学位論文

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学位論文

真正細菌およびミトコンドリアにおける翻訳停滞解消機構の解明

Functional analysis of stalled-ribosome rescue factors in bacteria and mitochondria

群馬大学大学院工学研究科

小暮裕幸

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第 1 章序

翻訳停滞

翻訳は，DNAで構成されている遺伝情報から，タンパク質という実体へ質的変換させる点で重要かつ複雑な過程である。この過程は，リボソームという巨大なRNA・タンパク質複合体上で行われ，mRNAの開始コドンから終止コドンまでトリプレットをアミノ酸一つずつに変換することで，基本的には一つのタンパク質（ポリペプチド）が合成される。この合成過程には，開始，伸長，終結の3過程があり，それぞれに様々な因子が関わっている。

しかし，細胞内ではこのmRNAの翻訳がスムーズに行われ予定通りのタンパク質ができることはまれで，様々な理由により翻訳が滞ることが知られている。

例えば，RNA ポリメラーゼが不完全に転写を終えてしまったり，あるいは mRNAがturnoverされる際にRNaseで切断されてしまったりして終止コドンを失った場合である。この場合，翻訳終結因子（class I peptide release factor，

以下RF）による終止コドンの認識ができず，リボソームでは翻訳終結を起こす

ことができない。結果としてポリソームのまま多くのリボソームをトラップした状態となる（翻訳停滞；翻訳の滞り）。これに対し，何らかの滞りを解消（rescue）

する仕組みがなければこの異常な状態が続かざるをえない。実際，大腸菌

（Escherichia coli）では250回の翻訳を行われる毎におよそ1回リボソームが滞ってしまう事が報告されている(Moore and Sauer, 2005)。この頻度でリボソームが滞ってしまうと，細胞が一回分裂する間もなく不完全なmRNAによって，

すべてのリボソームが捕われて使えなくなってしまうことになる。

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tmRNA・SmpB複合体による翻訳停滞解消機構

真正細菌ではこのように頻繁に起こる翻訳の滞りに対してどのように対処しているのだろうか。これに対し，これまで tRNA と mRNA の両方の機能を有したtransfer-messenger RNA（tmRNA）という低分子RNAが関わるとされてきた（Fig. 1-1）(Janssen and Hayes, 2012)。この分子はSmpBという塩基性タンパク質（160残基）と複合体を形成して初めて機能する。まずtmRNA・ SmpB複合体はtRNA^Alaのようにアラニル-tRNA合成酵素によってアラニンが付加され，そして伸長因子 EF-Tu･GTP と複合体を形成する。そして滞ったリボソームのAサイトにtRNAの様に入り伸長中のポリペプチド鎖がtmRNAに付加されたアラニンに受け渡されtrans-translation（トランス翻訳）を起こす。

その後はmRNAの様にtmRNA内にコードされているORFが翻訳され，その終止コドン使ってRFが翻訳終結させる。結果として通常の翻訳終結過程を経て滞ったリボソームは解消される。また合成された未完全なポリペプチド鎖は，

tmRNA内にコードされている短いペプチド（タグペプチド，AANDEYALAA）がC 末端に付加され解消される。このタグペプチドは ClpXP，ClpAP，Lon，

HflB などの ATP 依存性プロテアーゼの標的部位となり速やかに分解される (Moore and Sauer, 2007)。

このように，この翻訳停滞解消機構は，「滞ったリボソームを解消し再利用を可能とする」だけではなく，「生じてしまった未完全なポリペプチド鎖を速やかに分解させるというタンパク質の品質管理機構」を含む非常に洗練された系である。また，最近ではSmpBがトランス翻訳の様々なステップで，重要な役割を果たしていることが明らかとなってきており(Kurita et al., 2010)，本研究で扱う翻訳停滞解消との類似性については，第3章で考察する。

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YaeJタンパク質によるtmRNA非依存的翻訳停滞解消機構の示唆

tmRNA による未完全なタンパク質の分解システムを含んだ翻訳停滞解消機

構は，真正細菌では普遍的に保存されていることが配列解析から示されている (Moore and Sauer, 2007)。この普遍性は，細菌にとって翻訳停滞解消機構の必要性を強く示すものである。しかし，最近になって tmRNA 遺伝子（ssrA）を欠損させた大腸菌においても，滞ったリボソームが効率よく解消されているとの報告が複数されてきた。例えばS100画分を用いたpoly(Phe)合成システムを使ったin vitroの実験では，リボソームはtmRNAの助けなしに終止コドンをもたない mRNA から効率よく解消されている(Szaflarski et al., 2008)。また，

tmRNA欠損株を用いたin vivoの実験では，リボソームが滞りやすい配列によって翻訳が滞っても効率よくリボソームが解消されていた(Kuroha et al., 2009)。

以上の結果から，大腸菌において tmRNA の系とは異なった未知の翻訳停滞解消機構の存在を示唆していた。この答えの一つが，2010 年の 11 月に本研究室で初めて報告したYaeJタンパク質である（驚くべきことに，大腸菌にはもう一つの翻訳停滞解消因子ArfAが存在することが同時期に明らかにされたが，このことは第４章で述べる）。

当研究室が全長140残基の小さな塩基性タンパク質YaeJというタンパク質に注目したのは，RFの活性部位配列を特徴付けるGGQ（Gly-Gly-Gln）モチーフをもっているからである。RFではこのモチーフのアミノ酸が活性部位を形成し，

ペプチジルtRNAをtRNAとポリペプチド鎖に加水分解する。興味深いことに，

RFと比較するとYaeJタンパク質の配列はより短く，明らかに終止コドンを認識するドメインが存在しない。この特徴は，YaeJが終止コドン認識を必要としない翻訳停滞解消因子と考えるならば，都合がよい。

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7 翻訳停滞解消YaeJの機能

本研究室では，YaeJが翻訳の滞ったリボソーム上の，Pサイトに存在するペプチジルtRNAをpeptidyl-tRNA hydrosis（PTH）活性により，tRNAとポリペプチド鎖に加水分解することができるのではないかという作業仮説を立て，

大腸菌由来再構成型無細胞タンパク質合成系（PUREsystem）を用いて検証した(Handa et al., 2011)。mRNAとしては，crp遺伝子に対して終止コドンを欠損させたものを使用した（nonstop mRNA）。反応時に蛍光ラベルされたLysを取り込ませ，中性のSDSゲル電気泳動後，蛍光イメージャーを用いて合成されたタンパク質の量を測定した。YaeJがないと翻訳は滞ってしまうためペプチジルtRNAが検出されるが，YaeJを添加することによりペプチジルtRNAは検出されなくなり，代わりに Crp タンパク質が検出さるようになった。このことから，nonstop mRNAに対して，YaeJはPTH活性をもつことが示された。また，

終止コドン上流の24塩基前に4個連続したArgのレアコドン（使用頻度が低いコドン）を挿入したmRNAを用いて作った翻訳の滞りに対しても，YaeJはPTH 活性を示した（この結果は，後述のtmRNAの系との相違点の一つとなる）。一方，終止コドンがあるmRNAを使った通常の翻訳ではYaeJを加えても翻訳効率に変化はなかった。

