博 士 （ 農 学 ） 吹 谷 学 位 論 文 題 名
日本産イネいもち病菌を用いた宿主特異性及び 病原性に関わる遺伝子の同定と解析
学位論文内容の要旨
智
イネの最重要病害であるいもち病は，いもち病菌(Magnaporthe grisea)が感染することによって起こ る．いもち病菌に対するイネの抵抗性は，菌側の非病原性遺伝子によって誘導されるが，その誘導機構はま だ十分に解明されていない，また，非病原性遺伝子の変異による抵抗性品種の罹病化は，病害防除における 深刻な問題である，日本産イネいもち病菌は，病原性レース判別イネ品種の育成に用いられており，それら の持つ抵抗性遺伝子に1：1で対応する非病原性遺伝子を持っという特筆すぺき利点を持っもののの，稔性 が 低い ため ，非病原性遺伝子の解析に 必要な日本産菌系を用いた交配系は未だ確立されていな い．
また，いもち病菌は，分生子や付着器などの形態形成と，植物体内での増殖を伴う複雑な病原性サイクル を経て，病気を進行・拡大していく．これまで病原性に関連する多くの遺伝子が単離・解析されているが，
in vitroで解析が可能な分生子・付着器の解析に比べ，植物体内での増殖に関わる遺伝子の解析は，病原性 試験を伴う表現型解析の複雑さから，比較的進んでいない．
このような考え及び他研究の状況から，本論文ではいもち病菌の研究の2つの大きなテーマである宿主特 異性の解析と，病原性関連遺伝子の解析を目的として，遺伝学的な方向と逆遺伝学的な方向の両方向の実験 系を構築し，それらを用いて宿主特異性及び病原性に関わると考えられる因子を同定し，解析を行った．内 容の要約は以下の通りである．
1．日本産いもち病菌と外国産高稔性菌株Guy11を用いた交配系の確立
これまで成功例のない日本産イネいもち病菌を用いた交配系の確立を目的として，外国産高稔性株Guyll を導入して交配実験を行い，Ina168株に由来する交配クロス2107，36株を得た．遺伝マーカーの分離解析 を行った所，遺伝解析の信頼性が低いと考えられたため，戻し交配を行い，2107‑33株とGuyllの交配クロ ス5307，65株を得た．同様の解析をクロス5307で行ったところ，遺伝マーカーは全て1:1に分離した．ま た，抗生物質カスガマイシンに対する耐性遺伝子座ksglRを同定し，その座に連鎖する分子マーカー3個を 得，恕餌R座付近の遺伝地図を作成出来たが，分子マーカーの座乗する染色体は異なっていた．これらの結 果から，クロス5307を用いた染色体歩行による非病原性遺伝子のクローニングは難しいが，単一遺伝子座 の分離解析は可能であると考えられた．またクロス5307両親株のレース判別イネ品種に対する病原性の検 定を行った結果，愛知旭，クサブエ，ツユアケ，K59の4品種に対する非病原性遺伝子の遺伝解析がクロス 5307で可能であることが示唆された．
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2．いもち病菌宿主特異性変異株の変異領域の解析
1，で作成された交配系クロス5307を用いて，宿主特異性変異株の変異領域をRAPD (Random Amplified Polymorphic DNAs)法により同定し，非病原性遺伝子の遺伝子座との連鎖を調べることにより，染色体歩 行を行わずに非病原性遺伝子を単離するとぃう方法を構築し，実際に解析を試みた．まずRAPD法を用い て，イネ品種愛知旭に対する宿主特異性変異株の変異領域の同定を行い，変異株において特異的に欠失して いるDNA断片PM01を得た．PM01はゲ丿ム中で単一コピーであ り，未知のタンバク質をコードするORFの 一部を含んでいた．クロス5307交配後代における愛知旭への宿主特異性の分離を調べたところ，非病原性 と病原性の比は1：1となり，宿主特異性が1遺伝子支配であることが強く示唆された．また，サザン解析に よルクロス5307交配後代におけるPM01の分離を調べ，非病原性遺伝子座の分離との連鎖を調べたところ，
調べた21株において完全に連鎖しており，PM01を含む領域に愛知旭に対する非病原性遺伝子が存在する確 率が非常に高いと考えられた．さらにPM01領域の周辺を含めた広範囲の領域について解析を行い，宿主特 異性変異株においてPM01を含む約6.5 kbpの領域が欠失していることを示唆する結果を得た．欠失領域に は1，746 bpのORFが存在しており，新規タンパク質をコードする遺伝子と考えられた．ORFの周辺には，
反復配列やOccanと命名された新規DNA型トランスポゾンが存在しており，トランスポゾンや反復配列の関 わるゲノムの再編成がこの領域の欠失に関与している可能性が示唆された．以上の結果により，この欠失領 域 に 愛 知 旭 に 対 す る 非 病 原 性 遺 伝 子 が 存 在 す る 可 能 性 が 高 い こ と が 強 く 示 唆 さ れ た ．
3．いもち病菌のセリンプロテアーゼ遺伝子の解析
