総括

本研究で，ミトコンドリアおける翻訳停滞解消因子C12orf65およびICT1，そ して大腸菌での翻訳停滞解消因子YaeJの機能解析を行った。これまでの実験結 果をまとめる。

 ICT1 と C12orf65 の発現抑制は，培養細胞の増殖を著しく阻害し，アポト ーシスが生じていた。

 ICT1 と C12orf65 の発現抑制は，ミトコンドリアの容積と膜電位にも影響 を与えており，その影響は二つの因子で異なっていた。

 ICT1の発現抑制のほうが，C12orf65の発現抑制より細胞およびミトコンド リアへの影響が大きい。

 YaeJと ICT1 は，大腸菌由来の 70S リボソームを使った PTH活性の測定 で，同程度のPTH活性を示す。

 YaeJのPTH活性には，リンカー領域Arg105，C末端領域Arg118，Leu119， Lys122，Lys129，Arg132が必要である。これらの残基を置換すると，PTH 活性が低下すると共にリボソーム結合能が下がる。

 YaeJのPTH活性には，リンカー領域の長さが重要である。

 構造及びこれら生化学的な実験結果より，真正細菌由来のYaeJと真核生物 由来のICT1の異生物種間のアライメントを提示した。

GGQモチーフをもつ翻訳停滞解消因子のグループ分け

マウス由来のICT1（PDB code 1J26），C12orf65（2RSM）および大腸菌由 来の YaeJ（2RTX）の GGQ ドメインの立体構造，そして本研究の結果を基に した配列解析から GGQ モチーフをもつ翻訳停滞解消因子の分類が可能となっ

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た（Fig. 4-1）。GGQドメインは，Fig. 4-1に見られるように，どれも重ね合わ せができ基本的なアーキテクチュアは同じである。特にGGQモチーフ残基が存 在するβ1とβ2とを結びつけるループ（GGQループ）は，どの構造で非構造領 域となっており，またその長さが一致している（15残基）。一方，構造上最も大 きな相違点は，β2とβ3とを結びつける領域において見られる。RFのドメイン 3およびC12orf65では6残基からなるπ-HB turnを形成するのに対して，ICT1 およびYaeJ ではα ヘリックス（αi）が挿入されている。GGQ ドメイン以外で は，ICT1，YaeJ，C12orf65 での C 末端領域は，非構造領域である。ICT1 と YaeJは，第三章にあるようにリンカー領域の長さは異なるが，PTH活性に必要 な残基の保存性を示すアライメントができる。一方，ICT1とC12orf65は，と もに塩基性アミノ酸残基に富むが，共通性はない。

よって，真正細菌型のGGQモチーフをもつタンパク質（以下GGQファミリ ー）は，全体の配列から 3グループ，そして GGQ ドメインの構造から2 タイ プに分けられることが初めて示された（Fig. 4-2）。当研究室では，これらの因 子が，GGQモチーフをもちかつコドン非依存的（終止コドンを認識しない）な ことから，codon-independent RF（ciRF）と名付けたいと考えている。

ミトコンドリアでの二つの翻訳停滞解消因子

mtDNAにコードされているタンパク質は，基本的にすべて膜タンパク質であ

る（ヒトでは，13種類）。膜への輸送は，Oxa1によってリボソームが内膜に固 定され，合成されたタンパク質が膜へとすぐに輸送される(Ott and Herrmann,

2010)。この輸送と同時に折りたたみがされていくわけだが，このときの折り畳

みが律速となり翻訳が滞りやすいことが指摘されている(Hayes and Keiler, 2010)（Fig. 4-3）。この頻度の多さから，2つの停滞解消因子が必要なのかもし

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なぜ，tmRNA 系でなく ICT1/YaeJ 系のリボソーム解消機構がミトコンドリ ア翻訳系に採用されたのであろうか。一つには，ミトコンドリアというシンプ ルな系には，tmRNA による翻訳停滞解消機構が複雑すぎたのであろう。また，

進化的には，ミトコンドリアの祖先型となる細菌（α-proteobacteria）が存在し ていた時期は，tmRNAではなくICT1/YaeJしか存在しなかったかもしれない。

さらには，膜輸送での滞りには，ICT1/YaeJ しか対応できなかった可能性もあ る。

C12orf65の不完全なタンパク質と様々な疾患

本研究で明らかになったように，ミトコンドリアの翻訳においてICT1だけで

なくC12orf65も必須であることが明らかとなった。背景で述べたように，ヒト

においてc12orf65遺伝子にナンセンス変異が生じると，脳筋症が引き起こされ

る 。 こ こ で 注 目 す べ き は ， ナ ン セ ン ス 変 異 が 入 っ た こ と で NMD

（Nonsense-mediated mRNA decay）が起きてそのmRNAが分解され翻訳さ れないという事実はないということである（つまり，不完全なC12orf65タンパ ク質が発現されている）。最近，c12orf65遺伝子の別の位置でナンセンス変異が 起きている患者が見つかったが，興味深いことに，先の脳筋症の患者より症状 が軽い（Fig. 4-4）(Buchert et al., 2013; Shimazaki et al., 2012)。C12orf65タ ンパク質の切断された箇所を調べると，脳筋症の患者では，GGQドメインの途 中で切断されていて，このタンパク質はおそらく構造を取ることはできないが，

後から見つかった変異では，GGQドメインの構造は保てるが，C末端領域が短 くなっている。症状が軽いことを考慮すれば，この C 末端領域が短いタンパク 質は，わずかにPTH活性がある可能性が考えられる。C12orf65は，ICT1と異

