てオ ート ファゴソームの 形成にほ少なくと も18種類のAtg夕ンパク質が 必 須で あ ると 知ら れ てい る． こ のう ちAtg18はAtg2及びホスフ ァチジルイノシトー ル3リン 酸 (PI3P)と複合体 を形成することで オートファゴソー ム形成に重要な役割を担っている，また，
Atg18はホスファチジル イノシトール3，5二 リン酸(PI(3，5)P2)と結合することで液胞膜に局 在し，液胞形態 の制御にも関与し ている．しかし，Atg18の立体構造は明らかになっておらず，
Atg18によ るAtg2及び イ ノシトー ルリン脂質の認識機 構は解明されてい ない．本研究では ， Atg18の構 造 的知 見を 得 るた めAtg18バ ラ ログ であるHsv2の結晶構造を 決定し，得られた 構 造に基づぃてAtg18の機 能解析を行なった，
【結果と考察】
1．Atg19，Atg34によるAmslの認識機構の解 明
血vff′q加vfmの解 析 によりAtg19，Atg34のC末端に存在す るAmsl結合ドメイン （ABD） を 同定し，両者の 立体構造をNMR法により決定 した，両者はよく 似たimmunog10bulin・foldを形 成しており，保 存されたループ領 域上のHis残基（Atg19H310，Atg34H296）がA恥1の認識に必 須であることを 明らかにした，
積 荷 側の 構造 情 報を 得る ため，Ams1の結 晶構造解析を行な った．n誘 導体結晶を作製し ， 多波 長 異常 散乱 （MAD） 法により 位相を決定した．構 造の精密化は213A分解能の回折デー タ を用 いて行なっ た，Amslは一次配 列上，糖質加水分解 酵素ファミリー38（（38）に属して お
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り ，Amslの 一分 子 の 構 造 は既 知 のGH38の 構 造 と よく 似 て い た が，N末 端領 域に 他のGH38 に は保 存され ていな いド メイン が存在 してい た．Amslの全体 構造 は他のGH38には 見られ な い対 称的な 四量体 を形成 して おり，Amslの四 量体の 形成に はこのN末 端ドメインが主に寄与 していた．
ABDに よ るAmslの 詳 細 な認 識 機 構 を 明ら か に す る ため ，AmslとAtg34 ABDと の 共 結 晶 化を 行なっ た．Amslの立体 構造を モデル 分子 とした分子置換法により位相を決定し，構造の 精 密 化は3.0A分 解 能 の 回 折デ ータを 用いて 行なっ た．Amsl四量体 に対 してAtg34 ABD四 分 子の 比率で 結合し ており ，そ の結合 はAtg34 ABDのimmunoglobuli小fbldの側面を介した結合 様式であった，Atg34のん11．slとの結合に直接関与しているアミノ酸残基（E257，D258，H296， W307，F309） を触aに置 換し， んmlと のmvf加pml―downassりを 行なっ た． その結 果，こ れ らの アミノ 酸残基 はAms1と の結合 に関与 して おり，溶液中でも結晶構造で見られる結合様式 で結 合して いるこ とを示 した ．触g19にお いても 同様の実験を行なったところ，概ねAtg34の 場 合 と 似 た 結 果 が 得 ら れ た ． 以 上 の 結 果 か ら ，Atg19ABD，Atg34ABDは 自 身 の immunoglobu亅imfoldの側面 を介して舳珞1を認識することを示した．また，An盤1との結合能 を欠 いた変 異体で あるAtg19F323AまたはAtg34F309Aを発現させた株ではA恥1‐GFPは液胞へ輸 送 され なかっ た．以 上の 結果か ら，舳 嶋1の認識 に必要 なAtg19，Atg34のPhe残基 は実 際に んnslの オ ー 卜 フ ァ ジ ー に よ る 液 胞 輸 送 に 関 与 し て い る こ と を 示 し た ． 2．膜形成因子Atg18の構造機能解析
Atg18の立体 構造 情報を 得るた め，出 芽酵 母の他 にも様々な生物種由来のAtg18及びそのホ モ ロ グに つ い て 結 晶化 を 試 み た ，にm鰓 洫 船 由来 のAtg18バ ラ口グ であるHsv2を用 いるこ とで 結晶を得ることに成功した．Se・Met誘導体結晶を作製し，MAD法により位相を決定した．