いもち病菌の病原性，特に植物体内での増殖に関わる因子として，プロテアーゼに注目し，付着器誘導期 特異的なcDNAライプラリーから，セルンプロテアーゼの一部をコードするクローンを同定し，その配列を 元にデータベース上のEST配列を利用して遺伝子特異的なプライマーを設計し，RT‑PCRにより目的の遺伝 子全長を含むcDNA断片を増幅・クローン化した．1，608 bpからなるORFの推定アミノ酸配列は，糸状菌セ リンプロテアーゼと高い相同性を示し，この遺伝子をSPM1と命名した．続いてゲノムDNAライブラリーを 構築し，約3 kbのSPM1を含むDNA断片をクローン化し，塩基配列を決定した．推定アミノ酸配列の解析を 行ったところ，シグナルベプチドの存在，他の液胞のセリンプロテアーゼとの相同性・分子量の類似，局在 予測の結果から，SPM1タンバク質は液胞に局在する可能性が最も高く，次いで菌体外排出夕ンバク質であ る可能性が最も高いと予想された．この結果を基に，種々の培地条件下でのSPM1の発現をノーザン解析・
定量PCR解析により調 べたところ，SPM1は恒常的に発現しており，窒素飢餓下で発現が上昇し，炭素飢 餓・タンパク質が単一炭素窒素源の培地下で発現が低下しており，酵母の液胞のセリンプロテアーゼの発現 バターンと類似していたことから，推定アミノ酸配列の解析結果と一致し，SPM1タンパク質は液胞に局在 するセリンプロテアーゼであると考えられた．また，サザン解析によりSPMIはいもち病菌ゲノム中で単一 コピーとして存在していることが明らかになり，今後の遺伝子破壊による形質の変化の解析が可能であるこ とが明らかになった．
これらの結果から，本論文によって，日本産いもち病菌を題材として，遺伝学的な方向と逆遺伝学的な方 向の両方から，いもち病菌の宿主特異性・病原性に関わる遺伝子を同定・解析する実験系を構築できたもの と考えられる．本論文により同定された愛知旭に対する非病原性遺伝子を含む領域の解析，液胞局在と推定 されるセリンプロテアーゼの解析のさらなる展開が期待される．また，今回確立された実験系を用いて，い も ち 病 菌 の 他 の 興 味 深 い 形 質 に 関 わ る 遺 伝 子 を 同 定 ・ 解 析 で き る も の と 期 待 さ れ る ． ―98―
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
日本産イネいもち病菌を用いた宿主特異性及び 病原性に関わる遺伝子の同定と解析
本 論 文 は8章 か ら な り ， 図42， 表40， 引 用 文 献105を 含 む 総 頁 数178の 和 文 論 文 で あ る ． 別 に 参 考 論 文3編 が 付 さ れ て い る ．
い も ち 病 菌(Magnaporthe grisea)は ， イ ネ の 最 重 要 病 害 で あ る い も ち 病 の 原 因 菌 で あ る ． い も ち 病 菌 は そ の 特 徴 と し て ， 宿 主特 異 性 を持 つ ． ・ 宿主 特 異 性は 菌 側 の非 病 原 性 遺 伝 子 に よ っ て 誘 導 さ れ る ， イ ネ の 抵 抗 性 に よ っ て 決 定 さ れ る が ， そ の 誘 導 機 構 は ま だ 十 分 に 解 明 さ れ て い な い ． ま た ， 非 病 原 性 遺 伝 子 の 変 異 に よ る 抵 抗 性 品 種 の 罹 病 化 は ， 病 害 防 除 に お け る 深 刻 な 問 題 で あ る ．
一 方 ， こ れ ま で に い も ち 病 菌 の 病 原 性 に 関 連 す る 多 く の 遺 伝 子 が 単 離 ・ 解 析 さ れ て い る が ， 而vitroで 解析 が 可 能な 分 生 子・ 付 着 器の 解 析 に 比べ ， ． 植物 体 内 での 増 殖 に 関 わ る 遺 伝 子 の 解 析 は 比 較 的 行 わ れ て い な い ・
本 研 究 で は ， 日 本 産 い も ち 病 菌 の 宿 主 特 異 性 お よ び 病 原 性 に 関 連 す る 遺 伝 子 の 解 析 を 目 的 と し て ， 遺 伝 子 の 同 定 と 解 析 を 試 み ， 以 下 に 記 す 結 果 を 得 た ・
1． 日 本 産 い も ち 病 菌 を 含 む 交 配 系 の 確 立
こ れ ま で 成 功 例 の な い 日 本 産 菌 株 を 用 い た 交 配 系 の 確 立 を 目 的 と し て ， 高 稔 性 株 Guyllを 導 入 し て 交 配 実 験 を 行 い ， 最 終 的 に 交 配 系 ク ロ ス5307，65株 を 得 た ． 遺 伝 マ ー カ ー の 分 離 解 析 を 行 っ た と こ ろ ， そ れ ら は 全 て メ ン デ ル 則 に 従 っ て 分 離 し た ． ま た ， 抗 生 物 質 カ ス ガ マ イ シ ン に 対 す る 耐 性 遺 伝 子 座ksglRを 同 定 し ， そ の 座 に 連 鎖 す る 分 子 マ ー カ ー3個 を 得 ，ksglR座 付 近 の 遺 伝 地 図 を 作 成 出 来 た が ， 分 子 マ ー カ ー の 座 乗 す る 染 色 体 は 異 な っ て い た ． こ れ ら の 結 果 か ら ， ク ロ ス5307を 用 い た 染 色 体 歩 行 に よ る 非 病 原 性 遺 伝 子 の 単 離 は 難 し い が ， 単 一 遺 伝 子 座 の 分 離 解 析 は 可 能 で あ る と 考 え ら れ た ． ま た ク ロ ス5307両 親 株 の 病 原 性 の 検 定 を 行 っ た 結 果 ， 愛 知 旭 ， ク サ ブ エ ， ツ ユ ア ケ ，K59の4品 種 に 対 す る 非 病 原 性 遺 伝 子 の 遺 伝 解 析 が ク 口 ス
