新技術説明会　様式例

(1)

皮膚細胞が乳酸菌を取り込むと

多能性細胞になる

熊本大学大学院生命科学研究部

准教授太田訓正

(2)

幹細胞とは

人間では一つの受精卵から、２００種類以上、約六〇兆個の細胞が作られ

る。

多種多様な細胞にも、もとをたどると親の細胞に行き当たり、それを

幹細胞

(3)

従来の幹細胞の特徴とその問題点

細胞

体性幹細胞

ES細胞

iPS細胞

作製法

体中に存在

胚を壊して作製

遺伝子を導入して作製

移植時の拒絶

自己細胞を利用すれ

ば拒絶が起きない

移植の際に免疫拒絶

の可能性がある

自己細胞を利用するの

で拒絶が起きない？

腫瘍化の恐れ

可能性は低い

可能性がある

(4)

新技術の特徴・従来技術との比較

• 従来からの問題点であった、

腫瘍形成の危険がない

多能

性細胞を作製することに成功した。

• 従来は生きた乳酸菌を用いたことで限られていたが、乳酸

菌由来リプログラム因子を用いれば、

大量

に多能性細胞を

作製することが可能となる。

• 本技術の適用により、乳酸菌は

無限に増殖

させることがで

きるため、コストを大幅に削減できることが期待される。

(5)

（Science ZERO）

真核細胞誕生のモデル

古細菌

真正細菌（乳酸菌など）

真正細菌の古細菌への感染

共生関係

Endosymbiotic theory

(Margulis L., 1970)

遺伝子

真正細菌の遺伝子移動

核

ミトコンドリア

核の出現

DNA の増幅

真核細胞の誕生

２０億年前

eubacteria （真正細菌）

archaebacteria （古細菌）

eucaryotes （真核細胞）

３５億年前

(6)

 私達のからだの細胞数:

60 兆個

(6 x 10

13 ₎

 腸における腸内細菌数:

1,000 兆個

(1 x 10

15 _)、

_1,000種類

以上の腸内細菌が棲息.

 １８５７年、パスツール博士が世界で最初に乳酸菌を発見

 現在までに、

約280 種類

の乳酸菌が同定されている

乳酸菌 [Lactic Acid Bacteria (LAB)]のバックグラウンド

Lactobacillus

Lactococcus

Streptococcus

Enterococcus

(7)

乳酸菌が細胞に直接作用し、どのような影響を持つかはほとんど

研究されていない

乳酸菌と細胞の研究は価値有り！

ロシアの生物学者イリヤ・メチニコフ（

1845-1916年）

「

ヨーグルト不老長寿説

」老化とは、腸内細菌の生成する腐敗物質による自家中毒

ヨーグルトに含まれる乳酸菌で腸内環境を改善すれば良い

インフルエンザ、ピロリ菌の撃退、癌、アレルギー、睡眠、ダイエット、etc…

(PNAS 2011)

腸内細菌は現代医療のトップランナー

(8)

(9)

3 cmシャーレ

(5 x 10

5 _{/ 2ml)}

0.1% Trypsin

1mM EDTA

乳酸菌

ヒト皮膚細胞 (Cell Applications社)

皮膚細胞用培養液 (Cell Applications社)

乳酸菌による細胞塊形成

(直径: 100 ~ 500

µm ~30 spheres / 5 x 10

5 ₎

アルカリフォスファターゼ染色

300 µm

(10)

取り込まれた乳酸菌はヒト皮膚細胞の細胞質に局在する

核

小胞体

細胞間隙

vacuole

細胞膜

乳酸菌

caveolar

ミトコンドリア

16S ribosomal RNA

LAB-incorporated (LAB-in) cells

_{抗ー細胞壁抗体}

(11)

解離

LAB-in cells

は自己増殖を持たない

Dissociation Medium for ES cells

Trypsin, 10 mg/ml Collagenase IV, KSR, 1M CaCl

₂

37℃, 5~20 min

(12)

LAB-in cellsの多能性マーカー発現

RT-PCR

Quantative-PCR

ICC

(13)

シャーレ内における細胞分化誘導– (1)

α-fetoprotein

Tuj1

vimentin

desmin

100 µm

α-fetoprotein: (内胚葉)