構 造の 精密化 は2．6A分解 能の 回折デ ータを 用いて 行っ た．Hsv2の 立体 構造は7枚 のブレ ー ドから構成するDプロベラ構造を形成していた．P13P，PI（3，5）P2との結合に関与するFIu沁配 列付近のブレード5，6にはニつの塩基性ポケットが存在しており（site1，site2），それぞれには 結晶 化母液由来の硫酸イオンと酸性残基が配位していた，このことから，sitel。site2のニつ のポ ケット にイノ シトー ルリ ン脂質 のりン 酸基が 結合す る可 能性が 示唆された，Atg18上で Hsv2のsite1，site2を 形成す るアミノ酸残基に相当する残基を変異させるとAtg18の液胞膜へ の局 在は見られなくなった，以上の結果から，site1。site2は実際にイノシトールリン脂質と の結合に関与していることを示した．
Hsv2の構造上にAtg18ホモログ間で保存されたアミノ酸残基をマッピングすると，site1，site 2が 存在す るブ レード5．6の他 にブ レード2の 領域も高度に保存されていることがわかる，ブ レ ー ド2の 保 存 さ れ た ア ミ ノ 酸 残 基 を 変異 し ， オ ー トフ ァ ジ ー 活 性を 測 定 し た 結 果，
F54削S55A変異 体及びP72削R73A変異 体発現 株にお いて 有意に オート ファジ ー活性 の減 少が 見ら れた． これら の変異 体は 正常に 液胞膜 に局在 するため，イノシトールリン脂質の結合に は影 響は無 かった ，よっ てAtg18のも うーつ の結合 相手 であるAtg2との 結合に影響がある可 能 性 があ る ， そ れ を確 か め る た め，F54剛S55A変異 体及びP72州R73A変異 体にお いてAtg2 と の 免疫 沈 降 実 験 を行 っ た ．その 結果，F54削S55A変異 体で はAtg2と の結合 は弱く なり，
P72剛R73A変異 体で は，Atg2と全く 結合し なかっ た．sitel，sitc2の変異であるH244削H315A 変 異に よるAtg2との結 合への 影響は 見ら れなか った． 以上の 結果 から，Atg18は ブレー ド2 を 介 し てAtg2と 結 合し ， ブ レ ー ド5，6はAtg2と の 結合 に は 関 与 しな い こ と を 示し た ． Atg18のプレ ード2に存 在す るF54／S55及びP72／R73は互 いにDプロ ペラ構造上の反対に位 置 して いる， このこ とか ら，Atg2は りン グ状の 構造を したAtg18の ブレー ド2の領域 を掴む よう に相互 作用し ている こと が示唆される．また，ブレード2はsitel．site2が存在するブレ ード5，6から 離れて 位置 してい る．そ のため ，Atg18がプ レード5，6の 領域を介してP13Pを 含む膜に結合してもAtg2との結合には影響が無いと考えられる，
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学 位 論 文 審 査 の 要 旨
主査 教授 前 仲 勝 実 副査 教授 木 原 章 雄 副査 准教 授 尾 瀬 農之
副査 主席 研 究員 野田 展 生 （微 生 物化 学 研 究所 ）
学 位 論 文 題 名
Structural and functional analyses of receptor proteins, Atg19 and Atg34, and the membrane‑forming factor,
Atg18, in selective autophagy
（選択 的オート ファジー における受 容体 Atg19 ， Atg34 及 び膜形成因子 Atg18 の 構造機 能解析）
博 士学位 論文審 査等の 結果 につい て（報告）
