緒 言 1960年から2000年における日本を含む主要５カ国では男 性膀胱癌死亡者数は10万人当たり200人と低いが，近年は増 加の傾向にある1)．また，腫瘍切除後も再発率が非常に高 いことが知られていることより，膀胱癌発生機序の基盤的 研究が重要な課題となっている． 以前の研究で，膀胱癌には多彩な遺伝子の変異がみられ ることや早期癌は進行癌よりも遺伝的な変異がほとんどみ られないことが報告されている2,3） ． での膀胱上皮 細胞の形質転換は染色体20ｑ13.2の増幅に関連しており， この染色体にある遺伝子の増幅と高発現が膀胱癌発生の早 期に重要な役割を担っているのではないかと示唆されてい た4) ．一方，細胞内総核酸量の定量分析や，DNA 増幅また は欠損を同定するための特異的なプローブを用いる FISH 法（Fluorescence in situ hybridization；蛍光 in situ ハイ ブリッド形成法）により，膀胱癌の診断を目的とした異数 性染色体について研究がなされている5,6） ．MD Anderson の Sen らのグループは，以前，16症例の膀胱癌患者より採 取した癌細胞を20ｑ13.2に位置する AuroraﾝA 遺伝子の 特異的なプローブで FISH 分析を行なったところ，その遺 伝子の増幅を発見した7)．更に AuroraﾝA 遺伝子の増幅は 腫瘍の悪性度と染色体異数性に相関していた．このことは， AuroraﾝA 遺伝子の増幅が臨床的に悪性を示す異数体細胞 への変化を引き起こし，膀胱癌発生に重要な役割を担って いる可能性を示している．ベイラー医科大学の Goepfert ら のグループは，ラットに発ガン物質を投与したところ正常
ヒト膀胱上皮細胞における AuroraﾝA 遺伝子の過剰
発現と中心体の異常複製，染色体異常の研究
田 中 規 幹
岡山大学大学院医歯薬学総合研究科 分子遺伝学 （指導：清水憲二教授）AuroraﾝA/STK15/BTAK overexpression induces centrosome amplification､
chromosomal instability､ and transformation in human urothelial cells
Noriyoshi Tanaka
Department of Molecular Genetics､ Okayama University Graduate School of Medicine､ Dentistry and Pharmaceutical Sciences､ Okayama 700ﾝ8558､ Japan
ﾛDirector：Prof｡ K｡ Shimizuﾜ
AuroraﾝA/STK 15/BTAK kinase encoding gene､ located on chromosome 20q13､ is frequently amplified and overexpressed in human cancers｡ Sen ｡ previously demonstrated that AuroraﾝA amplification and overexpression are associated with aneuploidy and clinically aggressive bladder cancer ﾛJ Natl Cancer Inst ﾛ2002ﾜ 94､ 1320ﾝ1329ﾜ｡ To examine if this association is the direct result of AuroraﾝA gene amplification and overexpression､ an immortalized human urothelial cell line ﾛSVﾝHUCﾜ was infected with an adenoviral AuroraﾝAﾝgreen fluorescent protein ﾛAdﾝ AuroraﾝAﾝGFPﾜ fusion construct inducing ectopic expression of the resulting fusion protein｡ Controls included mock-infected and adenoviralﾝGFP mock-infected cells｡ Ectopic expression of transduced AuroraﾝA did not alter the doubling time of the SVﾝHUC cells but significantly increased the number of cells with multiple centrosomes displaying aneuploidy and increased colony formation in soft agar｡ This is the first report demonstrating that overexpression of AuroraﾝA induces centrosome anomalies together with chromosomal instability and malignant transformation-associated phenotypic changes in immortalized human urothelial cells､ thus supporting the hypothesis that this gene plays an important role in the development of aggressive bladder cancer｡