Tuj1: (外胚葉)

vimentin: (外胚葉)

desmin: (中胚葉)

浮遊状態

DMEM/F12 containing 1% FCS

5 ng/ml basic FGF

2 週間

(14)

α-SMA: (中胚葉)

Desmin: (中胚葉)

Tuj1: (外胚葉)

GFAP: (外胚葉)

接着状態

(laminin+PLL)

DMEM/F12 containing 1% FCS

5 ng/ml basic FGF

シャーレ内における細胞分化誘導– (２)

2 週間

(15)

軟骨細胞

骨細胞

脂肪細胞

LAB-in cells clusters were cultured for 3 weeks in STEMPRO Adipogenesis,

Chondrogenesis, or Osteogenesis Differentiation Medium (GIBCO).

脂肪細胞:

Oil Red O 染色

骨細胞: Alizarin Red 染色

軟骨細胞:

Alcian Blue 染色

2 週間

3 週間

_adi

_ost

_cho

(16)

control

LAB-in cells

(5 x 10

5 _{/ 20}

µl)

免疫不全マウス精巣

３ヶ月後

解析

control

LAB-in cells

を移植しても腫瘍は形成されない

(17)

α-fetoprotein: (内胚葉)

NF: (外胚葉)

α-SMA: (中胚葉)

LAB-in cellsの生体内における細胞分化誘導

LAB-in cellsはin vivo & in vitroにおいて、

(18)

25,909 遺伝子

(A)

(B)

多能性に関わる３７遺伝子

NANOG x7.6



OCT3/4 x2.9



SOX2 x2.9



KLF4 x1.0

c-Myc x1.7



遺伝子発現プロファイルの比較

ヒト皮膚細胞

&

ヒト皮膚細胞＋乳酸菌

125 遺伝子 > 30 倍

156 遺伝子 < 30 倍

ヒト皮膚細胞

&

ヒト皮膚細胞＋乳酸菌

4,099 遺伝子 > 2 倍

3,481 遺伝子 < 2 倍

(19)

LAB-in cells

ではHOX遺伝子の発現が劇的に減少する

• 156 遺伝子 < 30 倍

• 発生に関わる遺伝子：43 遺伝子

• 21/43 遺伝子が

HOX 遺伝子

HOX 遺伝子群

cho.6

cho.11

cho.15

cho.2

乳酸菌を取り込んだ細胞は、位置情報を失い、多能性を獲得する

no ProbeName UniGeneID GeneSymbol GeneName Description [Bala-HGF]vs[C-HGF] Fold change Regulation [Bala-HGF]vs[C-HGF] 1 A_24_P124558 HOXC8 Hs.664500 homeobox C8 Homo sapiens homeobox C8 (HOXC8), mRNA [NM_022658] 594.18225 down 2 A_23_P500998 HOXA9 Hs.659350 homeobox A9 Homo sapiens homeobox A9 (HOXA9),

mRNA [NM_152739] 592.35516 down 3 A_23_P70968 HOXA7 Hs.660918 homeobox A7 Homo sapiens homeobox A7 (HOXA7),

mRNA [NM_006896] 547.446 down 4 A_23_P363316 HOXB5 Hs.654456 homeobox B5 Homo sapiens homeobox B5 (HOXB5), mRNA [NM_002147] 489.89343 down 5 A_23_P66682 HOXB6 Hs.98428 homeobox B6 Homo sapiens homeobox B6 (HOXB6),

mRNA [NM_018952] 385.91574 down 6 A_33_P3300965 HOXC6 Hs.549040 homeobox C6 Homo sapiens homeobox C6 (HOXC6),

transcript variant 2, mRNA [NM_153693] 247.46118 down 7 A_24_P77904 HOXA10 Hs.110637 homeobox A10 Homo sapiens homeobox A10 (HOXA10), transcript variant 1, mRNA [NM_018951] 212.5776 down 8 A_23_P7313 SPP1 Hs.313 secreted phosphoprotein 1

Homo sapiens secreted phosphoprotein 1 (SPP1), transcript variant 1, mRNA [NM_001040058]