オー ト フ ん ジ ーは 飢 餓 等 に 応 じて オ ー ト フ んゴ ソ ー ム と 呼ば れ る 二 重 膜構 造 体 に よ り細 胞質 の一 部を無 作為 に取り 囲み， 液胞／ リソソ ーム に輸送 し分解 するこ とで ，細胞 内成分 の再構 成に関 わ っ て いる ． し か し 近年 ， オ ー ト フん ジ ー は状 況に応 じてオ ルガ ネラ， 夕ンバ ク質凝 集体 ，細胞 内 に 侵 入し た 細 菌 な どを 特 異 的 に 認識 し ， それ らの分 解，除 去に も関与 してい ること が明 らかに な っ た ．こ の よ う な 選択 的 オ ー ト ファ ジ ー は癌 ，神経 変性疾 患， 感染症 など様 々な疾 病に 関与し てい るが， 基本 メカニ ズムで ある「 分解対 象の 認識機 構」及 び「オ ート ファゴ ソーム の形成 機構」
に関 する知 見は 乏しい ．
著者 は こ れ ら 基本 メ カ ニ ズ ム の解 明 を 目 的とし て， 選択的 オート ファジ ーの積 荷で あるAmsl， Apelの 認 識 に 関与 す る 受 容 体Atg19，Atg34及 び オ ー 卜フ ァ ゴ ソ ー ムの形 成に関 与す るAtg18の構 造機 能解析 を行 なった ，本論 文では その研 究の 成果が 述べら れてい る，
第一 章 に お い て， 一 般 的 な 研 究背 景 ， 概 要 を述 べ た 後 ， 第二 章 で は ，Atg19，Atg34のAmsl結 合 ド メ イ ン(ABD)の 同 定 及 びABDの 構 造 機 能解 析 に つ い て述 べ ら れ て いる ， 限 定 分 解 法及 び 切 vitro pulldown assayに よ りABDを 同 定し て いる ．また ，出芽 酵母に おい てABDを欠損 させる と，
Amslは 液 胞 へ 輸送 さ れ な い が， も う ー つ の積 荷 で あ るApelの 液 胞輸 送 は 正 常 であ る こ と から，
ABDはAmslの 液 胞 輸 送 に 特 化 し て 関 わ る こ と を 示 し て い る ． さ ら にAtg19 ABD，Atg34 ABDの 立 体 構 造をNMR法に よ り 決 定 して い る ． 両 者 の構 造 は よ く 似たimmunoglobulin‑foldを 形 成し て お り ， 保 存 さ れ た ル ー プ 領 域 の 変 異 実 験 に よ り ，ABDのDEル ー プ 上 のHis残 基 がAmslの オ ー トフ ァジー によ る液胞 輸送に 重要で あるこ とを 示して いる．
第 三 章 で は 第 二 章 の 研 究を 発 展 さ せ ，ABDに よ るAmsl認識 の 詳 細 な 分子 機 構 を 明 ら かに す る た め ，Amslの 遊 離 型 及 びAtg34 ABD結 合 型 の 結 晶 構 造 解 析 に つ い て 述 べ ら れ てい る ．Amsl全 長 をPichia pastorisの系を 用いて 発現 ，精製 ，結晶 化した 後，Ptを用い た多波 長異 常散乱 法によ り そ の 構造 を2．3A分 解 能 で 決定 す る こ と に 成功 し て い る ．Amslは配 列上， 糖質加 水分解 酵素 フ ァ ミ リ 一38 (GH38)に 属 し て い る が ， 他 のGH38と は 異 な りAmslは 自 身 の ユ ニ ー ク なN末 端 ド メ イ ン を介 し て 対 称 的な 四 量 体 を 形成 し て い る ．ま た ，AmslとAtg34 ABDの共結 晶化を 行ない ， Amslを モ デ ル と し た 分 子 置 換 法 に よ りAmsl‑Atg34 ABD複 合 体 の 結 晶 構 造 を3.0A分 解 能 で決 定 し て い る ． Atg34 ABDはAmsl四 量 体 に 対 し 四分 子 結 合 し てお り ，DEルー プ だ け で はな く ， そ の 反 対 側 に 位 置 し たABル ー プ ，EFル ー プ もAmslと の 結合 に 関 与 す るこ と を 見 出 し てい る ． ABDの 点 変 異 体 を用 い たin vitro pulldown assayによ り，結 晶構造 で見 られたAmslとの 結合様 式 は 妥 当 であ る こ と を 示し て い る ， さら に ，Amsl‑Atg34 ABD複 合 体 形 成に 関 与 し て いる ア ミノ 酸