原 著
岡山医学会雑誌 第119巻 May 2007, pp｡ 33-39 キーワード：オーロラキナーゼﾝＡ（AuroraﾝA），中心体（centrosome），染色体不安定性（chromosomal instability）， 膀胱癌（bladder cancer） 平成18年８月７日受理 〒880ﾝ0052 宮崎市丸山２ﾝ112ﾝ１ ブレストピアなんば病院 電話：0985ﾝ32ﾝ7170 FAX：0985ﾝ20ﾝ1319 Eﾝmail：n｡tanaka＠breastopia｡orgの連鎖分析と一倍体地図を用いた解析により AuroraﾝA 遺伝子が同定された9) ． これらのデータに基づき，ヒト正常膀胱上皮細胞が癌化 する過程で高発現された AuroraﾝA 遺伝子は，悪性を示す 異数体細胞の出現と形質転換を導く重要な遺伝因子ではな いかという仮説を立てた．本研究では，腫瘍性のないヒト 膀胱上皮細胞株に AuroraﾝA 遺伝子発現アデノウイルス を感染させ，その細胞表現型を分析して上記の仮説を検討 した．AuroraﾝA 遺伝子発現アデノウイルス感染細胞では， 軟寒天培地中でのコロニー形成数，異数体の発生頻度およ び３個以上の中心体を持つ細胞数が有意に増えていた．以 上の結果は，ヒト膀胱上皮細胞の悪性を示す形質転換に AuroraﾝA 遺伝子の高発現が遺伝子的に深く関わっている ことを示唆する初めての結果である．またこれらの結果は， 膀胱癌の発生において AuroraﾝA 遺伝子が重要な役割を 担っている事を示した基盤的データであり，これまでに報 告された臨床の結果を十分裏付けるものであった． 材料と方法 １. 細胞
The Simian virus 40（SV40）を用いて継代培養されたヒ ト由来の正常膀胱上皮細胞（The Simian virus 40（SV40) immortalized human urothelial cell line SVﾝHUC，ウイン スコンスン大学の C｡ A｡ Reznikoff より提供）をペニシリ ン，ストレプトマイシン，１％牛胎児血清アルブミン，イ ンシュリン，ヒト由来トランスフェリン，ハイドロコルチ ゾン，Ｌﾝグルタミン，デキストロースと非必須アミノ酸を 加 え た Ham s F-12 medium (GIBCO､ Grand Island､ NY ） で培養した10)．
２. 発現ベクター
AuroraﾝA 遺伝子と緑色蛍光タンパク質発現アデノウイ ル ス（ Adenovirus AuroraﾝAﾝgreen fluorescence protein (AdﾝAuroraﾝAﾝGFP））は，前述のように pEGFPﾝAurora ﾝA の Eco47VﾝBamHI 断片を pCA14の EcoRVﾝBgla に挿 入後，それをアデノウイルスに導入して作成した11)．cDNA を 導 入 し て い な い ア デ ノ ウ イ ル ス コ ン ト ロ ー ル （Adenovirus control (AdﾝCTR）），および緑色蛍光タンパ ク 質 を 導 入 し た ア デ ノ ウ イ ル ス（ Adenovirus green fluorescence protein (AdﾝGFP））は，それぞれ既報のよう に作成した12)
．組み換えアデノウイルスの作成法と力価測 定方法（50％ Tissue Culture Infectious Dose（TCID50）法） は既報のように行なった11)．
個の細胞（100ﾗ）をそれぞれ24ウエルずつ分注した． mock，AdﾝCTR，AdﾝAuroraﾝAﾝGFP を培養液で希釈し 感染多重度（multiplicity of infection (MOI））５で感染さ せた．１％グルタルアルデヒド溶液で細胞を固定し，0.5％ クリスタルバイオレットのメタノール溶液で染色した．プ レートにソレソン溶液（0.025 M sodium citrate､ 0.025 M citric acid in 50％ methanol）を（100ﾗ）添加し，540ﾌ 波 長の吸光度を測定した13)． ４. ウエスタンブロッテイング ６ウエルマイクロプレートに培養したそれぞれの細胞に アデノウイルスを感染させた．感染後４日目までの各日ご とに，細胞溶解液（10ﾋ TrisﾝHCl (pH ７）；140ﾋ NaCl； ３ﾋ MgCl2；0.5％ Nonidet Pﾝ40；２ﾋ phenylmethylsul-fonyl fluoride；５ﾋ dithiothreitol）を用いてタンパク質を 抽出した．