角膜実質細胞によるコラ-ゲン分解の調節機序について
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(2) 博 士 学 位 論 文. 角 膜 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン分 解 の 調 節 機 序 につ い て. 平 成5年12月. 近畿 大学大 学 院 医 学 研 究 科 外科学系専攻(指 導:大 鳥利文 教授). 岡. 本. 純. 之. 助.
(3) 角 膜 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン分 解 の調 節 機 序 に つ い て. 近畿大学医学部眼科学教室 岡 本. 純之助. (指 導:大 鳥. mechanism. Regulatory. of. 利文. collagen. Junnosuke Department. of. School. of. (Director. 教 授). degradation. by. keratocytes.. Okamoto. Ophthalmology,. K inki. Medicine.. Osaka,. : Prof.. Toshifumi. University. Japan. Otori). ABSTRACT Excessive degradation. of stromal. fibrils occurs in corneal. Keratocytes. (corneal. degradation. in corneal. ulceration.. However,. degradation. in. ulceration. have. understand model. corneal. the pathobiology. in which. dimensionally. regulate. fibroblasts). collagen. collagen. measured degradation. of corneal. keratocytes. Using. this. were. model,. degradation. by the amount by. seem to play a primary. keratocytes. not. the. ulceration,. fully. in. a. I searched. for. any. of hydroxyproline depended. —1—. understood.. collagen. To. the. matrix. three. which. might. degradation. was. factors. Collagen in. on. of collagen. I developed a new in-vitro. cultured. by keratocytes.. role in collagen. mechanisms. been. ulceration.. the hydrolysate. number. of. Collagen cells,. the.
(4) concentration. of. cytokines. and. growth. fibroblast. growth. interleukin enhance Interleukin. lysosomal. factors. factor. interleukin. degradation. degradation. These. findings. degradation degradation. Key words : collagen. suggested played. important. factor. ( EGF ),. factor. in a dose antagonized. When phagocytic. 1 ( IGF-1 ) ,. both. found. dependent. IL- 1. also. activity. a decrease extracellular. to. manner.. the stimulatory. by the addition. showed that. various. growth. growth. keratocytes.. were inhibited. effect. stimulated. or intracellular. of cytochalasin. B. in the presence. of. and. roles in the stimulatory. intracellular effect of IL- 1. by keratocytes.. degradation,. (IL- 1 ), interleukin cytochalasin. by. degradation. Among. 6 (IL- 6 ), only IL- 1 was. (IL- 1 ra). by keratocytes.. collagen. epidermal. by keratocytes. collagen synthesis. as. of incubation.. ( FGF ) , insulin-like. enzyme activities. on collagen. such. antagonist. or chloroquine,. collagen. the period. 1 receptor on. collagenase. IL- 1 .. and. 1 (IL- 1) and collagen. of IL-1. collagen. keratocytes, 1 receptor. B, chloroquine.. collagenase,. antagonist. interleukin. (IL- 1 ra),. 1.
(5) 緒. 言 角 膜 は,5-6層. の 上 皮 細 胞 か ら な る 上 皮 層,角. 膜 全 体 の90%を. 占 め る角 膜. 実 質 層 お よ び 一 層 の 細 胞 か ら な る 内 皮 細 胞 層 か ら 構 成 さ れ て い る.角 生 じ た 時,角. 膜 上 皮 の み の 欠 損 の 場 合 は,速. や か に 創 傷 治 癒 が 行 わ れ る が,種. の 原 因 に よ っ て 角 膜 実 質 に ま で 障 害 が 及 ぶ と,時 生 じ,臨. 床 的 に は 角 膜 潰 瘍 の 状 態 と な る.角. 良 の 疾 患 の1っ. で あ る.実. ゲ ン線 維 間 に 存 在 し,角. 膜 に障 害 が 々. と して実 質 コ ラー ゲ ンの融 解 が. 膜 潰 瘍 は,現. 在 で も難 治 性 で 予 後 不. 質 の 唯 一 の 細 胞 成 分 で あ る 角 膜 実 質 細 胞 は1型. コ ラー. 膜 実質 細 胞 は実 質 の主 成 分 で あ る コ ラーゲ ンの合 成 と分. 解 に 重 要 な 役 割 を 演 じ て い る.コ. ラ ー ゲ ン の 分 解 が 合 成 に 比 し元 進 し て い る 状 態. が 角 膜 潰 瘍 の 病 態 で あ る. 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン 分 解 に は,細 す る1群. 胞 か ら 産 生 さ れ るcollagenaseを. の 蛋 白 分 解 酵 素(Matrixmetalloproteinases,MMPs)に. の 分 解 の 経 路 と,細 れ る 経 路 の2っ. が 示 唆 さ れ て い る1.角 産 生 し2-6,潰. 膜 実 質 細 胞 は 細 胞 外 で の コ ラ ー ゲ ン分 解 瘍 を 生 じた角 膜 で は実 質 細 胞 の 周 囲 に. 局 在 し て い る こ と が 観 察 さ れ て い る5.さ. collagenase(MMP-1)以 (MMP-2)な. らに培 養 角 膜 実 質 細 胞 が. 外 に もstromelysin(MMP-3)や72kDのgelatinase. ど を 産 生 す る こ と が 報 告 さ れ て い る6.し. は い ず れ も 不 活 性 型 で 細 胞 か ら分 泌 さ れ,タ 等)の. よ る細 胞 外 で. 胞 に よ り コ ラ ー ゲ ン線 維 が 貧 食 さ れ 細 胞 内 消 化 に よ り分 解 さ. に 関 与 す るMMPsを collagenaseが. は じめ と. か し,こ. れ らの 分 解酵 素. ンパ ク 分 解 酵 素(プ. ラ ス ミノーゲ ン. 働 き に よ り ペ プ チ ド鎖 が 修 飾 さ れ て 活 性 化 さ れ る と い う メ カ ニ ズ ム が 必 要. で あ る.し. か し,生. 体 に お い て はcollagenase阻. ofmetalloproteinase(TIMP)な に は 未 だ 不 明 な 点 が 多 い 。 一 方,細. 害 物 質 で あ るtissueinhibitor. ど の 分 泌 も 同 時 に 生 じ て お り,角. 膜 潰瘍 の病態. 胞 内 で の コ ラ ー ゲ ン分 解 の 経 路 に っ い て は コ. ラ ー ゲ ン 線 維 が 細 胞 内 へ 取 り込 ま れ る 機 序(負. 食)と. 細 胞 内 で のlysosomeな. に よ る 細 胞 内 で の 消 化 の 機 序 が 関 与 し て い る と 考 え ら れ て い る.皮 は コ ラ ー ゲ ン を 貧 食 す る こ と が 報 告 さ れ て お り7,著. 一3一. ど. 膚 線維芽細胞. 者 の 属 す る 研 究 室 で も角 膜.
