はじめに
脳卒中は，我が国において，要介護者の原因疾患第 1位であり，憂慮すべき国民病となっている．その後 遺症の回復は困難で，社会復帰に難渋する症例を多く 経験する．また，費やされる医療・介護費は多額にな り，介助する家族の労力なども含め社会的損失は膨大 である．現在，脳梗塞に対する回復が期待できる積極 的な治療法として，超急性期における血栓溶解療法と 機械的血栓回収療法がある．しかし，時間的な制約か ら適応となる症例は少なく，日常生活への障害は依然 重度な症例が多く存在する．中枢神経の損傷により 1 度失われた日常生活動作の回復は，長期にわたるリハ ビリテーションに委ねられるが，残された機能の強化 が主な目的である．しかし，神経幹細胞の発見を契機 に神経再生へ向けた研究が急速に発展しており，これ まで不可能とされてきた「神経機能の回復」を目指す， 神経再生医療の希望の光が見出されてきた． 神経再生医療は，主に 2 つの方法に分けられる．一 つは自己複製能と多分化能を有した内在性の神経幹細 胞を何らかの方法で活性化させる方法，また，もう一 つは外在性細胞を何らかの方法で移植し神経系細胞へ と導く方法である．外在性細胞移植のドナー細胞とし ては，神経幹細胞，嗅神経鞘細胞（olfactory ensheathing cell），シュワン細胞などの神経系の細胞に加えて，胚 性幹細胞（ES 細胞）や MSC 等も挙げられる．我々は， 神経系細胞を始めとする種々のドナー細胞からとくに 神経幹細胞などの幹細胞に注目し基礎研究を展開して きた．近年では，臨床応用に最も近いと思われる骨髄 由来の幹細胞をドナー細胞とした神経再生について研 究 を 進 め， 基 礎 的 研 究 成 果 を 数 多 く 報 告 し て き 受付日：2017 年 4 月 17 日，受理日：2017 年 7 月 11 日 1 札幌医科大学附属フロンティア医学研究所神経再生医療 学部門 2札幌医科大学附属病院神経再生医療科 3札幌医科大学医学部リハビリテーション医学講座 4札幌医科大学附属病院リハビリテーション部 ＊〒 060-8543 北海道札幌市中央区南 1 条西 16 丁目 TEL: 011-611-2111 E-mail: yuichi@sapmed.ac.jp doi: 10.16977/cbfm.28.2_281佐々木雄一
1, 2, 3, 4＊，佐々木祐典
1, 2，佐々木優子
1, 2，中崎 公仁
1, 2，岡 真一
1, 2浪岡 隆洋
1, 2，浪岡 愛
1, 2，柿澤 雅史
3，本望 修
1, 2 要 旨 脳梗塞は本邦における要介護者の原因疾患第 1 位であり，新しい治療法の開発が望まれてきた．我々は骨髄 間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell: MSC）の移植が，脳梗塞を含む神経疾患に対して治療効果を発揮すること を報告してきた．現在，基礎・臨床研究の良好な結果を受けて，自己培養 MSC の静脈投与による医師主導治 験を，脳梗塞および脊髄損傷に対して実施している．MSC 移植の治療効果によって，失われた運動・感覚機 能が回復する過程には，脳の可塑性の変化が大きく関わっていることが示唆されている．また，我々は実験的 脳梗塞モデルに対する MSC 移植にリハビリテーションを付加した結果，運動能力のさらなる回復が得られる ことを報告した．この基礎研究の結果から，MSC 治療が臨床で実用化された暁には，再生医療におけるリハ ビリテーションの役割はますます重要になると考えられる． （脳循環代謝 28：281∼289，2017） キーワード : 骨髄間葉系幹細胞，脳梗塞，リハビリテーション，可塑性た1~18）．その中でも神経再生作用がとくに強い MSC は，脳梗塞を含む神経疾患に対し経静脈内投与におい ても著明な治療効果が認められることを明らかにし た．これらの基礎研究結果に基づき，2007 年 1 月より 脳梗塞亜急性期の患者を対象とした自己 MSC の静脈 内投与について，安全性と治療効果を検討する臨床研 究を行い，良好な結果を得た3）．現在はこの臨床研究 の結果をもとに，治療効果を詳細に明らかにするた め，脳梗塞および脊髄損傷に対して大規模な医師主導 治験を実施している． MSC 移植の治療メカニズムには，神経栄養因子に よる神経保護作用，血管新生作用，神経再生作用な ど，複合的に作用していることが判明している．その 中でも，脳梗塞や脊髄損傷などの後遺症で失われた運 動・感覚機能が回復する過程には，脳の可塑性の変化 が大きく関わっていることが示唆されている． また，実験的脳梗塞モデルを用いた我々の基礎研究 では，MSC 移植にリハビリテーションを付加した結 果，運動能力のさらなる回復が得られ，その機能回復 にはシナプス新生などの神経可塑性が大きく関与して いることを報告した18）．MSC 移植にリハビリテーショ ンを付加することによって，神経可塑性を賦活し， 治療効果をさらに高めたものと考えられ，リハビリ テーションの重要性と今後の課題を再認識する結果と なった． 本稿では，脳梗塞における MSC 移植とリハビリ テーションの相乗効果について，画像診断学的・組織 学的に検討した基礎研究の結果に併せて，現在判明し ている治療メカニズムと MSC 移植とリハビリテー ションの相乗効果を検討した基礎研究を行うに至った 臨床研究における患者が示した回復経過も含めて紹介 する18）．