14,000ｇ10分間，遠心分離し上清を抽出した後， Bradford 色素結合法でタンパク質濃度測定を行なった．そ れぞれ抽出したタンパク質を12％ SDSﾝPAGE（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）で電気 泳動分離し，その分離したタンパク質を孔径0.2マイクロｍ のニトロセルロース膜に転写緩衝液［１×Tris Gly transfer buffer (25 ×Tris Gly transfer buffer；Invitrogen､ Carlsbad､ CA），５％ v/v methanol］下で転写した．転写 された膜をブロッキング液（５％スキムミルクを含む Tris-buffered saline (TBS)ﾝT（ 10 ﾋ TrisﾝHCl (pH 7.4 ）；150 ﾋ NaCl；0.1％ Tween 20）下で２時間ブロックした．５ ％スキムミルクを含む PBSﾝT 溶液で希釈した一次抗体 （rabbit polyclonal antiﾝAuroraﾝA antibody）で反応後， ５％スキムミルクを含む PBSﾝT 溶液で洗浄し，二次抗体 （goat anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugated IgG､ １：2,000 dilution；Santa Cruz Biotechnology Inc｡､ Santa Cruz､ CA）と室温１時間で反応させた．同様に洗浄後，検 出試薬 ECLﾝPlus（Enhanced ChemoluminescenceﾝPLUS､ Amersham Biosciences､ Piscataway､ NJ）を用いてバンド をＸ線フィルムに感光させた．
５. 蛍光免疫染色
PolyﾝLﾝlysine 処理したカバーガラス上の細胞を100％メ タ ノ ー ル で − 20 ℃ ５ 分 間 固 定 し た ． そ の 後 ， PBS （phosphate-buffered saline）緩衝液で２回洗浄後，PBS で 希釈した５％ヤギ血清（Vector Laboratories､ Burlingame､ CA）で室温１時間，ブロッキングを行なった．ブロッキン グ液で希釈した抗ｺﾝチューブリン抗体（antiﾝｺﾝtubulin mouse antibody､ Sigma Chemical Corp､ St｡ Louis､ MO； １：2,000希釈）で室温１時間反応させた．PBS で３回洗
浄後，同様に抗テキサスレッドコンジュゲート抗体（Texas Red-conjugated anti-mouse antibody､ Vector Labora-tories；１：500希釈）を反応させた．PBS で３回洗浄後， DNA に 結 合 す る 蛍 光 色 素 DAPI (4 ,6 -diamidinoﾝ 2 ﾝ phenylindole）を室温10分間反応させた．蛍光用封入剤 （ Perma-Fluor､ Lipshaw/Immunon；Pittsburgh､ PA ）を 用いてカバーガラス上の細胞をスライドガラスに封入し た．CCD (charged-coupled device）機能を備えたニコン蛍 光顕微鏡で，Adobe Photoshop software (Adobe Systems Incorporated､ San Jose､ CA）下に撮影した．それぞれ500 個の細胞を観察し，３個以上の中心体を持つ細胞を中心体 複製異常としてカウントした．
６. In situ 蛍光ハイブリッド形成法（FISH､ Fluorescence in situ hybridization）と核 DNA 量の分析
AdﾝGFP と AdﾝAuroraﾝAﾝGFP にそれぞれ感染させた 分裂間期の細胞の第３，７，17番染色体をそれぞれに特異 的な標識プローブ（Vysis Inc｡､ Abbott Park､ Il）を用いて 分析した6)．蛍光顕微鏡で200個の核の蛍光標識結合部位の 数量分析を行った．コントロールとして腎癌患者から採取 した膀胱上皮細胞を用いた．高解像度 CCD 機能を備えた Leica DMRXA 蛍光顕微鏡で撮影した．核 DNA インデッ クスは，既報のようにフォイルゲン反応を用いて染色体染 色を行ない，末梢リンパ球に対する mock，AdﾝGFP と Ad ﾝAuroraﾝAﾝGFP 感染細胞の核 DNA 量の比率をフローサ イトメトリーで比較分析した6)．DNA インデックス1.2以 上を異数体と分類した． ７. 軟寒天コロニー形成試験