(6) 実 質 細 胞 も ラ テ ッ ク ス 粒 子 や 細 菌 を 貧 食 す る こ と を 明 ら か に し た8・9.さ. ら に,. 実 質 細 胞 が コ ラ ー ゲ ン線 維 を 貧 食 す る像 も形 態 的 に 報 告 さ れ て い る1°.し か し, 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ンの 貧 食 と 消 化 が 実 際 の 角 膜 潰 瘍 に お い て ど の 程 度 関 与 して い る か は明 らか で は な い. 角 膜 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン分 解 に関 す る研 究 は プ ラ ス チ ッ ク培 養 皿 上 に 単 層 培 養 し た 実 質 細 胞 を 用 い て 行 わ れ て き た.し 1型 コ ラ ー ゲ ンを は じめ と し,種 近 年,細. か し,生 体 内 で は 角 膜 実 質 細 胞 は. 々 の 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス に 囲 ま れ て 存 在 す る.. 胞 外 マ トリ ックス が種 々 の細 胞 の活性 を調 節 す る作 用 が あ る ことが 明 ら. か と な っ て き た1い礼 西 田 ら は 角 膜 実 質 細 胞 を コ ラ ー ゲ ン ゲ ル 内 に3次 養 す る 方 法 を 確 立 し,コ. 元 的 に培. ラ ー ゲ ン ゲ ル 内 で は単 層 培 養 し た 時 に 比 べ て 形 態 や 増 殖. 能 に お い て 生 体 内 に よ り近 い 挙 動 を 示 す こ と を 明 ら か に し た1乳 本 研 究 の 目的 は,角 のinvitroモ. 膜 実 質 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン内 培 養 法 を 用 い て 新 し い 角 膜 潰 瘍. デ ル を 作 製 し,そ の モ デ ル を 用 い て 角 膜 潰 瘍 に お け る実 質 コ ラ ー ゲ. ン の 分 解 の 機 序 と そ れ に影 響 す る 因 子 を 明 らか に し よ う とす る も の で あ る.. 方. 法. 1.材. 料 お よ び試 薬. 白 色 家 兎(日. 本 在 来 種,雌,体. 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水(pH7.2;以 液,0.02%EDTA溶. 下PBSと. 北 摂 産 業 よ り 購 入 し た.リ. 略 す)は. 日 水 製 薬,0.25%ト. 液,minimumessentialmedium(MEM)培. 物 病 研 究 会,αos翻d蝕 ロ ロ キ. 重2-3k9)は. 尻. ん競oZ頭cμm由. ン. リプ シ ン 溶 養 液 は 阪 大 微 生. 来collagenase,サ. イ ト カ ラ シ ンB,ク. ン は シ グ マ 社,insulin-likegrowthfactor1(IGF-1),epidermal. growthfactor(EGF)は interleukin6(IL6),ウ 胞 培 養 用 ブ タ 腱 由 来1型. ア ー ス 製 薬,fibroblastgrowthfactor(FGF)は. 宝 酒 造,. シ 胎 児 血 清(FCS)はBoehringerMannheim社,細 コ ラ ー ゲ ン(CellMatrixtypeIa⑪)は. ウ シ プ ラ ス ミノ ー ゲ ン は 日本 ケ. ミ カ ル リ サ ー チ 社,3H標. 一4一. 新 田 ゼ ラ チ ン 社, 識 コ ラ ー ゲ ン お よ び 液.
(7) 体 シ ン チ レ ー シ ョ ン 液(Econofluor⑪)はNewEnglandNuclearResearch社, FITC標. 識 ラ テ ッ ク ス 粒 子 は ポ リ サ イ エ ン ス 社,遠. リ ーC3HK⑪)は (24穴. ミ リ ポ ア 社,デ. 培 養 皿)はCostar社. ィ ス パ ー ゼ は 合 同 酒 精,プ. 2.実. ル トラフ. ラ ス チ ッ ク培 養 皿. か ら 購 入 し た.interleukin1(IL-1)お. interleukinlreceptorantagonist(IL-1ra)は た.ヒ. 心 濾 過 チ ュ ー ブ(ウ. よ び. 大 塚 製 薬 株 式 会 社 よ り供 与 さ れ. ト線 維 肉 腫 細 胞 由 来collagenaseは. 鐘 紡 株 式 会 社 よ り 供 与 さ れ た.. 験方法. 2.1.角. 膜 実 質 細 胞 の培養. 家 兎 を ペ ン トバ ル ビ タ ー ル 静 脈 注 射 に て 麻 酔 死 さ せ,速 滅 菌 し たPBSで. 眼 球 を 洗 浄 し,角. 膜 片 を 作 成 し た.内. に ピ ン セ ッ トで 機 械 的 に 除 去 し た 後,残 を 剥 離 し た.そ. の 後,角. 膜 実 質 に 細 菌 性collagenase溶. て 回 収 し,10%FCSを. 1週 間 毎 に1:2の. 皮 細 胞 を デ ス メ膜 と と も. った角 膜 を デ ィスパ ー ゼ と反 応 さ せ 上 皮. て 培 養 し 角 膜 実 質 の コ ラ ー ゲ ン を 溶 解 し た.遊 rpm,5分)に. や か に 眼 球 を 摘 出 し た.. 添 加 し. 離 し た 角 膜 実 質 細 胞 を 遠 心(1,000. 含 むMEM培. 割 合 で 継 代 培 養 し た.今. 液(3mg/ml)を. 養 液 中 で 培 養 し た.そ. 回 の 実 験 で は 培 養4代. の 後,. か ら5代. の細. 胞 を 用 い た. 2.2.コ. ラーゲ ンゲ ルの調 整. 角 膜 実 質 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン ゲ ル 内 培 養 は 既 報 の ご と く 行 っ た13.す 下 に 保 っ た コ ラ ー ゲ ン 塩 酸 溶 液(3mg/m1),10倍. 濃 度 のMEM培. なわ ち低温 養 液,お. ゲ ル 緩 衝 液(0.05NNaOH,0.26MNaHCO3,200mMHEPES)を8:1:1の 合 で 混 和 し,速. や か に 中 性 化 さ せ た 後,細. ず っ 分 注 し,37℃incubator内 を 重 層 し,一 2.3.分. よび 割. 胞 浮 遊 液 を 加 え24穴. で ゲ ル 化 さ せ た.そ. プ レ ー ト に500μ1. の 後 血 清 を 含 ま な い培 養 液. 定 時 間 培 養 を 行 っ た. 解 コ ラ ー ゲ ン量 の 測 定. 角 膜 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン 分 解 能 は,培 ゲ ン 分 解 産 物 中 の ヒ ド ロ キ シ プ ロ リ ン(HYP)量. 一5一. 養 液 中 に遊 離 した低 分子 の コ ラ ー を 指 標 に し て 定 量 し た.実. 質細.