次にショ糖密度勾配法を用いて YaeJ とリボソームとの結合を検証したところ，YaeJは70Sおよびポリソーム画分に検出された。C末端領域を10残基分欠損させるとシグナルは低分子画分に検出されるようになることから，YaeJの塩基性残基に富む C 末端領域は，リボソームとの結合に重要であることが示された。

本研究室の実験は主にin vitroの実験であったが，岡山大の阿保らは，本研究

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室の研究とは独立に，遺伝学的研究からYaeJが翻訳停滞解消因子であるという結論に行き着いている。tmRNAと ArfA（後述）を共に欠損させると大腸菌は致死的であるが，過剰発現により suppress する遺伝子を探索した結果，yaeJ 遺伝子を見いだしたのである(Chadani et al., 2011a)。

以上の結果から，YaeJ が，tmRNAの系とは別の翻訳停滞解消因子であることが明らかとなった。

YaeJのヒトホモログICT1はミトコンドリアの翻訳停滞解消因子として機能する

YaeJはtmRNAとは異なってグラム陰性菌でしか保存されていないが，YaeJ の研究をさらに興味深くさせているのは，そのオーソログが酵母からヒトに至るまで真核生物に広く存在し，そこではミトコンドリアの翻訳系の翻訳停滞解消因子として機能していることが明らかになってきたからである(Handa et al.,

2010)。ミトコンドリアは核とは別に独自のDNA（mtDNA）をもち，それに対

応して独自の翻訳系をもつ(Taylor and Turnbull, 2005)。その翻訳系においても翻訳停滞は起きているはずであるが，一部の例外を除いてはtmRNA・SmpBは存在せず，長い間その解消機構の存在が意識されることはなかった。2010年になって，英国のRichterらのグループにより，YaeJのヒトオーソログと考えられる ICT1 がミトコンドリアにおける翻訳停滞解消因子であることが明らかにされた(Richter et al., 2010)。ICT1は，もともと1995年にヒト結腸腺がん細胞

株（HT29-D4）の分化に伴い発現量が最も抑制された遺伝子の一つとして同定

され，immature colon carcinoma cell transcript 1（ICT1）と名付けられたものである(van Belzen et al., 1995)。

Richterらの報告によるとICT1は，単離したミトコンドリアリボソームに常に結合している（そのため彼らは，ミトコンドリアリボソームタンパク質の一

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つとして考えている）。siRNA法を用いてヒト培養細胞におけるICT1の発現を抑制すると，細胞増殖は著しく抑えられるが，そこでは mtDNA 内にコードされているタンパク質の発現量が著しく減少していた。大腸菌の S30 画分を用いてICT1のPTH活性を調べたところ，nonstop mRNAに対してのみ活性があることが示された。以上のことから，ICT1は，ミトコンドリアでの翻訳停滞解消因子であることが強く示唆された。おそらく，ICT1が機能しなくなると翻訳の滞りを解消できず，mtDNA上の13種類（哺乳類の場合）のタンパク質をコードしている遺伝子から効率よくタンパク質合成することができなくなると考えられる。

当研究室では，Flow cytometry解析を用いてICT1の発現抑制による細胞およびミトコンドリアへの影響を調べた(Handa et al., 2010)。ヒト培養細胞においてRNAi法を用いてICT1の発現を抑制すると，ほとんど増殖できなかった。

また，発現抑制によりアポトーシスが起きており，コントロールに比べると，

正常なミトコンドリアの膜電位と容積をもつ細胞数が著しく減少していた。特に，ミトコンドリアの膜電位と容積が低下した細胞が増えていた。

もう一つのミトコンドリアの翻訳停滞解消因子C12orf65

ヒトミトコンドリアにはtmRNA・SmpBが存在しないことから，ICT1がミトコンドリア翻訳系で唯一の翻訳停滞解消因子であると思われたが，同年すぐに，ICT1同様に GGQモチーフをもつ C12orf65タンパク質が新たに翻訳停滞解消に関与していることが示唆された(Antonicka et al., 2010)。このタンパク質の研究の起点は，翻訳停滞解消の研究からではなく，ミトコンドリア脳筋症を発症している家系の異なる 2 名の患者のゲノムを調べたところにある。そのゲ

ノムではc12orf65遺伝子中に一塩基欠損が起きて終止コドンが生じており（ナ

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ンセンス変異），その結果，C12orf65 タンパク質が発現されていないことが判明した。つい最近では，遺伝性痙性対麻痺の日本人の患者（同一家系の 2 名）

からも同様に，c12orf65遺伝子にナンセンス変異が見つかっている(Shimazaki et al., 2012)。Antonickaのグループは，ミトコンドリア脳筋症患者の皮膚線維芽細胞由来の初代細胞株において，ICT1の発現を抑制した場合と同様に，ミトコンドリアタンパク質の発現量の低下を観察した。興味深いことに，この細胞に対して ICT1 を過剰発現させると，シトクロム c ^{オキシダーゼ（}COX）活性

が約50％回復すると同時に，呼吸鎖複合体の一部の発現量がある程度回復する。

このことは，C12orf65がICT1と同様に翻訳停滞解消因子として機能していることを示唆している。しかし，C12orf65 に関しては多くのことが未知であり，

またICT1と同等の条件下でその欠損の影響を比べるデータはない。

NMRによるICT1の立体構造解析

当研究室では，理化学研究所と共同研究よりマウス（Mus musculus^）由来の ICT1タンパク質の GGQドメインの構造を決定することに成功した(Handa et al., 2010)（Fig. 1-2）。この構造を用いて構造的相同検索を行った結果，予想通り真正細菌型のRFのGGQモチーフが含まれるドメイン3と酷似していることがわかった(Frolova et al., 1999; Zavialov et al., 2002)。

真正細菌型（ミトコンドリア由来を含む）のRFは，4つのドメインから構成されており，ドメイン2と4は終止コドンを認識し30Sサブユニットと結合する（Fig. 1-3）。ドメイン3 は50S サブユニットのpeptidyltransferase center

（PTC）と結合し，PサイトにあるペプチジルtRNAをPTH活性によりtRNA とポリペプチド鎖に加水分解する事で翻訳を終結される(Klaholz et al., 2003;

Rawat et al., 2003)。ICT1のGGQドメインは，このドメイン3との構造的相

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同だけでなくGGQモチーフ周辺の活性部位に関わるアミノ酸配列もRFとよく共通していた。最も異なる点としては，β2とβ3とを結びつける領域において，

RFのドメイン3ではそこが6残基からなるターン（ターンの分類によるとπ-HB turn）を形成するのに対して(Dasgupta and Chakrabarti, 2008)，ICT1ではα ヘリックス（αi）が挿入されている。しかし，この挿入によってドメイン3の構造上のアーキテクチャに変化はない。さらに配列解析の結果をふまえると，この決定された構造は，すべての生物種のICT1/YaeJタンパク質で保存されていることがわかる。また，ICT1の方が真正細菌由来のYaeJよりN末端が長いのは，ミトコンドリア移行シグナルがあるためである。