SVﾝHUC 細胞を mock，AdﾝGFP および AdﾝAuroraﾝA にそれぞれ感染させ，その１日後，１プレート当り１×104 個のそれぞれの細胞を UMﾝUCﾝ３細胞培養上清を含む軟 寒天と混合し60㎜プレートに５枚ずつ播き，37℃で14日間 細胞培養容器で培養した14) ．プレートは週に２回，倒立顕 微鏡で４倍または10倍の倍率で観察した．第１週に細胞小 塊が観察された．UMﾝUCﾝ３細胞培養上清のみのコントロ ールでは UMﾝUCﾝ３細胞の混入はなかった．プレートに播 いた２週間後に，30細胞以上で形成されたコロニーの数を プレートごとに記録した．この実験は独立して２回繰り返 して行った． ８. 統計分析 ２群間分散分析（ANOVA）法と Wilcoxon 法の片側検 定法を行なった． ﾝvalue＜0.05を有意差ありとした． 結 果 １. AuroraﾝA タンパク質の発現と細胞増殖測定 ヒ ト 正 常 膀 胱 上 皮 細 胞 SVﾝHUC に 導 入 さ れ た AuroraﾝA 遺伝子のタンパク質発現を調べるためにウエス タンブロットを行なった．抗 AuroraﾝA 抗体を用いて解析 すると Adenovirus AuroraﾝAﾝgreen fluorescence protein (AdﾝAuroraﾝAﾝGFP）感染細胞において AuroraﾝAﾝGFP タンパク質のバンドが検出された（図１）．Mock および cDNA を導入していない Adenovirus control (AdﾝCTR） 感染細胞より抽出したタンパク質からはバンドは検出され なかった．AuroraﾝAﾝGFP タンパク質のバンドが検出され た感染後１日目から４日目における細胞増殖速度を調べた ところ，各細胞間で細胞増殖速度の差はみられなかった（図 ２）．SVﾝHUC 細胞の細胞倍加時間は，約48時間であった． ２. 蛍光免疫染色 AuroraﾝA 高発現による中心体への影響について蛍光顕 微鏡を用いて解析を行なった．まず中心体の構成成分であ る ｺﾝtubulin を抗 ｺﾝtubulin 抗体で検出後，GFP マーカー の緑色蛍光を指標に AuroraﾝAﾝGFP 融合タンパク質の局 在を観察した．図３Ａで⒜は，抗 ｺﾝtubulin 抗体による中 心体の位置を，⒝は AuroraﾝAﾝGFP 融合タンパク質の局 在を示している．AuroraﾝAﾝGFP 融合タンパク質は中心体 部位に局在すること，AdﾝAuroraﾝAﾝGFP 感染細胞には中 心体を２個持つ細胞と３個以上持つ細胞が存在することが AuroraﾝA 遺伝子の過剰発現の研究：田中規幹 Aurora A ｹﾝActin １ ２ ３ Day２ １ ２ ３ Day１ １ ２ ３ Day３ １ ２ ３ Day４ 図１ ヒト正常膀胱上皮細胞 SVﾝHUC における AuroraﾝA タンパク質の発現確認 アデノウイルスベクター感染による遺伝子導入１日目から４日目の細胞からタンパク質を抽出後，抗 AuroraﾝA 抗体を用いたウエス タンブロットにて AuroraﾝA タンパク質の発現確認を行なった．レーン１；Mock コントロール（ウイルス非感染）細胞，レーン２； ５MOI での Adﾝcontrol (cDNA を導入していないアデノウイルスコントロール）感染細胞，レーン３；５MOI での AdﾝAuroraﾝAﾝ GFP 感染細胞．ローディングコントロールとして抗 ｹﾝactin 抗体を用いて ｹﾝactin の比較を行なった．
AdﾝGFP 感染細胞と比較して３個以上の中心体を持つ細 胞が有意に多く観察され，遺伝子導入３日後では対照の約 ６倍に達した（ ＝0.0014， ＝0.0085，図３Ｂ）．
３. In situ 蛍光ハイブリッド形成法（FISH､ Fluorescence in situ hybridization）と核 DNA 量の分析
AuroraﾝA 遺伝子発現と染色体異数化の関連を検討する ために，染色体特異的なセントロメアプローブを用いて， AdﾝGFP と AdﾝGFPﾝAuroraﾝA 感染細胞における第３， ７，17番染色体の FISH 分析を行った（図４）．通常の２倍 体染色体は不連続の２つのスポットが観察されたが，３個 以上のスポットは染色体の異数性を表していると思われた （未発表データー）．AdﾝAuroraﾝAﾝGFP 感染細胞では， 第３染色体のトリソミーまたはそれ以上の異数性染色体を 持った細胞数の割合は感染１日後で24％，２日後で35％， ３日後で34％，４日後で52％であった．同様に第７染色体 ではそれぞれ36％，39％，43％，63％，第17染色体ではそ れぞれ10％，18％，12％，45％であった．一方，コントロ ールの AdﾝGFP 感染細胞では，第３染色体では８∼23％ の頻度であった．この AuroraﾝA 遺伝子導入細胞で３スポ ット以上の染色体が検出される細胞の増加傾向は４回の繰 ３∼５％の異数性染色体細胞の出現頻度が観察されたが， Mock と AdﾝGFP 感染細胞では0.2∼0.3％の出現頻度で あった（未発表データー）．以上のデータより，ヒト膀胱上 皮細胞への AdﾝAuroraﾝAﾝGFP 感染による Aurora A 遺 伝子高発現は染色体の異数性を引き起こすことが強く示唆 された． ４. 軟寒天コロニー形成試験 足場非依存的に生存または分裂増殖する能力は，形質転 換された細胞の一つの性質である．そこで AuroraﾝA 遺伝 子を高発現させた細胞の足場非依存的増殖能を軟寒天コロ ニー形成試験にて検討した（図５Ａ）．Mock と AdﾝGFP 感染細胞では，コロニー数に有意な差はみられなかった． 