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残 基 を 変 異 す る と ，Amslの オ ー ト フ ァ ジ ー に よ る 液 胞輸 送は 抑 制さ れる こ とか ら， 結 晶構 造で 見 ら れ た 結 合 様 式 でABDはAmslを 認 識 し て い る こ と を 示 唆 し て い る ． 抗 体 な ど に 見 ら れ る 一 般 的 なimmunoglobulin‑foldは 片側 に 集合 した ル ープ 領域 を 介し てタ ー ゲッ トを 認 識す るが ，ABD は 通常 のimmunoglobulin‑foldの認 識 様式 とは 異 なり ，両 側 のル ープ を 用い た非 常にユニークな 様 式 でAmslを 認 識 し て い る ．Amsl‑Atg34 ABD複 合 体 の 立 体 構 造 は 選 択 的 オ ー ト フ ァ ジ ー の 受 容 体 に よ り 認識 され て いる 積荷 と して 初め て の構 造で あ り， この よ うな ユニ ー クな 結合 様 式を 見出 し た こ と は ， 選 択 的 オ ー ト フ ん ジ ー の 積 荷 認 識 機 構 の 解 明 に 大 き く 貢 献 す る と 考 え ら れ る ． 第 四 章 で は ，Atg18に 着 目 し ，そ のバ ラ 口グ であ るHsv2の構 造 解析 を行 な い， 得ら れ た構 造に 基 づ い たAtg18の 機 能 解 析 に つ い て 述 べ ら れ て い る ，Atg18はAtg2及 びPtdlns3Pと 複 合 体 を 形 成 する こ とで オー ト ファ ゴソ ー ム形 成に 重 要な 役割 を 担っ てい る ．ま た，Atg18はPtdIns(3，5)P2 と 結合 す るこ とで 液 胞形 態の 制 御に も関 与 して いる ． 耐熱 性酵 母Kluyveromyces marxianus由来 の Hsv2を 用 い る こ と でHsv2の 結 晶 を 得 る こ と に 成 功 し ，Seを用 い た多 波長 異 常散 乱法 に より その 結 晶 構 造 を2.6A分 解 能 で 決 定 し て い る ．Hsv2は7枚 の ブ レ ー ド （ 羽 根 ） か ら 成 るDプ 口 ベ ラ 構 造 を 形 成 し て い る ．Hsv2の 立 体構 造 に基 づい たAtg18の変 異実 験 によ り，Atg18に はブ レー ド5， 6の 領 域 に イ ノ シ ト ー ル リ ン 脂 質 結 合 領 域 が ニ つ 存 在 す る こ と ， 及 び プ レ ー ド2の 領 域 がAtg2 と の 結 合 に 重 要 で あ る こ と を 明ら か にし てい る ，ブ レー ド5．6及び ブ レー ド2は 互い に 離れ て位 置 し て い る こ と か ら ，Atg18はAtg2及 びPtdlns3Pと 同 時 に 結 合 し う る こ と を示 唆し て いる ，さ ら に ， ブ レ ー ド2の 変 異 に よ り ，Atg18の 液 胞 形 態 制 御機 能に は 影響 を与 え るこ と無 く ，オ ート フ ァ ジ ー が 特 異 的 に 抑 制 さ れ るこ と を明 らか に して いる ． これ らの 結 果か ら，Atg18は 脂質 膜上 でAtg2及 びPtdIns3Pと そ れ ぞ れ 異 な る 領 域 を 介 し て 同時 に結 合 する こと で ，オ ート フ ァゴ ソー ム 形成 に 関与 する こ とを 示唆 し てい る．
以 上 の よう に， 本 論文 は， 選 択的 オー ト フん ジー の 積荷 認識 機 構及 びオ ー トフ ァゴ ソ ーム 形成 に 関 連 す る因 子の 機 能に つい て の新 知見 を 得た もの で あり ，オ ー トフ ァジ ー の基 本メ カ ニズ ムの 解 明に 貢 献す ると こ ろ大 なる も のが ある ．
よ っ て 著 者 は ， 北 海 道 大 学 博 士 （ 薬 科 学 ） の 学 位 を 授 与 さ れ る 資 格 あ る も の と 認 め る ，
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