以下，このGGQモチーフをもつ活性ドメインのことをGGQドメインとする。

YaeJとリボソームとの共結晶構造

2012 年に，米国の Gagnon らによって，大腸菌由来の YaeJ と高度好熱菌

（Thermus thermophilus）由来のリボソームとの共結晶構造（3.2 Å）が報告された（Fig. 1-4）(Gagnon et al., 2012)。GGQドメインは，予想通りRFのドメイン3と同様にPサイトにあるペプチジルtRNAのエステル結合（ペプチドとtRNAの間の結合）を分解する位置にあった。注目すべき点は，YaeJの非構造領域であるC末端領域（113～128）がαヘリックス構造をとって，mRNA entry channel（30S サブユニットにあるmRNAの通る穴）の中に深く入り込んでいた点である。そのαヘリックスとGGQドメインとの間は，flexibleなペプチド鎖（リンカー領域）で結ばれていて，α ヘリックスが錨のように 30S サブユニットに打ち込まれてように見える。ここで興味深いのは，SmpB と YaeJ の C 末端領域がリボソーム上で果たす機能の類似性である（塩基性アミノ酸が多い以外は配列に相同性はない）。tmRNAと複合体を構成しているSmpBも，Aサ

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イトに結合時にはその非構造領域であるC末端がαヘリックスとなってmRNA entry channelに結合する（ただし，YaeJとは異なり，それほど深く入り込まない）。その結合時には，SmpBあるいはYaeJのどちらの場合でも，16S RNA のG530をsyn型からanti型にフリップさせるが，同じようなフリップは通常の翻訳におけるコドンとアンチコドンの相互作用のときにも見られるものである。

本研究の目的および章構成

本研究の目的は，「真正細菌およびミトコンドリアにおける翻訳停滞解消機構の解明」である。

そのため，第2章では，ミトコンドリアにおける翻訳停滞解消因子C12orf65 を中心に，ヒト培養細胞においてsiRNAを用いた発現抑制による細胞およびミトコンドリアへの影響の比較を行った。これにより，ICT1とC12orf65の機能の相違点を明らかにし，どのような役割分担があるか考察した。

第3章では，YaeJがリボソーム上でどのように機能しているのか，その分子メカニズムを明らかにするために，YaeJに対し変異体解析を行い，翻訳停滞解消での PTH 活性に必要な残基を同定した。また，大腸菌リボソームに対して，

ICT1がYaeJとほぼ同様な活性を示すことを明らかにし，このことから真正細菌由来のYaeJと真核生物由来のICT1との異生物種間でのアライメントに成功した。以上の結果から，第 4 章では，これらの翻訳停滞解消因子のグループ分けを提示し，その機能・役割分担，他の翻訳停滞解消因子との関係，進化など様々な角度から考察する。

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Ala

終止ドンを

アラニル‐tRNA合成酵素

によってアラニンが付加されたtmRNA

A‐site P‐site

5' ³'

A

滞ったリボソーム終止コドンを

失ったmRNA tRNA tmRNA

A‐site P‐site

A‐site

5' ³'

A

mRNAの解放

リボソムのリサイクル

A

tRNAがAサイトに結合

A

リボソームのリサイクル

ClpXP，ClpAP，Lon，HflB

A A

N D E Y

N A L A A

ORF

タンパク質分解酵素 Tag‐peptide

Fig. 1 - 1 tmRNAによるリボソームの翻訳停滞解消機構

終止コドン欠損などにより，リボソームのAサイトにmRNAがなくなるとアラニル-tRNA合成酵素によってtmRNAにアラニンが付加された状態でAサイトにtmRNAが入る。その後，

tmRNA内にあるタグペプチドに対応するORFを翻訳後，tmRNA内の終止コドンをRFが認識して翻訳を終わらせる。タグペプチドが付加されたタンパク質はタグペプチド認識プロテアーゼによって速やかに分解される。tmRNAに結合しているSmpBは省略した。

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（A） RF2のドメイン3

1

C _π-HBturn

N

C



23 N

3₁₀

GGQ loop

3

2

 

1 310

The 3/loop

（B） ICT1

i

N

C

GGQ loop

N

_i C

310-2

310-3



2 3

1 3₁₀-2

3₁₀-1 3₁₀-3

GGQ loop

3

2



310-1 1

The 3/loop

Fig. 1 - 2 RFのドメイン3とICT1の活性ドメイン（GGQドメイン）の溶液中の立体構造およびトポロジー比較

（A）RF2のドメイン3（203-307残基）の立体構造およびトポロジー（PDB code 1MI6）。立体構

GGQ loop

（A）RF2のドメイン3（203 307残基）の立体構造およびトポジ（PDB code 1MI6）。立体構造は3次元立体表示ソフトMOLMOL（Koradi et. al., 1996）を用いて表示した。3₁₀ヘリックス，

βストランド， αヘリックス，GGQループはそれぞれ，黄色，黄緑色，桃色，茶色で示した。

（B）本研究室で決定したマウスICT1タンパク質のGGQドメインの立体構造およびトポロジー

（PDB code 1J26）。3₁₀₁₀ヘリックス， βストランド，α_i_iヘリックス，αヘリックス，GGQQループはそれぞれ，黄色，黄緑色，水色，青色，茶色で示した。

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（ A ）

ICT1 真核生物（ミトコンドリア）

（365）

（206）

128 224 236 306 322 117

1

3 4

2 ドメイン1

真正細菌（RF1，RF2）

ミトコンドリア（mtRF1a） ₃₆₅

ICT1 真核生物（ミトコンドリア）

真正細菌

（206）

69 162

YaeJ ^（140）

1 99

（ B ）

To the peptidyl- transferase

center （PTC） ^{ドメイン1}

ドメイン3

To the decoding center

ドメイン2/4

Fig. 1 - 3 GGQファミリーのドメインの構成とRFの構造

（A）大腸菌RF2，マウスICT1，大腸菌YaeJのドメイン構成の概略図。数字は残基番号を示す。

（B）高度好熱菌における70Sリボソームと結合しているRF2の構造（PDB code 2WH1）。リボソームの構造は書いていない。ドメイン1，2と4は（A）と同色で書かれている。GGQモチーフを含むドメイン3はそれぞれαヘリックスとβシートはそれぞれ桃と緑で示した。

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（B）

（A）

Pサイト

tRNA YaeJ

50Sサブユニット

（B）

（A）

30Sサブユニット 30Sサブユニット

Fig. 1 - 4 大腸菌YaeJと高度好熱菌70SリボソームとのX線結晶構造解析

（A）Nonstop mRNAによる翻訳停滞時の70SリボソームにおけるYaeJの機能（4DH9，

（） o stop R による翻訳停滞時 70Sリボソにおける aeJ 機能（ 9， 4DHA）。50Sサブユニット，30Sサブユニット，nonstop mRNA，YaeJタンパク質，P部位のtRNAをそれぞれ青色，アイボリー，灰色，赤色，緑色で示した。立体構造は3次元立体表示ソフトUCSF Chimera (Pettersen et al., 2004)を用いて表示した。