(8) 胞 を 一 定 時 間 培 養 し た 後,培 過 し 分 子 量10万. 養 液 を 遠 心 し細 胞 成 分 な ど を 除 去 した 上 清 を 限 外 濾. 以 下 の 低 分 子 の 分 画 を 分 取 し た.同. 混 和 し加 水 分 解 を お こ な っ た(24時 溶 解 し た.加. 間,110℃).次. 容 の 低 分 子 分 画 と濃 塩 酸 を に 試 料 を 乾 固 し,蒸. 水 分 解 産 物 中 の ヒ ド ロ キ シ プ ロ リ ン の 量 はBergmanら. 留水 で再 の 方 法 に準. じ て 測 定 し た14. 2.4.collagenase活. 性の測定. 培 養 液 中 のcollagenase活 わ ち 培 養 上 清 と3H標. 性 は3H標. 識 コ ラ ー ゲ ン を 基 質 と し て 測 定 し た.す. 識 コ ラ ー ゲ ン を 混 和 し,25℃. の コ ラ ー ゲ ン を エ タ ノ ー ル で 沈 殿 さ せ,上. で40時. 間 反 応 さ せ た.未. 用 い て 作 成 し た 検 量 線 か ら,培. を 算 定 し た.1Uは35℃ 2.5.貧. で1分. 間 に1μgの. 識 ラ テ ッ ク ス 粒 子(直. 養 液 中 のcollagenase活. コ ラ ー ゲ ン溶 液 中 に 加 え4℃. 浄 の 後MEM培. の 方 法 に 準 じて コ ラ ー. 識 ラ テ ッ ク ス 粒 子(2x10'1個/m1)を で1時. 間 反 応 さ せ た 後PBSで. 間 培 養 し た.PBSで2回. コ ラ ー ゲ ン コ ー ト し たFITC標 リ プ シ ン溶 液,EDTA溶. 除 去 し,細. 酸. 中 和 し た.洗. 養 液 で 調 整 し た.. 角 膜 実 質 細 胞 を プ ラ ス チ ッ ク 培 養 皿 に 播 種 し,10%のFCSを. 後,ト. 性(U/m1). コ ラ ー ゲ ン を 溶 か す 量 と し た.. 径2.37μm)をKnowlesら. ゲ ン コ ー ト し た1死 す な わ ち,FITC標. で24時. 製 ヒ ト由 来 の. 食 能 の測 定. FITC標. 性1型. 分解. 清 中 に 存 在 す る コ ラ ー ゲ ン分 解 産 物 中. の 放 射 活 性 を シ ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン タ ー で 測 定 し た.精 collagenaseを. な. 胞 を 回 収 し た8.細. 洗 浄 し た の ち,無. 血 清 のMEM培. 識 ラ テ ッ ク ス 粒 子 を 添 加 し16時. 含 むMEM培. 養液. 養 液 に 交 換 し た. 間 培 養 し た .そ. の. 液 を用 いて 細 胞 表面 に付 着 した ラテ ッ クス 粒 子 を 胞 に 取 り込 ま れ た 粒 子 の 蛍 光 強 度 を フ ロ ー サ イ ト. メ ー タ ー(FACScan;Becton-Dickinson社)に. て 測 定 を 行 っ た.全. 細 胞 に対 す. る ラ テ ッ ク ス 粒 子 を 貧 食 し た 細 胞 の 割 合 を 算 定 し 細 胞 の 負 食 能 と し た.. 一6一.
(9) 2.6.統. 計処理. 測 定 結 果 は 平 均 値 ± 標 準 誤 差(mean±SEM)に はStudent'st検. 結. て 表 現 し た.有. 意 性 の検 討. 定 に て 行 な っ た.. 果. 1.コ. ラ ー ゲ ンゲ ル 内 の 角 膜 実 質 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン分 解. 角 膜 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン分 解 能 の 経 時 的 な 変 化 を プ ラ ス ミノ ー ゲ ン の 存 在 下 で 検 討 し た(Fig.1).何. も 添 加 し て い な いMEM培. 養 液中で実 質 細胞 を培. 養 す る と 培 養 液 中 の ヒ ド ロ キ シ プ ロ リ ン 量 は 培 養72時. 間 まで わ ずか な増 加 傾 向 が. 認 め ら れ る の み で あ っ た.し と,培. 養6時. か し,プ. ラ ス ミ ノ ∼ ゲ ン(100μg/ml)を. 添加 す る. 間 以 降 よ り ヒ ド ロ キ シ プ ロ リ ン量 は 培 養 時 間 に 比 例 し て 増 加 し,48. 時 間 か ら72時 間 に か け て プ ラ トー に 達 し た.. C 0. fisi...... ^—. 2-6. g12-. -a. >. c = cn 13) co d.. .5 ...... (..). 0. Figure. 1 . Effects. 6 12 24 incubation of incubation. 48 period ( hrs ) periods on collagen. 72 degradation. by keratocytes. open circle ; without plasminogen, closed circle; with plasminogen (100 it g/m1) * ; p<0.005, * * ; p<0.001.. -7-.