一方，AdﾝAuroraﾝAﾝGFP 感染細胞は mock に対し約2.3 倍，AdﾝGFP 感染細胞に対し約1.7倍多くのコロニーを形 成し，統計的に有意な差を認めた（図５Ｂ）．また Adﾝ AuroraﾝAﾝGFP 感染細胞が形成したコロニーは，AdﾝGFP 感染細胞のコロニーより大きなサイズが観察された（図５ Ａ）． 考 察 近年，様々なタイプのヒト癌において中心体の異常複製 の報告がなされ始めている15ﾝ19）．中心体の異常複製がみら れると染色体の分配が正常に行なわれなくなり，結果的に 異数体となると考えられている．BTAK としても知られる 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 1 2 3 4 Day Absorbance 540 nm Mock AdﾝControl 5 MOI AdﾝAurora AﾝGFP 5 MOI
図２ AdﾝAuroraﾝAﾝGFP 感染細胞の細胞増殖
アデノウイルスベクター感染細胞 3×103
個を24ウエルずつに播 き，４日目までの細胞増殖をクリスタルバイオレット染色と540 ﾌの吸光度で測定した．Mock；Mock コントロール細胞，Adﾝ control ５MOI；５MOI での Adﾝcontrol 感染細胞，AdﾝAurora AﾝGFP ５MOI；５MOI での AdﾝAuroraﾝAﾝGFP 感染細胞． Day は感染後の日数を示している． 80 60 40 20 0 Chr 17 Chr 3 Chr 7 Chr 17 Chr 3 Chr 7 Chr 17 Chr 3 Chr 7 Chr 17 Chr 3 Chr 7 １ ２ ３ ４
Days after Transfection Ad/GFP 5 MOI Ad/Aurora A GFP 5 MOI Cells with ｧ３ Chromosomes (％) 図４ AdﾝAuroraﾝAﾝGFP 感染細胞における異数性染色体の 発生頻度 ウイルス感染後４日目までの細胞を第３，第７及び第17染色体 特異的プローブを用いて FISH 分析を行ない，各200個の細胞の うちトリソミーまたはそれ以上の染色体を持った細胞の割合を 計測した．AdﾝGFP ５MOI；５MOI での AdﾝGFP 感染細胞， AdﾝAurora AﾝGFP ５MOI；５MOI で の AdﾝAuroraﾝAﾝGFP 感染細胞．
AuroraﾝA 遺伝子の過剰発現の研究：田中規幹 ⒜ ｺﾝtubulin ⒝ Aurora AﾝGFP ⒞ DAPI ⒟ Merge A
Mock vs｡ AdﾝAurora AﾝGFP： ＝0.0014 AdﾝGFP vs｡ AdﾝAurora AﾝGFP： ＝0.0085
mock
AdﾝGFP 50 MOI
AdﾝAurora AﾝGFP 50 MOI 50 40 30 20 10 0 24 48 72 96 Time (hrs) B
Number of cells with
ｧ３ centrosomes (c) (a) (b) (d) 図３ AuroraﾝAﾝGFP 遺伝子導入による異数体細胞の出現 Ａ；ウイルス感染細胞における中心体の位置と Aurora A の局在を蛍光顕微鏡で観察した．⒜は抗 ｺﾝtubulin 抗体（赤色）による中心 体の位置，⒝は AuroraﾝAﾝGFP 融合タンパク質（緑色）の局在を，⒞は DAPI（青色）で核を，⒟は⒜∼⒞の重ね合わせ（Merge） を示している．Mock；Mock コントロール細胞，AdﾝGFP 50 MOI；50 MOI での AdﾝGFP 感染細胞，AdﾝAurora AﾝGFP 50 MOI； 50 MOI での AdﾝAuroraﾝAﾝGFP 感染細胞．Ｂ；それぞれ500個の細胞を蛍光顕微鏡で観察し，３個以上の中心体を持つ細胞の割合を 示した．ANOVA 解析により Mock と AdﾝAuroraﾝAﾝGFP 感染細胞の比較では ＝0.0014，AdﾝGFP と AdﾝAuroraﾝAﾝGFP 感染細 胞の比較では ＝0.0085であった（ANOVA test）． B ⒜ Mock (×2.5) ⒝ GFP (×2.5) ⒞ Aurora AﾝGFP (×2.5) ⒟ Aurora AﾝGFP (×10) ＊ ＊＊ Mock GFP Aurora 25 20 15 10 5 0 AﾝGFP A Number of colonies/ 1×10 4 cells (a) (b) (c) (d) 図５ AdﾝAuroraﾝAﾝGFP 感染細胞の軟寒天培地での足場非依存的増殖能 Ａ；ウイルス感染細胞（１×104 細胞）を軟寒天培地で２週間培養後のコロニー像．⒜Mock コントロール細胞（×2.5倍），⒝50 MOI での AdﾝGFP 感染細胞（×2.5倍），⒞50 MOI での AdﾝAuroraﾝAﾝGFP 感染細胞（×2.5倍），⒟50 MOI での AdﾝAuroraﾝAﾝGFP 感
染細胞（×10倍）．Ｂ；ウイルス感染細胞（１×104
細胞）を各５プレートの軟寒天培地で培養し，２週間後に30細胞以上で形成された
細胞塊をコロニー形成とし集計した．この実験は，２回繰り返して行った．（＊