（B）30Sリボソームに結合しているYaeJ（4DH9）。YaeJを赤色，PサイトのtRNAを緑色で示した。

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第 2 章 C12orf65 タンパク質の機能解析

序

本章では，ミトコンドリアにおける翻訳停滞機構の解明を目的とし，翻訳停滞解消因子ICT1 とC12orf65 を培養細胞においてsiRNAを用いてそれぞれの発現抑制することにより，細胞およびミトコンドリアにおける影響を調べた。

これによって，2つの因子の影響を調べると共に，詳細な比較を行うことで，機能的な相違点を明らかにする。方法として，様々な蛍光色素を用いて Flow cytometry（FCM）解析を行い，細胞周期，アポトーシス/ネクローシス解析，

ミトコンドリアの容積と膜電位およびROSの測定を行った。さらにシトクロム cオキシダーゼ活性を測定することで，ミトコンドリア活性の評価も行った。

実験方法

siRNAを用いた発現抑制

本実験では，3 種類の siRNA をミックスした siTrio カクテル（Hokkaido System Science）を用いて，ICT1とC12orf65の発現抑制を行った。

siRNA配列の設計は，コスモバイオ株式会社に委託し，合成はHokkaido System Science社に依頼した。

ただし，c12orf65の発現抑制に関してはミックスした3種類のsiRNAよりも 1種類のみの方が効果的であったために1つを選択的に使用した。

使用したそれぞれのsiRNAの標的配列は以下の通りである。

si-ICT1-A: GCACUGAGUUCAAGAGCAU

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si-ICT1-B: GCAGAUUGCCUGCAGAAAA si-ICT1-C: CGGGAAAGGCUGAGACAAA si-C12orf65 : CCAGAAGCUCCCAGGGAAU

ネガティブコントロールとして用いたNontarget（NT）siRNAの配列は以下の通りである。

si-NT-A : AUCCGCGCGAUAGUACGUA si-NT-B : UUACGCGUAGCGUAAUACG si-NT-C : UAUUCGCGCGUAUAGCGGU

細胞培養と遺伝子導入法

本研究にはHeLa細胞を使用した。10% fetal bovine serum（以下，FBS）， 100 units/ml ペニシリン，および 100 μg/ml ストレプトマイシンを添加した Dulbecco's Modified Eagle's Medium（以下，DMEM）（Sigma-Aldrich）を使って培養した。

標的遺伝子の発現抑制は，siRNA を用いてリバーストランスフェクション法で行った。遺伝子導入条件は，5% FBSのみを含むDMEMを用いて35 mmディッシュ（Corning）にHeLa細胞 [1.0 × 10⁵ cell/well]を播種し，2.5 μlの遺伝子導入試薬Hily Max（Dojindo）を用い，最終濃度50 nMになるようにsiRNA を導入した。導入後，24時間後に10% FBSを含む新鮮なDMEMに交換して，

数日間 CO2インキュベーターで培養をおこない，以降の実験のサンプルとして使用した。

以下，非標的なsiRNAを導入した細胞をsi-NT，ict1に対するsiRNAを導入した細胞を si-ICT1，c12orf65 に対する siRNAを導入した細胞を si-C12orf65 と表記する。

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19 ウエスタンブロッティング

サンプル調製

HeLa細胞の培地を捨て，Phosphate Buffered Saline（以下，PBS）で2回洗浄をした。氷冷PBSを1 ml加えてセルスクレーパーで培養細胞を1.5 ml チューブに回収した。遠心分離（3,000 rpm，10分，4℃）をおこない，PBSを除去した。回収したHeLa細胞にLysis Buffer [7 M urea，2 M thio-urea，1%

Triton X-100，1 mM PMSF，0.5 mM EDTA]を加え，HeLa細胞から全タンパク質を抽出した。この操作は常に氷上で操作を行った。細胞塊をよくピペッティングで懸濁し，超音波ホモジナイザー（Taitec）で数分間処理した。その後，

遠心分離（12,000 rpm，30分，4℃）をし，上清を新たなチューブに移し，細胞抽出液とした。

タンパク質の定量

タンパク質濃度は，ブラッドフォード法に基づくQuick start Bradford Dye Reagent（Bio-Rad）を用いて決定した。標準曲線を得るための標準タンパク質として，ウシ血清アルブミン（以下， BSA）を用いて，異なる濃度の BSA を加えたブラッドフォード試薬の波長 595nm における吸光度を分光光度計（GE Healthcare）で測定をした。BSA濃度とブラッドフォード吸光度を基づき，標準曲線を算出した。これより，濃度未知なタンパク質液の濃度を定量した。

ウエスタンブロット

細胞抽出液50 µg を15％ SDS-PAGE で分離し，泳動後のゲルを 200 ml の転写バッファー [24.8 mM Tris，192 mM Glycine，20% Methanol]に数分間浸した。あわせて，ゲルと同じサイズにBioTrace NT-Nitrocellulose Membrane φsize 0.2 μm（Pall）とフィルター紙（Advantech）を切り出し，転写バッファーに十分に浸しておいた。その後，トランスブロット SD セル（Bio-Rad）を使用し，SDS-PAGE ゲルからメンブレンにタンパク質を転写した（constant 1

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20 mA / cm²，1 hr）。

転写後，メンブレンを1% skim milk / PBS- 0.1% Tween（以下，PBST）で振とうし（30分，室温），ブロッキングを行った。

ブロッキング終了後，メンブレンを5 mlの抗原抗体反応増強剤can get signal 1（Toyobo）でそれぞれの一次抗体 [ ICT1 MaxPab mouse polyclonal antibody

（1：500），C12orf65 MaxPab mouse monoclonal antibody（1：500）（Abnova）] を希釈し，ハイブリパック（コスモバイオ）に入れ，振とう（一晩，低温室）

した。また，泳動コントロールとしては，ハウスキーピング遺伝子ヒト Gamma-tubulinの一次抗体（Cell Signaling Technology）を5 mlに希釈（1%

skim milk/TBST（1：8000））して用いた。

次に，ハイブリパックからメンブレンを取出し，新鮮なPBST で振とう（10 min，室温）し，洗浄した。この洗浄操作を 3 回繰り返し，メンブレンを再びハイブリパックに入れ，can get signal solution 2で5 mlに希釈した二次抗体 [ Anti-mouse IgG HRP-linked Antibody（1:4000）（Cell Signaling Technology）] で，振とう（70分，室温）した。その後に再び，メンブレンをPBSTで3 回振とう洗浄（10分，室温）した。

タンパク質の検出は，化学発光試薬ECL Prime Western Blotting Reagents

（GE Healthcare）を使用しX線フィルム（FUJI Medical）に感光し現像した。

定量的PCR（Quantitative PCR，qPCR）

チューブに回収した細胞塊にTriPure Isolation Reagent（Roche）を1 ml加えて，ボルテックスミキサー（Taitec）で懸濁した。懸濁液にクロロホルムを 200 μl加えて懸濁し，遠心分離（12,000 rpm，15分，4℃）にて，水層と有機溶媒層に分けた。中間層にある変性したタンパク質を取らないように水層の上