(10) 次 に 種 々 の 細 胞 数 の 角 膜 実 質 細 胞 を コ ラ ー ゲ ンゲ ル 内 で24時 間 培 養 し,コ ゲ ン分 解 量 を 測 定 し た(Fig.2).無. ラー. 添 加 培 養 液 群 で は培 養 液 中 の 分 解 コ ラ ー ゲ. ン量 は 細 胞 数 に 比 例 し て わ ず か な 増 加 を 示 した.一. 方,プ. ラ ス ミ ノ ー ゲ ン添 加 群. で は コ ラ ー ゲ ンゲ ル 内 に 包 埋 し た 角 膜 実 質 細 胞 の 細 胞 数(3.Ox105-3.Ox106) に 依 存 して 有 意 な 分 解 コ ラ ー ゲ ン量 の 増 加 を 認 め た.こ. れ ら の 結 果 よ り角 膜 実 質. 細 胞 が 培 養 時 間 や 細 胞 数 に 比 例 し て 細 胞 外 の コ ラ ー ゲ ンを 分 解 す る こ とが 明 ら か に な っ た.ま. た 角 膜 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン分 解 は プ ラ ス ミ ノ ー ゲ ンの 存 在 に. よ り元 進 す る こ と が 明 ら か と な っ た.. c 0 ...... to— -07) E 3. g1. -a. >, c = co 0 as z.. (5. Figure. 2.. Effects of the cell number on collagen degradation by keratocytes. open circle ; without plasminogen, closed circle ; with plasminogen (100 ,ctg/ ml) * ; p<0.005, * * ; p<0.001.. —8—. 0.
(11) 2.コ 2.1.コ. ラ ー ゲ ン分 解 に 対 す る調 節 因 子 ラ ー ゲ ン分 解 に 対 す る 成 長 因 子 と サ イ ト カ イ ン の 影 響. 角 膜 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン 分 解 を 制 御 す る 因 子 を 知 る 目 的 で,各. 種 の 成長. 因 子 お よ び サ イ ト カ イ ン に よ る実 質 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン分 解 能 に 対 す る影 響 を プ ラ ス ミ ノ ー ゲ ン存 在 下(100μg/ml)で はFGFを. 検 討 し た(Fig.3).EGF,IGF-1あ. るい. 添 加 し て も実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン 分 解 は 変 化 せ ず 対 照 群 と 差 を 認. め な か っ た.IL-1α. あ る い はIL-1β. 解 は 有 意 に 増 加 し た.IL1α. を添 加 す る と実 質 細胞 に よ る コ ラー ゲ ン分. お よ びIL1β. の 間 に は実 質 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン分 解. の 促 進 作 用 に 差 は 認 め ら れ な か っ た.. Figure3.. Effectsofgrowthfactorsandcytokinesoncollagen degradation.control;MEM,EGF;10ng/ml,IL1α; 10ng/ml,IL-1β;10ng/m1,IGF;10ng/m1,FGF; 10ng/m1*;p<0,005,**;p<0.001.. 一9一.
(12) 2.2.コ. ラ ー ゲ ン 分 解 に 対 す るIL-1の. コ ラ ー ゲ ン 分 解 能 に 対 し てIL-1α. 濃 度 の影 響. の 作 用 を さ ら に 詳 細 に 検 討 し た(Fig,4).. プ ラ ス ミ ノ ー ゲ ン非 添 加 群 で は 実 質 細 胞 の 分 解 コ ラ ー ゲ ン 量 に 対 しIL1α ら影 響 を 与 え な か っ た.プ. ラ ス ミ ノ ー ゲ ン 存 在 下 で は,添. 加 し たIL-1α. 依 存 し て 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン 分 解 量 は 増 加 し,1ng/mlの 照 群 に 比 し 有 意 な 増 加 が 認 め ら れ た.こ る コ ラ ー ゲ ン 分 解 を 促 進 し,そ. 濃度 に. 濃 度 以上 で対. れ ら の こ と か ら 几 一1α. は実 質 細 胞 に よ. の 効 果 の 発 現 に は プ ラ ス ミノ ー ゲ ンの 存 在 が 必 要. で あ る こ と が 明 ら か と な っ た.. lL・1α. Figure4. は何. EffectsofII」-1αoncollagendegradationby keratocytes.opencircle;withoutplasminogen, closedcircle;withplasminogen(100μg/ml) *;p<0.05,**;p<0.005.. 一10一. (nglml).
(13) 2、3.コ. ラ ー ゲ ン分 解 に 対 す るILlraの. 影響. 角 膜 実 質 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン 分 解 能 に 対 す るIL-1α 的 で,IL-1レ. セ プ タ ー を 競 合 阻 害 す るIL-1raを. で 検 討 し た(Fig.5).IL-1raを. の 促 進 作 用 の機 序 を 知 る 目. 用 い て プ ラ ス ミ ノ ー ゲ ン存 在 下. 単 独 に 添 加 し て も実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン分. 解 に は 変 化 が 認 め ら れ な か っ た.一 に よ る コ ラ ー ゲ ン分 解 は,ILlraを に 依 存 し て 減 少 し た.ILlra濃. 方,IL-1α. 添 加 に よ って 促 進 した実 質 細 胞. 同 時 に 添 加 す る と,添 度1μg/ml以. 分 解 の 促 進 作 用 は ほ ぼ 完 全 に 抑 制 さ れ た.こ. 加 し たIL-1raの. 上 で,ILlα. に よ る コ ラ ーゲ ン. れ ら の こ と か らIL1α. 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン分 解 の 促 進 作 用 は 細 胞 表 面 のILlに. に よ る実 質. 対 す る レセ プ タ ー を介 し. て 作 用 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た.. 0. 0.1. 0.3. lL-1ra Figure5. EffectsofIL-1raoncollagendegradationby keratocytes.opencircle;withoutIL-1α,closed circle;withIL1α(10ng/ml) *;p<0.01,**;p<0.005.. 一11一. 1. 濃度. 310 (四 肖mり.