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なり，C末端領域以外にもPTH活性に重要な役割をする領域があると考えてい る。候補として，ICT1とは異なり，GGQドメインのN端領域に疎水残基を多 くもつ特徴的な領域がある。これが，C12orf65の活性に何らかの役割があるこ とを予測している。

哺乳類のもう一つのミトコンドリアの翻訳停滞解消因子

哺乳類のミトコンドリアにおけるGGQファミリーに属するタンパク質は，こ れまでにあげたmtRF1a，ICT1，C12orf65の他にもう一つmtRF1が知られて いる。このタンパク質は，アミノ酸配列からミトコンドリアのRFであると初め は考えられていたが，実際はPTH活性をもたなかった（後になって終止コドン 依存的なPTH活性のあるmtRF1aがミトコンドリアで機能する“本当”のRFと して報告される）(Soleimanpour-Lichaei et al., 2007)。最近の立体構造を使っ

たmodelingによれば，ちょうど終止コドンを認識する部位（3つアミノ酸）が

他のRFとは異なってmRNAを認識できない位置にあることが分かった。これ より， mtRF1 も何らかの状況に対応する翻訳停滞解消因子ではないかと予想 されている(Huynen et al., 2012; Young et al., 2010)。ICT1やC12orf65とは異 なり，mtRF1は哺乳類しか保存されていないことを考えると，哺乳類特有のミ トコンドリアでの状況に対応すると考えるが，さらなる検討が必要である。

大腸菌における翻訳停滞解消機構～ tmRNA，YaeJ，ArfA ～

YaeJの報告と時期を同じくして，岡山大の阿保らによって，さらにもう一つ 翻訳停滞を解消できる ArfA（yhdL）タンパク質が発見され(Chadani et al.,

2010)，大腸菌では3種類の翻訳停滞解消因子が機能していることがわかってき

た。ArfA の最大の特徴の一つが，ArfA は tmRNA の系が機能しているときに は発現できない点である。ArfAのmRNAはC末端付近のヘアピン構造がRNase

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IIIに分解されるため nonstop mRNAとなってしまい，翻訳は滞ってしまう。

この翻訳停滞はtmRNA・SmpBにより解消されるが，ArfAはC末端にタグペ プチドが付加されるため分解されてしまい，結果としてほとんどが発現されな いことになる(Chadani et al., 2011b; Garza-Sánchez et al., 2011)。一方，例え ば翻訳停滞状態が頻発してtmRNA・SmpBが不足するような状況など，何らか

の理由で tmRNA の系が機能しなくなってしまった場合には，わずかに発現し

ていたArfA自身が自分の翻訳停滞を解消することによりArfAの発現が可能と なる。このように，ArfAはtmRNAの系をバックアップする安全装置と考えら れている。YaeJとは異なり，ArfA自体にはGGQ 配列はなく，PTH活性もな い。その代わり，RF2が ArfA と一緒に機能することで，ペプチジル tRNAを 加水分解することが示されている（ArfAとRF2が結合しているかなど，詳細に ついては現在のところ不明である）(Chadani et al., 2012; Shimizu, 2012)。

そのため，腸内細菌である大腸菌はtmRNAとYaeJタンパク質とArfAタン パク質の少なくとも 3 つの解消機構が機能していることになる。興味深いこと に，大腸菌では三者を独立に欠損させても致死的ではない。また，tmRNA と YaeJタンパク質の 2つの遺伝子を欠損させても致死的ではないが，tmRNAと ArfAタンパク質を欠損させると致死的である(Chadani et al., 2011b)。この致 死的な株に，YaeJタンパク質を過剰発現させるとリカバリーされる。これらの ことからtmRNA，YaeJ，ArfAによる3つのリボソーム解消機構が相互に関連

（相補的あるいはバックアップ）していることが考えられる。今後，3つのリボ ソーム解消機構の使い分け，関連など詳細に研究を進めなければならない。

結語

tmRNA・SmpBは真正細菌では普遍的に存在するが，それのバックアップ機

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構とされるArfAはグラム陰性菌の一部（ナイセリア目（Neisseriales）や腸内 細菌目（Enterobacteriales）など）にしか存在しない(Schaub et al., 2012)。一 方，YaeJは主にグラム陰性菌に広く存在する。つまり，グラム陰性菌の腸内細 菌では3種（tmRNA，YaeJ，ArfA），そのほかのグラム陰性菌は2種（tmRNA，

YaeJ），グラム陽性菌は 1 種（tmRNA）という場合が考えられる。また，真核 生物のミトコンドリアでは普遍的にYaeJオーソログICT1とC12orf65が存在 する。これらの事実は，生物種によって翻訳停滞解消因子の種類が異なってい ることを示しており，翻訳停滞解消機構の全体像が想像以上に複雑であること を物語っている。それぞれの因子は，翻訳停滞の頻度や質の変化に対応するた めに必要となったと想像できる。例えば，腸内細菌は特に増殖速度が速いので タンパク質の生産能が高くならねばならないことを考えれば，翻訳の滞りが多 発しているとも推定され3種も必要となるのかもしれない（Fig. 4-5）。

tmRNA非依存的な翻訳停滞解消機構の研究は始まってまもなく，やっとパズ

ルのピースがそろいだしたところである。これらのピースがどのように組み合 わされて，生物種に合わせてそれぞれの「翻訳トラブル解消システム」を形成 しているのか，その全容を理解するにはさらに多くの研究が必要とされる。