ｐ＜0.001；Wilcoxon test による mock と AdﾝAurora
ﾝAﾝGFP 感染細胞の有意差検定，＊＊
察されることより AuroraﾝA 遺伝子の高発現が癌細胞の 発生機序に重要な役割を担っていると考えられている16) ． Sen らのグループは以前，AuroraﾝA 遺伝子の高発現は臨 床的に低分化で異数体のみられる膀胱癌と強く相関を示す 事を報告した7) ．そこで，異数体のような遺伝的不安定な 状態と AuroraﾝA 遺伝子の高発現の関連をより詳しく検 討する目的の為に本研究を行なった．まず，非腫瘍性のヒ ト膀胱上皮株化 SVﾝHUC 細胞 に AuroraﾝA 遺伝子をア デノウイルスで感染導入した．AuroraﾝA 遺伝子が高発現 した SVﾝHUC 細胞の増殖速度は，コントロールに比べて ほとんど差がみられなかった．しかし，AuroraﾝA 遺伝子 を導入された細胞は，中心体数，異数体出現頻度，軟寒天 コロニー形成数などが有意に多く観察された．特に，染色 体特異的なセントロメアプローブを用いた FISH 解析で は，遺伝子導入後４日後におよそ半数の細胞が染色体異数 性を示した．これらの結果より，AuroraﾝA 遺伝子が高発 現することによって，ヒト由来の膀胱上皮細胞は，染色体 異数性を含む悪性形質転換の表現型を示したと考えられ た．そして，AuroraﾝA 遺伝子が強力に発現すれば，より 悪性の膀胱癌となることが強く示唆された．AuroraﾝA の 具 体 的 な 作 用 機 序 は ま だ は っ き り し て い な い が ， AuroraﾝA 遺伝子が過剰発現すると DNA ダメージを受け た際にＧ２チェックポイントで細胞周期を停止する事がで きず，結果的に染色体の不安定性を増す事が報告されてい る20)．また，AuroraﾝA 遺伝子の過剰発現は，紡錘体機能 障害薬剤による紡錘体の欠如の状態でさえ細胞周期チェッ クポイントを乗り越えて細胞分裂を進めてしまうことが明 らかになった21)．これらの結果より癌細胞での染色体の異 数性発生に AuroraﾝA 遺伝子の過剰発現が関係している ことが示唆されたが，Ｇ２チェックポイントで停止できな くなる現象に直接関与するターゲット遺伝子はまだ明らか になっていない．現在のところ，AuroraﾝA 遺伝子がｐ53 の機能をダウンレギュレーションする22，23） ことやテロメア ーゼ活性をアップレギュレーションする24) ことが報告され ている．今回報告した AuroraﾝA 遺伝子が過剰発現してい るヒト膀胱上皮細胞は，悪性を呈する形質転換のメカニズ ムを探求するのに相応しいモデルとして研究応用されると 期待している． 謝 辞 本稿作成に当り，ご指導ならびに御校閲を頂いた岡山大学 理事・ 副学長清水信義先生，胸部腫瘍外科（第二外科）伊達洋至教授，分子 遺伝学 大内田守助教授，共同で実験およびご指導を頂いた MD 文 献
１) Marugame T and Kaneko S：Cancer Statistics Digest､ Comparison of Bladder Cancer Mortality in Five Countries： France､ Italy､ Japan､ UK and USA from the WHO Mortality Database (1960ﾝ2000) ｡ Jpn Clin Oncol (2005) 35，357ﾝ360． ２) Kallioniemi A､ Kallioniemi OP､ Citro G､ Sauter G､ DeVries S､
Kerschmann R､ Caroll P and Waldman F：Identification of gains and losses of DNA sequences in primary bladder cancer by comparative genomic hybridization｡ Genes Chromosomes Cancer (1995) 12，213ﾝ219．
３) Richter J､ Jiang F､ Gorog JP､ Sartorius G､ Egenter C､ Gasser TC､ Moch H､ Mihatsch MJ and Sauter G：Marked genetic differences between stage pTa and stage pT1 papillary bladder cancer detected by comparative genomic hybridization｡ Cancer Res (1997) 57，2860ﾝ2864．
４) Savelieva E､ Belair CD､ Newton MA､ DeVries S､ Gray JW､ Waldman F and Reznikoff CA：20q gain associates with immortalization：20q13.2 amplification correlates with genome instability in human papillomavirus 16 E7 transformed human uroepithelial cells｡ Oncogene (1997) 14，551ﾝ560．