170.12749 down 9 A_23_P374695 TEK Hs.89640 TEK tyrosine kinase, endothelial Homo sapiens TEK tyrosine kinase, endothelial (TEK), mRNA [NM_000459] 168.16338 down 10 A_33_P3264528 HOXA11 Hs.249171 homeobox A11 Homo sapiens homeobox A11 (HOXA11),

transcript variant 1, mRNA [NM_014620] 131.16129 down 12 A_24_P264943 COMP Hs.1584 cartilage oligomeric matrix protein Homo sapiens cartilage oligomeric matrix protein (COMP), mRNA [NM_000095] 126.96592 down 13 A_23_P25150 HOXC9 Hs.658823 homeobox C9 Homo sapiens homeobox C9 (HOXC9),

mRNA [NM_017409] 116.495 down 15 A_23_P55281 HOXB7 Hs.436181 homeobox B7 Homo sapiens homeobox B7 (HOXB7), mRNA [NM_004502] 98.938225 down 16 A_33_P3421243 AFP Hs.518808 alpha-fetoprotein Homo sapiens alpha-fetoprotein (AFP),

mRNA [NM_001134] 91.343994 down 17 A_23_P370588 HOXB8 Hs.514292 homeobox B8 Homo sapiens homeobox B8 (HOXB8), mRNA [NM_024016] 76.56639 down 18 A_23_P65757 CCNB2 Hs.194698 cyclin B2 Homo sapiens cyclin B2 (CCNB2), mRNA

[NM_004701] 71.749176 down 19 A_33_P3288159 ASPM Hs.121028 asp (abnormal spindle) homolog,

microcephaly associated (Drosophila)

Homo sapiens asp (abnormal spindle) homolog, microcephaly associated (Drosophila) (ASPM), mRNA [NM_018136]

71.65447 down 20 A_23_P215634 IGFBP3 Hs.450230 insulin-like growth factor binding protein 3

Homo sapiens insulin-like growth factor binding protein 3 (IGFBP3), transcript variant 1, mRNA [NM_001013398]

67.36516 down 21 A_23_P316511 HOXB3 Hs.654560 homeobox B3 Homo sapiens homeobox B3 (HOXB3), mRNA [NM_002146] 65.995636 down 22 A_23_P52017 ASPM Hs.121028 asp (abnormal spindle) homolog,

microcephaly associated (Drosophila)

Homo sapiens asp (abnormal spindle) homolog, microcephaly associated (Drosophila) (ASPM), mRNA [NM_018136]

65.810745 down 23 A_33_P3271273 HOXB2 Hs.514289 homeobox B2 Homo sapiens homeobox B2 (HOXB2),

mRNA [NM_002145] 60.374454 down 24 A_33_P3377529 HOXA4 Hs.533357 homeobox A4 Homo sapiens homeobox A4 (HOXA4), mRNA [NM_002141] 57.784496 down 25 A_23_P212844 TACC3 Hs.104019 transforming, acidic coiled-coil containing

protein 3

Homo sapiens transforming, acidic coiled-coil containing protein 3 (TACC3), mRNA [NM_006342]

53.95437 down 26 A_23_P210176 ITGA6 Hs.133397 integrin, alpha 6 Homo sapiens integrin, alpha 6 (ITGA6),

transcript variant 2, mRNA [NM_000210] 53.341675 down 27 A_23_P423237 SGCG Hs.37167 sarcoglycan, gamma (35kDa dystrophin-associated glycoprotein)

Homo sapiens sarcoglycan, gamma (35kDa dystrophin-associated glycoprotein) (SGCG), mRNA [NM_000231]

50.23103 down 28 A_23_P24129 DKK1 Hs.40499 dickkopf homolog 1 (Xenopus laevis)

Homo sapiens dickkopf homolog 1 (Xenopus laevis) (DKK1), mRNA [NM_012242]

49.39177 down 29 A_23_P163567 SMPD3 Hs.368421 sphingomyelin phosphodiesterase 3, neutral

membrane (neutral sphingomyelinase II)

Homo sapiens sphingomyelin phosphodiesterase 3, neutral membrane (neutral sphingomyelinase II) (SMPD3), mRNA [NM_018667]