(14) 3.IL1に. よ る 細 胞 外 コ ラ ー ゲ ン分 解 へ の 影 響. 角 膜 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン 分 解 と 実 質 細 胞 のcollagenase産 知 る 目 的 で,培. 養 上 清 中 の 分 解 コ ラ ー ゲ ン 量 とcollagenase活. ゲ ン 存 在 下 で 測 定 し た(Fig.6).IL-1α 約30μgHYP/wellの. 約80μgHYP/wel1に. 非 添 加 群 で は 培 養24時. か し,IL-1α. 増 加 し,培. 性 が 認 め ら れ た.こ. を 添 加 す る と,分. 間後の上清 中 に 活性 は ほ. 解 コ ラ ー ゲ ン量 は. 養 上 清 中 に は 約4U/wellのcollagenaseの. 活. れ ら の こ と か らIL-1α. に よ る 実 質 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン分 解 促 進. が 実 質 細 胞 のcollagenase産. 生 を 促 進 す る機 序 が 関 与 して い る こ. と が 明 ら か と な っ た.. IL。1(・). Figure6. 性 をプ ラス ミノー. 分 解 コ ラ ー ゲ ン量 が 認 め ら れ た が,collagenaseの. と ん ど 検 出 さ れ な か っ た.し. 作 用 に はIL-1α. 生 との 関 係 を. Effectsof collagenase collagenase degradation. 置L・1(10ng/mり. IL-10ncollagendegradationand activitybykeratocytes。openbars; activity,closedbars:collagen *;p〈0.02,**;p〈0.005.. 一12一.
(15) 4。IL1に. よ る細 胞 内 コ ラ ー ゲ ン分 解 へ の 影 響. 4.1.コ. ラ ー ゲ ン分 解 に 対 す る サ イ トカ ラ シ ンBの 影 響. 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン分 解 に お け る実 質 細 胞 の 貧 食 作 用 の 関 与 に っ い て 知 る 目 的 で,細. 胞 内 の ア ク チ ンの 重 合 を 阻 害 し貧 食 作 用 を抑 制 す る サ イ トカ ラ シ ン. Bを 培 養 上 清 に 添 加 し て コ ラ ー ゲ ン分 解 に 対 す る 影 響 を 検 討 し た(Fig.7).サ イ トカ ラ シ ンBの 単 独 添 加 で は コ ラ ー ゲ ン分 解 に 変 化 は認 め られ な か っ た.一 方, IL-1α. の 添 加 に よ っ て 促 進 さ れ た 実 質 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン分 解 は 添 加 し た サ イ ト. カ ラ シ ンBの 濃 度 に 依 存 して 減 少 し た.. u. 0.313. 10. CytochalasinB Figure7.EffectsofcytochalasinBoncollagendegradationby keratocytes.opencircle;withoutIL-1α(10ng/m1), closedcircle;withIL-1α(10ng/ml) *;p<0.05,**;p<0.005.. 一13一. 30 (μ9/ml).
(16) 4.2.コ. ラ ー ゲ ン分 解 に 対 す る ク ロ ロ キ ンの 影 響. 次 に細 胞 の 貧食 に は影 響 せ ず 細 胞 内 の ラ イ ソ ゾ ー ム酵 素 活 性 を阻 害 す る ク ロ ロ キ ン を 培 養 上 清 に 添 加 し,コ. ラ ー ゲ ン 分 解 に 対 す る 影 響 を 検 討 し た(Fig.8).. ク ロ ロ キ ン の 単 独 添 加 で は,濃. 度100μg/mlま. 分 解 に は な ん ら変 化 は 認 め ら れ ず,検 ン分 解 が 減 少 し た.一. 方,IL-1α. で は実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン. 討 し た 最 高 濃 度(300μg/ml)で. に よ って 促 進 さ れ た 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ. ン 分 解 は ク ロ ロ キ ン の 添 加 に よ っ て 濃 度 依 存 的 に 阻 害 さ れ,ク μ9/m1で. コラ ー ゲ. ロ ロ キ ン 濃 度100. は 対 照 群 と の 間 に 差 を 認 め ず ほ と ん ど 完 全 に 阻 害 さ れ た.. 呵 03. 10. Chloroquine Figure8. Effectsofchloroquineoncollagendegradationby keratocytes。operhcircle;withoutIL1α,closed circle;withIL1α(10ng/ml) *;p〈0.05,**;p<0.001.. 一14一. 30. 100. 300 (四. ノml).
(17) 4.3.種. 々 の 薬 物 の ラ テ ッ ク ス粒 子 負 食 に 対 す る 影 響. IL-1α,サ. イ トカ ラ シ ンB,ク. 響 を 検 討 し た.プ. ロ ロキ ンの 角 膜 実 質 細 胞 の 貧 食 能 に 対 す る影. ラ ス チ ッ ク培 養 皿 上 で 培 養 した 角 膜 実 質 細 胞 に コ ラ ー ゲ ンで コ ー. ト した ラ テ ッ ク ス 粒 子 を 添 加 して16時 間 後 に ラ テ ッ ク ス 粒 子 を 貧 食 した 細 胞 の 割 合 を 計 測 し た.Fig.9で. 示 す よ う に,無. 食 が 認 め ら れ た.IL-1α. 添 加 培 養 液 中 で は 実 質 細 胞 の 約60%で. 貧. ま た は ク ロ ロキ ン存 在 下 で の 実 質 細 胞 の 食 食 は対 照 群. と の 間 に 差 を 認 め な か っ た.一. 方,ラ. テ ッ クス粒子 を貧 食 した角膜 実 質 細 胞 の 割. 合 は サ イ トカ ラ シ ンBの 添 加 に よ っ て 有 意 に 減 少 し た.こ 実 質 細 胞 が 食 食 能 を 有 し,こ. れ ら の こ と か ら,角. 膜. の 貧 食 能 を サ イ トカ ラ シ ンBが 阻 害 的 に 作 用 す る こ. と が 明 ら か と な っ た.. control巳L。1ChloroquineCytocha置asinB. Figure9.EffectsofIL-1,chloroquineorcytochalasinBon phagocytosisbykeratocytes.IL1α;10ng/ml, chloroquine;10μg/m1,cytochalasinB;30μg/ml *;p〈0.05.. 一15一.