５) de la Roza GL､ Hopkovitz A､ Caraway NP､ Kidd L､ Dinney CP､ Johnston D and Katz RL：DNA image analysis of urinary cytology：Prediction of recurrent transitional cell carcinoma｡ Mod Pathol (1996) ９，571ﾝ578．
６) Sarosdy MF､ Schellhammer P､ Bokinsky G､ Kahn P､ Chao R､ Yore L､ Zadra J､ Burzon D､ Osher G､ Bridge JA､ Anderson S､ Johansson SL､ Lieber M､ Soloway M and Flom K：Clinical evaluation of a multi-target fluorescent in situ hybridization assay for detection of bladder cancer｡ J Urol (2002) 168，1950ﾝ 1954．
７) Sen S､ Zhou H､ Zhang RD､ Yoon DS､ Vakar-Lopez F､ Ito S､ Jiang F､ Johnston D､ Grossman HB､ Ruifrok AC､ Katz RL､ Brinkley W and Czerniak B：Amplification/overexpression of a mitotic kinase gene in human bladder cancer｡ J Natl Cancer Inst (2002) 94，1320ﾝ1329．
８) Goepfert TM､ Adigun YE､ Zhong L､ Gay J､ Medina D and Brinkley WR：Centrosome amplification and overexpression of aurora A are early events in rat mammary carcinogenesis｡ Cancer Res (2002) 62，4115ﾝ4122．
９) Ewart-Toland A､ Briassouli P､ de Koning JP､ Mao JH､ Yuan J､ Chan F､ MacCarthy-Morrogh L､ Ponder BA､ Nagase H､ Burn J､ Ball S､ Almeida M､ Linardopoulos S and Balmain A： Identification of Stk 6/STK 15 as a candidate low-penetrance tumor-susceptibility gene in mouse and human｡ Nat Genet (2003) 34，403ﾝ412．
10) Christian BJ､ Loretz LJ､ Oberley TD and Reznikoff CA： Characterization of human uroepithelial cells immortalized in vitro by simian virus 40｡ Cancer Res (1987) 47，6066ﾝ6073． 11) Tanaka M and Grossman HB：Connexin 26 gene therapy of
human bladder cancer：Induction of growth suppression､ apoptosis､ and synergy with cisplatin｡ Hum Gene Ther (2001) 12，2225ﾝ2236．
12) Davies MA､ Lu Y､ Sano T､ Fang X､ Tang P､ LaPushin R､ Koul D､ Bookstein R､ Stokoe D､ Yung WK､ Mills GB and Steck PA： Adenoviral transgene expression of MMAC/PTEN in human glioma cells inhibits Akt activation and induces anoikis｡ Cancer Res (1998) 58，5285ﾝ5290．
13) Tanaka M､ Koul D､ Davies MA､ Liebert M､ Steck PA and Grossman HB：MMAC 1/PTEN inhibits cell growth and induces chemosensitivity to doxorubicin in human bladder cancer cells｡ Oncogene (2000) 19，5406ﾝ5412．
14) Grossman HB､ Wedemeyer G､ Ren L､ Wilson GN and Cox B： Improved growth of human urothelial carcinoma cell lines｡ J Urol (1986) 136，953ﾝ959．