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清を新しいチューブに回収した。上清に酸性フェノール500 μlとクロロホルム 100 μl加えて，遠心分離（12,000 rpm，15分，4℃）することでDNAとRNA を分離した。上清をチューブに回収し，イソプロパノール沈殿をおこないトータルRNAを精製した。

精製した100 ng トータルRNAをReverTra Ace qPCR Mix（Toyobo）を用いて cDNA 化した。合成した 2 ng cDNA と標的遺伝子のプライマーと共に GoTaq qPCR Master Mix（Promega）でMyiQ（Bio-Rad）を用いて付属の説明書に従った条件でqPCRを行った。解析は，ヒトgapdh遺伝子の発現を内部標準として，ΔCt法を用いて相対的に行った。

細胞数測定

siRNA導入後 48，72，96 時間に培養している細胞の培養液を取り除き，PBS で洗浄後，Trypsin-EDTA（Sigma-Aldrich）で処理をし，10％FBSを含むDMEM を加えて細胞を回収した。生細胞より膜透過性が高い死細胞を特異的に染色できるトリパンブルー（Wako）を使用し，生細胞を観察の観察を行った。0.4%トリパンブルー90 μlと回収した培養細胞を含む懸濁液30 μlを混合し血球計算盤に入れた。これを位相差顕微鏡で観察し，生細胞数を数えて測定した。

Flow cytometry（FCM）解析

FCMは，一点に集められたレーザー光をフローセルの中心を通過する細胞に照射し，そこから生じる散乱光と，蛍光を同時に測定する技術または方法のことをいう。測定結果は，相関ヒストグラムとして示され，これらのヒストグラムを解析することにより統計的にサンプルの特性を明らかにできる。測定機器は，本学の生体情報ゲノムリソースセンターにある FACSCalibur（Becton

(23)

22 Dickinson）を使用した。

なお，FACSCaliburの詰まりや測定のブレを防ぐため，準備した細胞はすべて測定前にナイロンフィルターを通し，細胞塊を除いた。また，本研究では，

アポトーシスのポジティブコントロールとして，カスパーゼ 3 の活性化によるアポトーシス誘導剤のスタウロスポリン（staurosporine）を終濃度50 nMで使用した(Chae et al., 2003)。

細胞周期解析

培養してあるHeLa細胞をPBS で洗浄後Trypsin-EDTAで処理し，DMEM で再懸濁を行い，遠心（1,000 rpm，3分，室温）して，細胞を回収した。その後，細胞をPBSで洗浄し，再度遠心（3,000 rpm，10分，4℃）で細胞を回収し，70%エタノールを 1 ml加えて細胞固定（一晩，4℃）をした。固定した細胞は遠心分離（3,000 rpm，10分，4℃）をおこないエタノールを除去した後に，

PBSで2回洗浄を行った。その後，1 mlのPBSで再懸濁し，終濃度10 μg/ml のRNase A（Qiagen）と終濃度20 μg/mlのDNA蛍光プローブPropidium iodide

（以下，PI）（Dojindo）を加えることで，擬陽性を示す細胞内のRNAの切断と DNA染色を同時におこった（2時間，4℃）。FCMで 10⁴個の細胞を，PI の蛍光波長で測定し，サンプルごとの細胞周期の割合を求めた。

Annexin V-FITC / PIアッセイ

細胞のアポトーシス/ネクローシス検出のため Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I （Mbl）に含まれるPIと，Fluorescein isothiocyanate（以下，

FITC）が結合しているAnnexin Vを使って細胞を染色した（Fadok et al.,1992）。培養してあるHeLa細胞をPBS で洗浄後Trypsin-EDTAで処理し，DMEM

(24)

23

で再懸濁を行い，遠心（1,000 rpm，3分，室温）して，細胞を回収した。回収した細胞をPBSで洗浄後，遠心分離（1,000 rpm，10分，4℃）をおこない，

500 μlのbinding bufferで再懸濁する。そこに5 μlのAnnexin V-FITCと5 μl のPI を加え，遮光して 15 分間，室温に静置した。その後 FCM解析を行うまで氷上に静置した。この実験も同様に FCM で 10⁴個の細胞に対して FITC と PIの蛍光波長で検出した。

ミトコンドリア容積と膜電位解析

ミトコンドリアの機能への影響を調べるために，ミトコンドリア標識用の蛍光プローブMitoTracker Green FM（Life Technologies）とMitoTracker Red Chloromethyl-X-rosamine（CMXRos）（Life Technologies）を用いた。

MitoTracker Green FMは，ミトコンドリアの膜電位非依存的にミトコンドリアに蓄積し，緑色蛍光を示すプローブでミトコンドリア容積を調べることができる。また，MitoTracker RedCMXRos は，ミトコンドリア膜電位依存的にミトコンドリアに蓄積し，赤色蛍光を示すプローブでミトコンドリアの膜電位を調べることができる(Pendergrass et al., 2004)。

これらの蛍光プローブを，siRNAでそれぞれ発現抑制したHeLa細胞に最終濃度0.1 μMになるように加えて37℃で，1時間CO2ガスインキュベーター内で培養した。これらの HeLa細胞は PBS で洗浄後，Trypsin-EDTAで処理し，

DMEMで再懸濁を行い，遠心（1,000 rpm，3分，室温）して，細胞を回収した。回収した細胞を1 mlのPBSで再懸濁し，遠心分離（3,000 rpm，10分，4℃）

をおこない，細胞塊を集めた。回収した細胞に70％冷エタノールを加えて，エタノール固定（2時間，4℃）を行った。固定した細胞は遠心分離（1,500 rpm， 10分，4℃）をおこない，PBS で 2回洗浄した。この実験も同様に細胞 10⁴個

(25)

24

をそれぞれの蛍光色素に適した蛍光波長（MitoTracker Green FM：516 nm， MitoTracker RedCMXRos：599 nm）を測定した。

Reactive Oxygen Species（ROS）の測定

アポトーシスの指標の 1 つである細胞内の活性酸素種（Reactive Oxygen Species（ ROS））を測定するため，細胞浸透性蛍光プローブ 2’, 7’-Dichlorodihydrofluorescin diacetate（以下，DCFH-DA）（Sigma-Aldrich）を利用した(Bland et al., 2001)。DCFH-DAは，細胞膜内に浸透し，細胞内エステラーゼにより脱アセチル化し非蛍光型2’, 7’-Dichlorodihydrofluorescin（以下，

DCFH）となる。さらに ROS により素早く酸化され強く蛍光する 2’, 7’-Dichlorodihydrofluorescein（以下，DCF）に変化する。したがって，この蛍光強度は細胞質基質のROS量に比例する。

この蛍光プローブを培養してあるHeLa細胞に最終濃度0.1 μMになるように加えて 1 時間，37℃で CO2インキュベーター（Espec）内で培養した。HeLa 細胞はPBSで洗浄後，Trypsin-EDTA処理によって細胞をはがし再度1 mlの PBS で再懸濁した。この実験も同様にFCM で 10⁴個の HeLa 細胞の緑色蛍光波長を測定し，解析を行った。なお，本実験では，ポジティブコントロールとして未処理のHela細胞に蛍光プローブ添加40分後にH2O2（終濃度1 mM）で刺激を与え，20分間培養することでROSの産出を促したものを用いた。