49.283035 down 30 A_24_P416370 HOXB4 Hs.664706 homeobox B4 Homo sapiens homeobox B4 (HOXB4), mRNA [NM_024015] 48.990253 down 31 A_33_P3330149 PAX6 Hs.270303 paired box 6 Homo sapiens paired box 6 (PAX6),

transcript variant 1, mRNA [NM_000280] 46.525337 down 32 A_24_P30557 TBX5 Hs.381715 T-box 5 Homo sapiens T-box 5 (TBX5), transcript

variant 1, mRNA [NM_000192] 45.041744 down 33 A_23_P146274 STMN2 Hs.521651 stathmin-like 2 Homo sapiens stathmin-like 2 (STMN2), mRNA [NM_007029] 43.262432 down 34 A_23_P122197 CCNB1 Hs.23960 cyclin B1 Homo sapiens cyclin B1 (CCNB1), mRNA

[NM_031966] 42.742027 down 35 A_23_P100127 CASC5 Hs.181855 cancer susceptibility candidate 5

Homo sapiens cancer susceptibility candidate 5 (CASC5), transcript variant 1, mRNA [NM_170589]

42.700485 down 36 A_23_P373521 HAND2 Hs.388245 heart and neural crest derivatives

expressed 2

Homo sapiens heart and neural crest derivatives expressed 2 (HAND2), mRNA [NM_021973]

41.600903 down 37 A_23_P167159 SCRG1 Hs.7122 stimulator of chondrogenesis 1 Homo sapiens stimulator of chondrogenesis

1 (SCRG1), mRNA [NM_007281] 39.337242 down 38 A_23_P215454 ELN Hs.647061 elastin Homo sapiens elastin (ELN), transcript variant 1, mRNA [NM_000501] 37.867306 down 39 A_23_P157136 SCIN Hs.655515 scinderin Homo sapiens scinderin (SCIN), transcript

variant 2, mRNA [NM_033128] 35.781925 down 40 A_23_P58321 CCNA2 Hs.58974 cyclin A2 Homo sapiens cyclin A2 (CCNA2), mRNA

[NM_001237] 33.80436 down 41 A_23_P501538 HOXA3 Hs.659337 homeobox A3 Homo sapiens homeobox A3 (HOXA3), transcript variant 2, mRNA [NM_153631] 33.353687 down 42 A_23_P107283 HOXB2 Hs.514289 homeobox B2 Homo sapiens homeobox B2 (HOXB2),

mRNA [NM_002145] 31.19959 down 43 A_23_P96158 KRT17 Hs.2785 keratin 17 Homo sapiens keratin 17 (KRT17), mRNA [NM_000422] 30.959732 down

HOXC8

:

594 倍



HOXB2

: 31 倍



1

(20)

ほんまか？ほんまや！

(Cell, 152, 51-67, 2013)

Trypsin

EDTA

乳酸菌

ヒト皮膚細胞

外胚葉

中胚葉

内胚葉

(21)

500 µm

乳酸菌由来リプログラム因子による細胞塊形成

(5 x 10

5 _{/ 2ml)}

0.1% Trypsin

1mM EDTA

ヒト皮膚細胞

皮膚細胞用培養液

乳酸菌由来

リプログラム因子

?

(22)

脂肪細胞

骨細胞

軟骨細胞

(A)

(B)

(C)

(D)

(23)

A549細胞

＋

乳酸菌成分

２週間

肺がん細胞

A549

Trypsin

EDTA

乳酸菌由来

リプログラム因子

乳酸菌由来因子による肺がん細胞のリプログラミング

−１

O

c

t3/4

O

c

t3/4

S

o

x2

S

o

x2

β-ac

ti

n

β-ac

ti

n

Nanog

A549細胞

A549細胞 + 乳酸菌成分

G

D

F

-3

Rex

1 E

C

AT

FG

F4

p15

p16

A

RF

G

D

F

-3

Rex

1 E

C

AT

FG

F4

p15

p16

A

RF

(24)

A549細胞

＋

乳酸菌成分

２週間

Trypsin

EDTA

肺がん細胞

A549

乳酸菌由来

リプログラム因子

乳酸菌由来因子による肺がん細胞のリプログラミング

−２

骨細胞

脂肪細胞

(25)

DAPI

α-fetoprotein

merge

DAPI

Neurofilament

merge

乳酸菌由来因子による肺がん細胞のリプログラミング

−３

Trypsin

EDTA

肺がん細胞

A549

乳酸菌由来

リプログラム因子

接着状態

(laminin+PLL)