(18) 考. 察 角 膜 潰 瘍 に お い て は 角 膜 実 質 細 胞 に よ り積 極 的 に 実 質 の コ ラ ー ゲ ンが 分 解 さ れ. る一 方,浸. 潤 して き た 炎 症 性 細 胞 由 来 のcollagenaseに. 解 さ れ る と考 え られ て き た2-6.し. よ って も コ ラ ーゲ ンが 分. か し,角 膜 潰 瘍 に お け る実 質 細 胞 の 役 割 の 詳. 細 や と く に そ の 調 節 機 構 にっ い て は 未 だ 明 ら か で は な い.角 膜 潰 瘍 の 病 態 の 研 究 に適 当 な 実 験 モ デ ル が な い こ と が 一 っ の 理 由 で あ る と 考 え ら れ る.角 invivo実. 験 モ デ ル と して 今 ま でalkahburn角. 膜漬瘍 の. 膜 を 用 い た実 験 が 多 く報 告 さ れ て. い るが1航17,定 量 的 な 再 現 性 が 乏 し く,ま たalkaliburnは. 角 膜 全 体 に対 す る侵 襲. が 強 い た め 炎 症 性 細 胞 が 強 く浸 潤 し,実 質 細 胞 の 役 割 や 細 胞 活 性 の 変 化 を 調 べ る こ と が 困 難 で あ っ た.ま 上 で 単 層 培 養 し,種. たinvitroに. お いて 角 膜実 質 細 胞 を プ ラス チ ッ ク培 養 皿. 々 の 細 胞 機 能 が 検 討 さ れ て き た.近. 年 コ ラ・ 一ゲ ン や フ ィ プ ロ. ネ ク チ ンな ど の 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス に 関 す る研 究 が 進 歩 し,細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス が 細 胞 の 増 殖 能 な ど の 種 々 の 細 胞 活 性 に 影 響 を 与 え る こ とが 明 ら か と な っ て き た11・1乳 著 者 の 属 し て い る研 究 室 で は 角 膜 実 質 細 胞 を コ ラ ー ゲ ン ゲ ル 内 に3次 的 に 培 養 す る方 法 を 確 立 し,コ. ラ ー ゲ ンゲ ル 内 で 培 養 す る と実 質 細 胞 は 増 殖 能 が. 抑 制 さ れ'3,ま た 細 胞 間 に 生 体 内 で 認 め ら れ る様 なgapjunctionを も明 ら か に な っ た9.こ. 元. の よ う に,角. 形成 す る こと. 膜 実 質 細胞 を コ ラ ー ゲ ンゲ ル 内 に培 養 す る. と生 体 に 近 い 挙 動 を 示 す こ と が 示 唆 さ れ た.こ. れ ら の こ と か ら,今 回 作 成 し た コ. ラー ゲ ン ゲ ル 内 に 培 養 した 角 膜 実 質 細 胞 が 実 際 に 分 解 した コ ラ ー ゲ ン量 を 測 定 す る実 験 モ デ ル は,生. 体 内 の 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン分 解 に よ り近 似 し た 実 験 モ. デ ル で あ る と考 え ら れ る. 今 回 報 告 し た よ う に,角 お よ びIL-1α な っ た.ま. 膜実 質 細胞 が コ ラ∼ ゲ ンを分 解 す る活 性 を有 す る こ と. が 角 膜 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン分 解 を 促 進 す る こ と が 明 らか と. たIL-1α. に よ る角 膜 実 質 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン分 解 に 対 す る 促 進 作 用 発. 現 の た め に は プ ラ ス ミ ノ ー ゲ ンの 存 在 が 必 要 で あ る こ とが 示 さ れ た.細. 胞の貧 食. あ る い は 貧 食 後 の 細 胞 内 消 化 を 阻 害 す る サ イ トカ ラ シ ンBあ る い は ク ロ ロ キ ン の. 一16一.
(19) 添 加 に よ っ て 角 膜 実 質 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン分 解 お よ びIL1に さ れ た こ と か ら,角. よ る促進 作用 が抑 制. 膜 実 質 細 胞 で は 細 胞 内 コ ラ ー ゲ ン分 解 が 重 要 な 役 割 を 演 じ る. こ と が 考 え ら れ た. IL1は. 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン の1っ. で,ア. 類 あ る こ と が 知 ら れ て い る1へIL-1の て 細 胞 活 性 を 制 御 す る.線. ミノ酸 配 列 の 違 い か ら α と βの 二 種. 生 物 活 性 は 多 彩 で,炎. 症 や創 傷 治 癒 に お い. 維 芽 細 胞 や 滑 膜 細 胞 に よ るconagenase産. 促 進 す る こ と が 報 告 さ れ て い る'臓. ま たIL-1は. 生 をIL1が. 線 維 芽細 胞 に 対 して コ ラ ー ゲ ン. の 合 成 や プ ロ ス タ グ ラ ン デ ィ ン の 産 生 も 促 進 す る こ と が 報 告 さ れ て い る21・22.眼 組 織 の 炎 症 に もIL1が. 関 与 し て い る こ と が 報 告 さ れ て い る.眼. 射 す る こと に よ っ て眼 内 炎 の症 状 を呈 す る塗 管 新 生 が 生 じ る24.さ の こ と か ら,角. ら に,培. ま た,角. あ る こ と が 考 え ら れ,今. 膜 にIL1を. 養 し た 角 膜 上 皮 細 胞 はIL-1を. 膜 の 炎 症 や 創 傷 治 癒 に お い てIL-1が. 球 内 にIL1を. 注. 注 入 す る と血. 産 生 す る%.こ. れ ら. 何 らか の 重 要 な ト リガ ー で. 回 の 成 績 と 合 わ せ る と 角 膜 潰 瘍 に お い て はIL-1が. 実 質. 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン 分 解 を 促 進 し て い る と 考 え ら れ る. IL-1raはIL1と. ア ミ ノ 酸 配 列 で 約20%の. つ で あ る 笹ILlraは. 細 胞 表 面 のIL-1レ. 同 時 にILlraを. た が っ て,角. よ る 角 膜 実 質 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン分 解 膜 上 皮 細 胞 に よ っ て 産 生 さ れ たIL1に. よ る 角 膜 実 質 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン 分 解 促 進 作 用 はIL-1レ て い る こ と が 明 ら か と な っ た.ま. よ うな. 作 用 を 阻 害 す る こ と が 知 ら れ て い る26.. 添 加 す る とIL1に. 促 進 効 果 が 阻 害 さ れ た.し. ァ ミ リー の 一. セ プ タ ー に 結 合 す る が,IL1の. 細 胞 に 対 す る 生 物 活 性 を 示 さ ず,IL1の IL-1と. 相 同 性 を 持 っIL1フ. た,生. セ プ タ ー を 介 して 作 用 し. 体 内 で は サ イ トカ イ ンや 成 長 因 子 は 相 互. に 影 響 し あ っ て い わ ゆ る サ イ ト カ イ ン ネ ッ ト ワ ー ク を 形 成 し て い る27.IL-1は 維 芽 細 胞 のIL6産. 生 を 刺 激 す る こ と が 知 ら れ て い る が 艶,IL-6を. 線. 培 養上 清 中 に. 添 加 し て も 角 膜 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン の 分 解 が 上 昇 し な か っ た こ と か ら, IL-1に. よ る 角 膜 実 質 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン 分 解 促 進 作 用 に はIL6は. て い な い と 考 え ら れ る.. 一17一. 直接 には関与 し.