シトクロムcオキシダーゼ活性測定

シトクロム c オキシダーゼ活性を測定するため，無傷な状態でミトコンドリアを単離できるMitochondria Isolation Kit（Pierce）を用いてsiRNAによって発現抑制した培養細胞からミトコンドリアを抽出した。このミトコンドリア

(26)

25

の濃度をQuick Start Bradford Dye Reagent（Bio-Rad）を使用し決定した。

ミトコンドリアを 15 ngに調整した。その後，ミトコンドリア呼吸鎖複合体Ⅳ の酸化反応（下記の反応式）でフェロシトクロムc^{が酸化されて}550 nmの吸光が弱くなることを利用し，シトクロム c オキシダーゼ活性を測定できる。実験には，Cytochrome c oxidase activity assay kit（Biochain）を用いて行った。

4Fe ‐ Cytochrome c ferrocytochrome c 4H O

4Fe ‐ Cytochrome c ferricytochrome c H O

結果

siRNAによる発現抑制と細胞増殖の影響

ミトコンドリアでのICT1およびC12orf65の機能を評価するため，siRNAを用いてHeLa細胞のICT1とC12orf65の発現量を減少させた（ノックダウン）。

qRT-PCRおよびウエスタンブロットの結果，コントロールと比べ，両タンパク

質のmRNAレベルおよびタンパク質レベルで優位に発現量の減少を確認された

（Fig. 2-1）。

siRNAを導入後48，72，96時間で細胞数を測定したところ，72時間で顕著な差が表れ始めた。96 時間後では si-NT に比べて si-ICT1 は 90%減少し，

si-C12orf65は64%減少した（Fig. 2-1 C）。これより，両タンパク質の発現抑制は，共に細胞増殖に大きな影響を与えるが，ICT1 の発現抑制の影響の方が，

C12orf65より著しく細胞増殖が低下をすることがわかった。

細胞周期解析

ICT1およびC12orf65の発現抑制された細胞の状態を詳細に解析するために，

96時間後に細胞をPIで染色し，FCMを用いて細胞周期解析を行った。

(27)

26

赤色蛍光色素 PI は，DNA にインターカレートすることで蛍光を呈し，この蛍光強度は核内の総DNA量を表す。PI染色した細胞をFCMで測定することで，

DNA量のヒストグラムのピークが得られる。このヒストグラムピークは，細胞周期（sub-G1，G1，S，G2/M）にそれぞれ当てはめることができる。これによ

って，sub-G1である細胞がアポトーシスによる断裂した核の状態を検出するこ

とができる。その結果，sub-G1期の割合は，si-NTは6.5%を示したのに対して，

si-ICT1では34.3%，si-C12orf65では13.0%とコントロールと比べて高い割合を示した（Fig. 2-2）。

したがって，ICT1タンパク質および，C12orf65タンパク質をそれぞれ発現抑制することでアポトーシスが生じていることが示めされ，また，ICT1を発現抑制した方が，アポトーシスが強く生じていることがわかった。

Annexin V-FITC/PIアッセイ

アポトーシスによる細胞死をより詳細に分析するため，Annexin VとPIによる二重染色をし，アポトーシス/ネクローシスの解析を行った。Annexin V は，

アポトーシス初期にみられる細胞膜の構造変化によって細胞内膜から外膜側へと露出するホスファチジルセリンにカルシウムイオン依存的に結合する。一方，

PI は細胞膜構造が劣化し始めるアポトーシス後期やネクローシスにおいて，細胞膜を透過してDNAに結合する。この2つの原理を利用して，アポトーシスとネクローシスを詳細に解析した(Vermes et al., 2000)。

その結果，si-NT は，共に Annexin V および PI の蛍光を示さないため，

Annexin VとPIによる二成分展開による解析では，主に左下に細胞群がみられ，

アポトーシス初期を示す細胞群の割合は 6.6％を示した。それに比べ，si-ICT1 およびsi-C12orf65は，共にAnnexin Vのみの蛍光増加が見られる一方，PIの

(28)

27

蛍光増加は見られず，アポトーシス初期を示す左上方向に細胞群がシフトしていた（si-ICT1は24.6%，si-C12orf65は11.9%の割合を示した）（Fig. 2-3）。これはアポトーシス誘導をするスタウロスポリン処理した細胞と同様の傾向を示した。このことから，si-ICT1およびsi-C12orf65はネクローシスによる細胞膜破壊ではなく，アポトーシス初期が起こっていることが示された。また，細胞周期解析の結果と同様に，C12orf65の発現抑制した細胞よりICT1の発現抑制した方が強くアポトーシスが生じていることが示された。

ミトコンドリアの容積および膜電位

次に，ミトコンドリアへの影響を調べるため，MitoTracker Green FM と MitoTracker Red CMXRos の 2 種類のミトコンドリア蛍光プローブを用いて FCM解析を行った。MitoTracker Green FMはミトコンドリア膜電位とは関係なく，ミトコンドリア内に選択的に蓄積し，ミトコンドリア容積に比例して蛍光を示す。対して，MitoTracker Red CMXRosはミトコンドリアの膜電位のみに依存する。

siRNA で発現抑制した細胞をそれぞれの蛍光プローブで染色し FCM 解析し

たところ，si-ICT1とsi-C12orf65はsi-NTに比べて，全体的にピークの減少がみられた。これは正常なミトコンドリアをもつ細胞が著しく減少したことを示している（Fig. 2-4）。ピークのシフトに着目すると（シフトは，ある状態を示すミトコンドリアをもつ細胞集団の変化を示す），si-ICT1 は，si-NT と比べてピークが左側にシフトした。一方，si-C12orf65は，si-NTと比べて右側にシフトした。つまり，コントロールと比べ si-ICT1 はミトコンドリアの膜電位や容積が減少した細胞集団が増加した傾向を示し，si-C12orf65は反対に膜電位や容積が増加する細胞集団が増加した傾向を示した。

(29)

28 シトクロムcオキシターゼ活性

ミトコンドリアにおけるATP生産は，電子伝達系を担うタンパク質複合体Ⅰ

～Ⅴによって生じるプロトン濃度勾配によって合成される。電子伝達系のタンパク質複合体Ⅳであるシトクロム c オキシターゼの活性を測定することでミトコンドリアの活性を測定した。

その結果si-NTと比べ， si-ICT1は約60％のシトクロムcオキシターゼ活性が低下を示した。また，si-C12orf65は，約50%の活性が低下したことがわかった（Fig. 2-5）。