治療メカニズム
MSC 移植の治療メカニズムについて，基礎研究結 果を多数報告している1, 2, 4~9）．静脈内投与された骨髄 幹細胞は，脳梗塞などの病巣へ集積する homing 作用 がある．この homing 作用は，脳の虚血損傷によって 引き起こされる blood-brain-barrier（BBB）破綻の影響は 比較的少ないことから，BBB が修復されつつある脳梗 塞亜急性期や慢性期においても，静脈内投与で十分量 の MSC を病巣へ到達させることが可能であると考え ている． さらに，①神経栄養因子による神経栄養・保護作 用2, 4, 5, 8, 10），②血管新生作用（血流の回復）8, 12~14），③神 経再生作用1, 2, 4~6, 8, 10~12），などがある．神経栄養因子よ る神経栄養・保護作用は，MSC の産生する液性因子 が脳梗塞巣に直接作用するので作用時期は極めて早 く，時間単位で始まる．血管新生作用は，数日後から 始まり 1 週間後には血流の回復が明らかに認められる ようになる．さらに，神経再生作用は，1 週間後から 著明になり，少なくとも数カ月は漸増する（Fig. 1）． また，最新の知見では，④ BBB 機能の修復17），⑤ 脱髄軸索の再有髄化などのメカニズムが判明してい る．このように，治療効果は時間的にも空間的にも多 段階的に発揮され，1 回の投与で高い治療効果が期待 される11）．臨床研究
現在行われている医師主導治験の前に我々が行った Fig. 1．治療効果のメカニズム 文献 20 より引用自主臨床研究について紹介する．自己血清を用いて自 己の MSC を培養し，病変がテント上であった脳梗塞 患者 12 例を対象に静脈内投与を行った3）．一般的な脳 梗塞急性期治療が終了した後の亜急性期症例をエント リーした．脳梗塞の原因としては，NINDS III の分類 のいずれでも構わないとしたが，一般的な脳梗塞急性 期臨床研究に準じて，小脳梗塞，脳幹梗塞などのテン ト下の病変は除外した．また，重症度に関しては，軽 症 例 や 極 端 な 重 症 例 は 除 外 す る た め に，modified Rankin Scale（mRS）が 3∼5，かつ Japan Coma Scale が 0∼100 の患者を対象とした．全症例「評価委員会」で検 討・承認を受けた後，血液内科専門医によって局所麻 酔下にて腸骨より骨髄液を数 10 ml 採取し，専用の培 養施設内（CPC: Cell Processing Center）にて，2∼3 週間
で約 1×108個まで培養を行った．培養終了後，細胞を 一旦凍結し，安全性と品質性の検査を行い，合格した もののみ投与した．投与方法は，末梢静脈内に 30∼60 分かけて点滴静注した．症例の内訳は，男性 9 名・女 性 3 名，年齢は 41∼73 歳（59.2±8.2 歳），運動麻痺 12 名・失語症 5 名，それぞれ脳梗塞発症後 36∼133 日に 細胞移植を行った．評価は一般検査に加えて，MRI な どの画像診断学的検査および NIHSS や mRS などの臨 床症状の評価行った． 結果の詳細はすでに原著3）で報告しているが，移植 後 NIHSS および mRS の改善が統計学的に有意に加速 されることが判明した．通常の脳梗塞後の経過では， 自然回復が緩慢になってくるこの時期において，症状 改善がさらに加速される結果となった（Fig. 2）． また，一般的には脳梗塞後の MRI（FLAIR）の経時的 変化は 1 カ月程度で収束し，発作後 30 日の時点での 高信号域が最終的な梗塞巣と極めて近いと報告されて いるが，本臨床研究では，それよりさらに後の時点で の移植にも関わらず，MRI（FLAIR）における高信号域 が移植を契機に統計学的に有意に減少することもわ かった3）．
実際に観察された機能回復
臨床研究を受けた脳梗塞患者の中で，とくに興味深 い経過を示した 2 症例を紹介する． 1 例目は，発症から 2 カ月後に MSC 移植を受けた 症 例 で あ る． 移 植 直 前 の 上 肢・ 手 指 機 能 は， Brunnstrom testにおいて上肢・手指ともに stage I で あったが，移植 1 日後に手指が stage II に改善した． その後，移植後 15 日には上肢・手指がともに stage III に改善を見せ，発症 1 年後（移植 10 カ月後）では上 肢・手指ともに stage IV に改善した．さらに，回復は 継続し，移植 1 年後では stage VI まで到達した．この 症例では移植までの 2 カ月の間，麻痺側の上肢・手指 は弛緩性麻痺を呈しており，全く改善を認めなかっ た．しかし，移植を契機にして機能の回復が見られ， 1年後には stage VI まで回復し，現在は日常生活で不 自由なく使用している． 2 例目は，発症から 1.5 カ月後に MSC 移植を受けた Fig. 2．NIHSS の継時的変化NIHSS scores at the time of autologous human MSC infusion and for 1 year following autologous human MSC infusion for the 12 patients. ref 3.