(20) 本 研 究 で は コ ラ ー ゲ ン ゲ ル 内 に 培 養 し た 角 膜 実 質 細 胞 がcollagenaseを ま たIL1が. 角 膜 実 質 細 胞 のcollagenase産. 産 生 し,. 生 を 促 進 す る こ と が 明 ら か と な っ た.. 角 膜 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン 分 解 の 機 序 に つ い て は,collagenaseを す る 蛋 白 分 解 酵 素 の 研 究 が な さ れ て き た.Gordonら 胞 の 周 囲 にcollagenaseが Bermanら. は じめ と. は角膜 潰瘍 にお いて 実質 細. 局 在 す る こ と を 免 疫 組 織 学 的 に 観 察 し た5.ま. は 角 膜 潰 瘍 よ り 採 取 し た 角 膜 実 質 細 胞 がcollagen雛eを. を 報 告 し て い る3.Sakaiら. た,. 産生 す る こと. は 切 開 し た 角 膜 で 実 質 細 胞 にcollagenaseのmRNA. が 上 昇 し て い る こ と を 報 告 し て い る1°.ま matr五xmetalloproteinaseに. た,Finiら. 属 す る72kDのgelatinaseを. ま たIL-1がgelatinase産. はcollagenaseと. 同 様 に. 角 膜 実 質 細 胞 が 産 生 し,. 生 に 促 進 的 に 作 用 す る こ と を 報 告 し て お り6,今. 回 の実. 験 結 果 は こ れ ら の 報 告 と よ く 一 致 す る. 本 研 究 に お い て,プ. ラ ス ミ ノ ー ゲ ンの 存 在 下 に お け る 角 膜 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー. ゲ ン 分 解 促 進 作 用 が 認 め ら れ た.ま collagenaseが. 測 定 さ れ,IL1の. 進 が 認 め ら れ た.従. た,プ. 添 加 に よ っ て 培 養 液 中 のcollagenase活. 泌 さ れ たcollagenaseが. に は 活 性 化 さ れ る 必 要 が あ る.Invivoで. 実 際 に コ ラー ゲ ンを 分 解 す る た め は,plasmin,kallikrein,cathepsinB. 活 性 化 に 寄 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ て い る が,そ. 明 ら か に さ れ て い な い.ま. た,invitroに. さ れ る こ と が 知 ら れ て い る.正 症 眼 で は 涙 液 中 のplasmin活. ど のmetalloproteinaseに 常 で も 涙 液 中 に は わ ず か なplasminが. 性 が 上 昇 し て お り29,角. がurokinase型plasminogenactivator(u-PA)を は 角 膜 潰 瘍 に お い てcollagenase活. の機 構 は. お い てcollagenaseはtrypsin,plasmin. な ど のserineproteaseやstromelysinな. activator/Plasmin系. 性 の充. 来 の 研 究 で は 角 膜 実 質 細 胞 に よ っ て 分 泌 さ れ るcollagenase. は 不 活 性 型 で あ り,分. がcollagenaseの. ラ ス ミ ノ ー ゲ ンの 存 在 下 で 活 性 型 の. よ って 活 性 化 存 在 し,炎. 膜 実質細 胞 や角膜 上皮 細 胞. 産 生 す る3°.ま た,Bermanら 性 化 の メ カ ニ ズ ム と し てPlasminogen. の 関 与 を 提 唱 し て い る が31,今. 回 の 成 績 か ら実 際 に 角 膜 実. 質 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン 分 解 に お い てPlasminogenactivator/Plasmin系. 一18一. が.
(21) collagenaseの. 活 性 化 に 寄 与 して い る こ と が 明 らか に な っ た.. Collagenaseを. 介 し た 細 胞 外 で の 分 解 の 機 構 以 外 に,細. 胞 が コ ラ ー ゲ ンを 貧 食. し細 胞 内 で 分 解 す る 機 構 が 考 え られ て い る.実 際Evertsら. は線 維 芽 細 胞 が コ ラ ー. ゲ ン線 維 を 貧 食 す る こ と を 電 子 顕 微 鏡 下 に 観 察 し て い る8.ま. たSakaiら. は角 膜. 創 傷 治 癒 過 程 で の 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン線 維 の 貧 食 を 報 告 して い る11.さ ら に 角 膜 実 質 細 胞 は 他 の 線 維 芽 細 胞 に 比 べ て 食 食 能 が 高 い こ と が 知 ら れ て い る 聞. そ こ で 細 胞 外 の コ ラ ー ゲ ン分 解 経 路 以 外 に 細 胞 内 で の コ ラ ー ゲ ン分 解 の 可 能 性 に っ い て 検 討 した.サ. イ トカ ラ シ ンBは. ア ク チ ンの 重 合 を 阻 害 す る こ と に よ っ て 細. 胞 の 動 き や 貧 食 を 抑 制 す る 物 質 で あ る3礼 サ イ トカ ラ シ ンBの 添 加 に よ ってIL-1 で 促 進 さ れ る 等 の 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ンの 分 解 が 抑 制 さ れ る こ と が 明 らか と な っ た.ま ス6リ. た,ク. ロ ロ キ ン は ゴ ル ジ 体 か ら ラ イ ソ ゾ ー ム に輸 送 す る酵 素 を マ ンノ ー. ン酸 の レセ プ タ ー の 回 収 を 阻 害 す る こ と に よ り,細 胞 内 に 貧 食 さ れ た 物 質. の 細 胞 内 で の 分 解 を 抑 制 す る こ と が 知 ら れ て い る網 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン分 解 が 阻 害 さ れ た.こ. が,ク. ロ ロ キ ン に よ って も. れ ら の 実 験 結 果 は,今. 回用 い た. 実 験 モ デ ル で の角 膜 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン分 解 の 機 序 に 実 質 細 胞 に よ る 負 食 お よ び 細 胞 内 消 化 の 機 構 が 関 与 して い る こ とを 強 く示 唆 して い る.し. か し,角. 膜. 実 質 細 胞 の 貧 食 に よ る コ ラ ー ゲ ン の 細 胞 内 分 解 経 路 と 従 来 か ら 考 え られ て い る collagenaseに. よ る細 胞 外 分 解 系 が 互 い に ど の 程 度 の 役 割 を 角 膜 潰 瘍 の 病 態 で 演. じて い る の か に つ い て は 今 後 さ ら に 研 究 す る必 要 が あ る.