ROS活性の測定

活性酸素種（ROS）とは，酸素分子（O2）に由来する反応性に富む一群の分子群の総称である。ROSはミトコンドリアの電子伝達系における副産物として，

また窒素酸化物（NOX）などの酵素によって産生される。ミトコンドリアにおいては，電子伝達系で電子を受け取った酸素分子の大部分は水へと変換されるが，一部の酸素分子は電子還元されスーパーオキシドになる。通常は産出されたスーパーオキシドは速やかに酸化還元酵素群により水へと代謝される。しかし，細胞死などに伴うミトコンドリア機能が障害される状況では，ROSが過剰に産出されることが知られている(Liu et al., 2013)。また，mtDNAにコードされたタンパク質の合成が完全でない場合は，呼吸鎖複合体の活性における電子伝達中に電子の脱落が生じることで，ROS の産出が増加する (Moreno-Loshuertos et al, 2006)。そこで，ROSの産出量が変化しているかどうか確認するため，FCMを用いてROSを測定した。結果としてsi-NTと比べ，

si-ICT1および si-C12orf65では ROS の産出がそれぞれ約1.6倍と約 1.2倍高いことがわかった（Fig. 2-6）。si-ICT1のROSの産出量に関しては，ポジティ

(30)

29

ブコントロールである過酸化水素（H2O2）処理したものと同程度の非常に高い ROSの産出が示された(Gil et al., 2003; Kim et al., 2010)。

考察

本研究により，細胞およびミトコンドリアにとって，ICT1とC12orf65の両因子が必須であることが明らかとなった。これらの実験結果をまとめると，翻訳停滞解消因子の欠損によって細胞にどのようなことが起きているか，以下のように推測される。これらの因子が一つでもなくなると，mtDNAにコードされたタンパク質の翻訳の停滞が頻繁に生じることになる。これにより翻訳停滞が効率よく解消できず，完全な状態で呼吸鎖複合体を合成することができない。

したがってATP生産能の著しい低下となる。これらのミトコンドリア異常によって，アポトーシスが引き起こされることや，通常より多くのROSが産出されるといったことで，それらの負の連鎖が起き，細胞増殖に大きな影響を与えるというモデルが考えられる。

本研究ではさらに，ICT1の抑制のほうがC12orf65の抑制よりも細胞およびミトコンドリアへの影響が大きく，また，両者のミトコンドリアに対する影響の質が異なっていることを示した。Antonicka らによって，ICT1 と C12orf65 の発現抑制の影響は，共にミトコンドリアDNAにコードされているタンパク質の合成量が著しく低下することが報告されているが(Antonicka et al., 2010)，全体的にタンパク質合成量が低下しており，ICT1とC12orf65間の差は見いだせなかった。本研究のFCM解析の結果で，初めて両者の相違点，つまりミトコンドリアの容積と膜電位のへの影響が有意に異なっていることを示したことになる。ICT1 の抑制の場合は，ミトコンドリア容積および膜電位が減少しており，

C12orf65の抑制の場合は，ミトコンドリア容積，膜電位が増加を示した。一般

(31)

30

的に，ミトコンドリアが異常をきたしATP生産が低下すると，容積を増やして recovery しようとする傾向にあることが報告されている(Auré et al., 2006;

Wredenberg et al., 2002)。これを考慮するとC12orf65の抑制の場合は，その recovery機構が保たれている状態であるが，ICT1の抑制はその機構さえも壊し，

ミトコンドリア・細胞にとって深刻な状態を生じさせると考えられる。これは，

当然ながら，ICT1 の発現抑制の影響の方が，C12orf65 より著しく細胞増殖が著しく低下するという結果と一致している。

では，両因子でどのような使い分け・役割分担がされているのか。まず，因子それぞれに停滞解消をする遺伝子が決まっていることが考えられる。これは，

ICT1 とC12orf65 の発現抑制によって，mtDNA由来のタンパク質に差があることで示されるが，上記の通り両者に有意な差が見られなかった。しかし，この実験ではミトコンドリア量を定量的に揃えることが難しいことも関係しているので（容量も変化している），この結果をもってこの説は否定しきれない。一方で，酵母とヒトでは，共通する遺伝子は6個だけで，5つのタンパク質は，酵母には存在しないことを考慮すると(Gray et al., 1999)，遺伝子の種類を通じて，

ICT1とC12orf65の役割を論ずるのは難しい。

本研究室では，ICT1とC12orf65のプロモーター解析を行っており，それによれば，少なくとも両者で転写因子が明らかに異なっている（未発表データ）。

これは，両者で発現パターンが異なることを示唆しており，両者が機能する時期が異なっている可能性があると考えている。また，それと関連して，遺伝子の種類というより，翻訳停滞の種類（終止コドンがない，あるいはmRNAの途中で止まった場合など）によって使い分けがあるかもしれない。二つの因子の機能の本質的な相違点を明らかにすることは，今後の重要な課題である。

(32)

（A）

0 6 0.8 1.0 1.2 1.4

rf65mRNA

0 6 0.8 1.0 1.2 1.4

T1mRNA

i NT i ICT1 （C） 60

（B）

0.0 0.2 0.4 0.6

C12or

si-NT si-ICT1 si-C12orf65

0.0 0.2 0.4 0.6

si-NT si-ICT1

ICT

si-C12orf65

20 40 60

胞数（1 ×105）

si-NT si-ICT1 ICT1

γ-tubulin

（）

si-C12orf65 si-NT

Fig. 2 - 1 siRNAの効果と発現抑制による細胞増殖への影響

0 24 48 72 96

0 C12orf65

γ-tubulin

Time [h]

細

（A）siRNAを導入したHeLa細胞の定量的PCR解析。

非標的（NT），ICT1，C12orf65を標的とするsiRNAをHeLa細胞に導入し，96時間後に回収してトータルRNAを抽出した。その後，ICT1，C12orf65，GAPDHのmRNAの発現量を解析した。

（B）siRNAを導入したHeLa細胞のウエスタンブロット解析。

NT，ICT1，C12orf65を標的とするsiRNAをHeLa細胞に導入し，96時間に回収して全タンパク質を抽出した。その後，ICT1，C12orf65とヒトGamma-tubulin抗体を用いてタンパク質の発現量を解析した。

（C）siRNAを導入したHeLa細胞の細胞増殖の影響。

それぞれのsiRNAをHeLa細胞に導入後，DMEMで48，72，96時間培養し，細胞数を測定した。独立した実験を3回行い，それぞれの値の平均値と標準偏差をとった。

31

(33)

si-NT Sub-G₁:

スタウロスポリン Sub-G₁:

6.5±1.5%1 17.4±5.3%¹

si-ICT1 Sub-G₁: 34.3±5.2%

si-C12orf65 Sub-G₁: 13.0±3.2%

細胞数

Fig. 2 - 2 FCMとヨウ化プロピジウム（PI）を用いたDNA量の測定

si-NT，si-ICT1とsi-C12orf65をそれぞれHeLa細胞へ導入後，96時間培養した。そ PI

s ，s C とs C o 65をそれぞれ e a細胞導入後，96時間培養した。その後，FCMを用いてその細胞を解析した。アポトーシスのポジティブコントロールは，

アポトーシス誘導剤であるスタウロスポリンを50 nM添加し，HeLa細胞のアポトーシスを誘導させた。細胞はPIを用いて染色を行い，FCMによって測定を行った。図内のバーはsub-G1期を示しており，その割合を右上に示した。独立した実験を3回行いそれぞれの値の平均値と標準偏差をとった