15) Moritz KB and Sauer HW：Boveri s contributions to develop-mental biology-a challenge for today｡ Int J Dev Biol (1996) 40， 27ﾝ47．
16) Zhou H､ Kuang J､ Zhong L､ Kuo WL､ Gray JW､ Sahin A､ Brinkley BR and Sen S：Tumour amplified kinase STK15/ BTAK induces centrosome amplification､ aneuploidy and transformation｡ Nat Genet (1998) 20，189ﾝ193．
17) Pihan GA､ Purohit A､ Wallace J､ Malhotra R､ Liotta L and Doxsey SJ：Centrosome defects can account for cellular and genetic changes that characterize prostate cancer progression｡ Cancer Res (2001) 61，2212ﾝ2219．
18) Jiang F､ Caraway NP､ Sabichi AL､ Zhang HZ､ Ruitrok A､ Grossman HB､ Gu J､ Lerner SP､ Lippman S and Katz RL： Centrosomal abnormality is common in and a potential biomarker for bladder cancer｡ Int J Cancer (2003) 106，661ﾝ
665．
19) Kawamura K､ Izumi H､ Ma Z､ Ikeda R､ Moriyama M､ Tanaka T､ Nojima T､ Levin LS､ Fujikawa-Yamamoto K､ Suzuki K and Fukasawa K：Induction of centrosome amplification and chromosome instability in human bladder cancer cells by p53 mutation and cyclin E overexpression｡ Cancer Res (2004) 64， 4800ﾝ4809．
20) Marumoto T､ Hirota T､ Morisaki T､ Kunitoku N､ Zhang D､ Ichikawa Y､ Sasayama T､ Kuninaka S､ Mimori T､ Tamaki N､ Kimura M､ Okano Y and Saya H：Roles of auroraﾝA kinase in mitotic entry and G2 checkpoint in mammalian cells｡ Genes Cells (2002) ７，1173ﾝ1182．
21) Anand S､ Penrhyn-Lowe S and Venkitaraman AR：AURORAﾝ A amplification overrides the mitotic spindle assembly checkpoint､ inducing resistance to Taxol｡ Cancer Cell (2003) ３，51ﾝ62．
22) Katayama H､ Sasai K､ Kawai H､ Yuan ZM､ Bondaruk J､ Suzuki F､ Fujii S､ Arlinghaus RB､ Czerniak BA and Sen S： Phosphorylation by aurora kinase A induces Mdm 2ﾝmediated destabilization and inhibition of p53｡ Nat Genet (2004) 36，55ﾝ 62．
23) Liu Q､ Kaneko S､ Yang L､ Feldman RI､ Nicosia SV､ Chen J and Cheng JQ：AuroraﾝA abrogation of p53 DNA binding and transactivation activity by phosphorylation of serine 215｡ J Biol Chem (2004) 279，52175ﾝ52182．
24) Yang H､ Ou CC､ Feldman RI､ Nicosia SV､ Kruk PA and Cheng JQ：AuroraﾝA kinase regulates telomerase activity through c-Myc in human ovarian and breast epithelial cells｡ Cancer Res (2004) 64，463ﾝ467．