今. 回,IL-1に. よ って. 促 進 が 期 待 さ れ る角 膜 実 質 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン分 解 能 が サ イ トカ ラ シ ンBや ク ロ ロ キ ン に よ っ て 阻 害 さ れ た こ と は,角. 膜 実 質 細 胞 の 負 食 作 用 が細 胞 に よ る コ ラー ゲ. ン分 解 を 調 整 す る因 子 で あ る可 能 性 を 示 して い る と 考 え られ る. 本 研 究 の 結 果,角 invitroの. 膜 実 質 細 胞 を コ ラ ー ゲ ンゲ ル 内 に 培 養 す る こ と が 角 膜 潰 瘍 の. 実 験 モ デ ル と して 有 用 で あ る こ と が 明 らか と な っ た.さ. ら に,IL-1が. 角 膜 実 質 細 胞 に よ る コ ラ ー ゲ ン分 解 を 促 進 し,角 膜 潰 瘍 で 重 要 な 役 割 を 演 じ て い る こ と が 示 唆 され た.ま. たIL-1に. よ る 角 膜 実 質 細 胞 の コ ラ ー ゲ ン分 解 促 進 作 用. 一19一.
(22) に は,実. 質 細 胞 が 産 生 す るcollagenaseを. 介 した 細 胞 外 で の 分 解 経 路 と 細 胞 の 貧. 食 作 用 に よ る 細 胞 内 で の 分 解 経 路 の2っ. の コ ラ ー ゲ ン分 解 経 路 が 関 与 して い る こ. と が 示 唆 さ れ た. 角 膜 潰 瘍 の 治 療 に は現 在 主 と して プ ロ テ ア ー ゼ 阻 害 薬 が 試 み られ て い る が,角 膜 潰 瘍 の ト リガ ー と し てIL-1が. 重 要 な 役 割 を 演 じ て い る可 能 性 が あ り,今後ILl. raや 貧 食 あ る い は 細 胞 内 消 化 を 抑 制 す る サ イ ト カ ラ シ ンBや. ク ロ ロ キ ンの よ う. な 物 質 が 角 膜 潰 瘍 の 新 し い 治 療 薬 に な る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た.今. 後 こ れ らの 薬 剤. を 用 い た 新 し い 治 療 法 の 臨 床 的 効 果 を 検 討 す る必 要 が あ る.. 謝. 辞 稿 を 終 え る に あ た り,懇. 切 な る 御 指 導 な ら び に 御 校 閲 を 賜 わ り ま し た 恩 師 大 鳥. 利 文 教 授 に 深 甚 な る 謝 意 を 表 し ま す.ま. た 終 始 御 助 言,御. 田 輝 夫 講 師 な ら び に 三 島 弘 講 師 に 感 謝 の 意 を 表 し ま す.本 AssociationforResearchinVisionandOphthalmology年. 指 導 を 賜 わ り ま し た 西 論 文 の 一 部 はThe32th 次 総 会(Sarasota,. Florida,1991年5月),The33thAssociationforResearchinVisionand Ophthalmology年. 次 総 会(Sarasota,Florida,1992年5月),The34th. AssociationforResearchinVisionandOphthalmology年 Florida,1993年5月),第95回 細 胞 生 物 学 会(徳. 次 総 会(Sarasota,. 日 本 眼 科 学 会 総 会(京 島,1992年,10月)に. お い て 発 表. 一20一. 都,1991年,5月),第45回 し た..
(23) 文. 献. 1 . Murphy. G, Reynolds. towards. JJ.. understanding. Current. views of collagen. the resorption. degradation. of connective. tissues.. ; process. BioEssays. 1984 ; 2 : 55-60. 2 . Berman. MB, Dohlman. collagenolytic. CH, Gnadinger. activity. MC, Davion. in the ulcerating. cornea.. P. Characterization. Exp. of. Eye Res 1971 ; 11 :. 255-257. 3 . Slansky. HH, Gnadinger. ulcerations.. MC, Itoi M, Dohlman. Arch Ophthalmol. 4 . Brown SI. Collagenase. CH. Collagenase. in corneal. 1969 ; 82 : 108-112.. and corneal. ulcer. Invest Ophthalmol. EA,. AZ. Collagenase. Vis Sci 1971 ;. 10 : 203-209. 5 . Gordon. JM,. Brauer. immunologic 6 .. Fini. ME,. localization. Girard. metalloproteinases. Eisen. Arch. MT.. Ophthalmol. Expression. by normal. of. cornea.. in human. cornea. ;. 1980 ; 98 : 341-345. collagenolytic. /. Invest Ophthalmol. gelatinolytic Vis Sci 1990 ;. 31 : 1789-1798. 7 . Everts. V, Beertsen. collagen. W. The role of microtubules. by fibroblasts.. 8 . Mishima. H, Yasumoto. phagocytic. activity. in the phagocytosis. of. Coll Relat Res 1987 ; 7 : 1 -15. K, Nishida. of cultured. T, Otori T. Fibronectin. rabbit. keratocytes.. enhances. the. Invest Ophthalmol. Vis. Sci 1987 ; 28 : 1521-1526. 9 . Ueda A, Nishida the presence Tissue 10. Sakai. T, Otori. T, Fujita. of gap junctions. H. Electron. between. corneal. microscopic fibroblasts. studies in rabbits.. on Cell. Res 1987 ; 249 : 473-475. J, Hung J, Zhu G, Katakami. metabolism. during healing. of lacerated. -21 -. C, Boyce S, Kao. WWY. Collagen. rabbit corneas.. Exp Eye Res 1991 :.
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