い，それぞれの値の平均値と標準偏差をとった。

32

(34)

si-NT スタウロスポリン

6.6±2.6 % 69.5±16.8 %

si-ICT1

Annexin V

24.6±5.9 % 11.9 ±2.3 % si-C12orf65

Fig. 2 - 3 アポトーシス/ ネクローシス細胞の数の散布図

si-NT，si-ICT1とsi-C12orf65のそれぞれのsiRNAをHeLa細胞に導入後，96時間培 PI

s ，s C とs C o 65 それぞれ s R を e a細胞に導入後，96時間培養した。同時に50 nM スタウロスポリンを測定2時間前より細胞に添加し，培養することでアポトーシス誘導させた。細胞はPIとAnnexin Vで染色しFCMによって解析を行った。

早期アポトーシスの細胞はPIとAnnexin Vを使った散布図の左上に位置し，その割合を左上の数字で示した。

33

(35)

（A）（B）

胞数胞数

MitoTracker Red CMXRosの蛍光強度 MitoTracker Green FMの蛍光強度

細胞細胞

Fig. 2 - 4 ICT1，C12orf65の発現抑制によるミトコンドリアへの影響

（A）ミトコンドリアの容積に依存的なMitoTracker Green FMによる蛍光強度の比較。

MitoTracker Red CMXRosの蛍光強度 MitoTracker Green FMの蛍光強度

（）ミトドリア容積に依存的な to ac e G ee による蛍光強度比較。

si-NT，si-ICT1とsi-C12orf65をHeLa細胞に導入後，それぞれ96時間培養した。

MitoTracker Green FMで染色後，細胞を固定化しFCM解析を行った。

（B）ミトコンドリア膜電位に依存的なMitoTracker Red CMXRosによる蛍光強度の比較。

（A）と同じ操作を行い，FCM解析を行った。

34

(36)

0 6 0.8 1.0

1.2 *

ムcオキシゼ活性

0.0 0.2 0.4 0.6

シトクロムダーゼ

si-NT si-ICT1

Fig. 2 - 5 シトクロムc^{オキシターゼ活性}

si-NT，si-ICT1とsi-C12orf65をHeLa細胞に導入後，それぞれ96時間培養した。それ si-C12orf65

培

ぞれのsiRNAを導入した細胞からミトコンドリアを抽出し，ミトコンドリアのシトクロムc^オキシターゼ活性を測定した。si-NTを導入した細胞のシトクロムcオキシターゼ活性値を基準として，si-ICT1とsi-C12orf65の活性を相対的に示した。独立した実験を3回行い，それぞれの値の平均値と標準偏差）をとった。 * p< 0.01

35

(37)

2.0

1.0 1.5 2.0

OSの活性

**

0.0 0.5

si-NT si-ICT1 H₂O₂

RO

si-C12orf65

Fig. 2 - 6 ICT1，C12orf65発現抑制による細胞内ROS生産量の測定

ROS依存的に蛍光を呈する細胞浸透性蛍光プローブDCFH-DAによる蛍光強度の比較。依存的蛍光す細浸性蛍光蛍光強度較。

si-NT，si-ICT1とsi-C12orf65をHeLa細胞に導入後，それぞれ96時間培養した。細胞を DCFH-DAで染色後，測定直前に1 mM過酸化水素（H₂O₂）処理し，ROSを発生させたものをポジティブコントロールとした。si-NTを導入したHeLa細胞の蛍光強度を基準として，si-ICT1とsi-C12orf65の蛍光強度を相対的に示した。独立した実験を3回行い，それぞれの値の平均値と標準偏差をとった。** p < 0.05

36

(38)

37

第 3 章 YaeJ タンパク質の変異体解析

序

本章では，YaeJがリボソーム上でどのように機能しているのか，その分子メカニズムを明らかにするために，YaeJに対し変異体解析行った。保存残基に着目して様々な変異体を作製し，再構成型無細胞タンパク質合成系を用いたPTH 活性測定を行うと共に，YaeJ変異体のリボソームとの相互作用をショ糖密度勾配遠心分離のウエスタンブロットによって解析をした。また，ヒト ICT1 との PTH活性の比較を行った。これらの結果から，PTH活性およびリボソームとの結合部位に必要な部位を明らかにすることで，YaeJの機能の分子メカニズムについて考察を行った。

実験方法菌体

使用した大腸菌株とプラスミドDNAはTable 1に示す。大腸菌全遺伝子プラスミドクローンASKA library (Kitagawa et al., 2005)と網羅的Open-reading frame （ORF）欠損株ライブラリー Keio collection (Baba et al., 2006)は，

National BioResource Project（NIG，Japan）により提供された。また，ヒト ICT1のcDNA（IRAK027I21）はRIKEN BRCより供与された(Ota et al., 2004)。

大腸菌 K-12 BW25113 株を親株として欠損株が作られている Keio collection に関してはP1 形質導入法（本章の実験方法参照）を用いてBL21株に目的遺伝子の組み換えを行った。

(39)

38 培養

本実験においての培養は，全てLysogeny Broth培地（以下，LB培地） [1%

tryptone，0.5% yeast extract，1% NaCl] で行った。

大腸菌株にプラスミドを用いて形質転換するために，プラスミドの取り込み効率が上がるように処理してコンピテントセルとした。大腸菌を5 mlのLB培地で一晩培養（37℃）した。その後，菌溶液を250 μlとり，25 mlのSOB培地 [(2% Bacto Tryptone，0.5% Yeast extract，10 mM NaCl，25 mM KCl）と

（1 M MgCl2･6H2O，1 M MgSO4･7H2O）を50:1の割合で混合] に植菌した。

このSOB培地を25℃でOD600が0.6 absになるまで培養した。その後，培養液を氷上で10分間冷却し，遠心分離（3,000 rpm，15分，4℃）し菌体を回収，

上澄みを除いた後，15 ml の氷冷した Transformation buffer [10 mM PIPES-KOH (pH 6.7)，15 mM CaCl2･2H2O，250 mM KCl， 55 mM MnCl2･ 4H2O ]でタッピングにより懸濁させ10分間氷冷した。培養液を遠心分離（3,000 rpm，15 分，4℃）し菌体を回収，上澄みを除いた後，4 ml の氷冷した Transformation bufferで再懸濁した。また凍結時の細胞へのダメージを軽減させるためDMSO を最終濃度が7%になるように添加し，コンピテントセルとした。

作製したコンピテントセル100 μlに3 μlの目的タンパク質をコードしたプラスミドDNAを加え氷上で30分間静置した後，ヒートショック（45秒，42℃）

を行った。大腸菌の回復のため100 μlのLB培地を加え37℃，1時間培養し，

抗生物質を含む LB 寒天培地にコンラージ棒で均一に全量植菌し，37℃で一晩培養した。抗生物質に関しては，アンピシリン，50 μl/ml；カナマイシン，10 μl/ml；クロラムフェニコール，34 μl/mlの最終濃度でそれぞれ使用した。