DMEM/F12 containing 1% FCS

bFGF (5 ng/ml )

(26)

２週間

Trypsin

EDTA

肝がん細胞

HepG2

乳酸菌由来

リプログラム因子

乳酸菌由来因子による肝がん細胞のリプログラミング

HepG2細胞

＋

乳酸菌成分

脂肪細胞

骨細胞

(27)

２週間

Trypsin

EDTA

乳がん細胞

MCF7

乳酸菌由来

リプログラム因子

乳酸菌由来因子による乳がん細胞のリプログラミング

MCF7細胞

_＋

乳酸菌成分

脂肪細胞

骨細胞

(28)

想定される用途

• 本技術の特徴を、

癌化しない多能性細胞

の作製

に適用できる。

• 乳酸菌由来リプログラム因子を癌細胞に作用す

ることにより、細胞増殖が抑えられることから、

安全・安心な抗がん剤

の開発に展開することも

可能と思われる。

(29)

実用化に向けた

_課題

• 乳酸菌由来リプログラム因子の同定について、HPLCによ

るピークが同定できたが、個々の分子同定が未解決。

(30)

企業への期待

• 未解決の乳酸菌由来リプログラム因子の同定につ

いては、マススペクトロ解析の技術により克服でき

ると考えている。

• 抗がん剤

として、動物試験による評価（毒性試験・

有効性）の技術を持つ、企業との共同研究を希望。

• また、癌制御因子の探索を考えている企業には、

本乳酸菌由来リプログラム因子

の導入が有効と思

われる。

(31)

(32)

産学連携の経歴

2013年７月現在、民間３社と共同研究に向けて、

研究内容等を検討中。

(33)

お問い合わせ先

熊本大学

コーディネーター松本泰彦

ＴＥＬ

096－342 － 3209

ＦＡＸ

096－342 － 3239

e-mail [email protected]

新技術説明会 様式例

皮膚細胞が乳酸菌を取り込むと

多能性細胞になる

熊本大学大学院生命科学研究部

准教授 太田 訓正

幹細胞とは

人間では一つの受精卵から、２００種類以上、約六〇兆個の細胞が作られ

る。

多種多様な細胞にも、もとをたどると親の細胞に行き当たり、それを

幹細胞

従来の幹細胞の特徴とその問題点

細胞

体性幹細胞

ES細胞

iPS細胞

作製法

体中に存在

胚を壊して作製

遺伝子を導入して作製

移植時の拒絶

自己細胞を利用すれ

ば拒絶が起きない

移植の際に免疫拒絶

の可能性がある

自己細胞を利用するの

で拒絶が起きない？

腫瘍化の恐れ

可能性は低い

可能性がある

可能性がある

新技術の特徴・従来技術との比較

• 従来からの問題点であった、

腫瘍形成の危険がない

多能

性細胞を作製することに成功した。

• 従来は生きた乳酸菌を用いたことで限られていたが、乳酸

菌由来リプログラム因子を用いれば、

大量

に多能性細胞を

作製することが可能となる。

• 本技術の適用により、乳酸菌は

無限に増殖

させることがで

きるため、コストを大幅に削減できることが期待される。

（Science ZERO）

真核細胞誕生のモデル

古細菌

真正細菌（乳酸菌など）

真正細菌の古細菌への感染

共生関係

Endosymbiotic theory

(Margulis L., 1970)

遺伝子

真正細菌の遺伝子移動

核

ミトコンドリア

核の出現

DNA の増幅

真核細胞の誕生

２０億年前

eubacteria （真正細菌）

archaebacteria （古細菌）

eucaryotes （真核細胞）

３５億年前

 私達のからだの細胞数:

60 兆個

(6 x 10

13

)

 腸における腸内細菌数:

1,000 兆個

(1 x 10

15

)、

1,000種類

以上の腸内細菌が棲息.

 １８５７年、パスツール博士が世界で最初に乳酸菌を発見

 現在までに、

約280 種類

の乳酸菌が同定されている

新技術説明会　様式例

准教授太田訓正

₎

_)、

_1,000種類

」老化とは、腸内細菌の生成する腐敗物質による自家中毒

_{/ 2ml)}

₎

_{抗ー細胞壁抗体}

₂