症例である．移植直前の下肢・体幹機能は stage V で，麻痺側下肢での片脚立位保持は不可能であった が，移植 1 週間後には下肢が stage VI に改善を示し た．また，移植 2 週後には麻痺側下肢での片脚立位保 持が 6 秒可能になり，治療 3 カ月後には 30 秒以上の 保持が可能になった．また，移植直前の上肢機能は， 上肢が stage IV，手指が stage III，握力は測定不能で あった．移植 1 週間後には上肢が stage V，手指が stage IV，握力 5 kg に改善を示した．治療 3 カ月後に は手指が stage VI となり，握力も 15 kg に増加した． この症例においても移植を契機に回復経過に変化を認 めた．また，その変化は上肢・手指機能だけではな く，体幹や下肢機能にも及んでいた． その他の症例においてもさまざまな改善を認めた． MSC移植後，極めて早い時期から多段階的に，①上 肢・手指機能の回復，②下肢・足指機能の回復，③体 幹機能やバランス能力の回復，④自動運動の出現，⑤ spasticityの軽減，⑥言語機能や高次脳機能の改善等が みられた．さらに，MSC 移植による改善は，従来見 られる共同運動などの複合的な運動ではなく，単一関 節運動のように，より細かい機能単位にも現れるの で，四肢末梢の機能回復が期待されるのである． 実際に MSC 移植患者の理学療法を通じて，今まで 経験したことのない回復過程を目の当たりにした．回 復が困難と予想される重度な麻痺の回復や手指などの 巧緻性の高い動作の回復も期待でき，MSC 移植に新 たな脳梗塞治療やリハビリテーションの可能性を強く 感じられた．
骨髄間葉系幹細胞移植と
リハビリテーションの相乗効果
先に述べたように臨床研究や医師主導治験において 良好な治療効果を認めているが，MSC 移植にリハビ リテーションを付加することで起こる作用について検 討した基礎研究は少ない．また，実臨床においてリハ ビリテーションの有無による治療効果を検討すること は倫理的に困難である．そこで，我々は基礎研究の最 初の段階として急性期脳梗塞モデルラットを使用し， MSC移植とリハビリテーションの併用による相乗効 果の検討を行った18）．中大脳動脈永久閉塞モデル（middle cerebral artery occlusion: MCAO）ラットを，コントロール群，リハビ リテーション群，MSC 移植群，併用群の 4 群間での 治療効果を比較検討した．細胞移植群は MCAO 作成 6 時間後に大腿静脈から MSC を投与した．リハビリ テーションとして運動を付加する群には，MCAO 作製 1日後よりトレッドミル走行を毎日行った．運動強度 は毎分 3 m から開始し，1 週ごとに毎分 3 m 増加する 比較的低強度のプロトコールで進めた．治療効果の検 討は，四肢機能評価として limb placement test を継時 的に行った．また，画像診断学的評価として脳梗塞体 積の継時的定量と脳梁の厚さの定量，組織学的評価と して脳梗塞周辺領域のシナプス数の定量を行った． 運動機能面における結果では，併用群において最大 の改善を認めた．その改善は，MCAO 作製 35 日後に おいて MSC 移植群と比較し，優位な改善を示す結果 が得られた（Fig. 3）．脳梗塞体積においても，併用群 において最も脳梗塞体積の減少を認め，MCAO 作製 35日後には MSC 移植群よりも優位に減少しているこ
MSC+Ex showed more improvement compared with group MSC at 35 days after MCAO. Modified from ref 18.
とが判明した（Fig. 4）． また，脳梗塞周辺領域のシナプスを免疫組織学的に 検討した結果，MCAO 作製 50 日後におけるシナプス が併用群において増加していることを認めた（Fig. 5）．さらに，興味深いことに，脳梁の厚さも増加して いることを認められた（Fig. 6）．シナプス数や脳梁の 厚さは，運動機能の改善と高い相関を示していた （Fig. 7）． 上記の研究から MSC 移植にリハビリテーションを 併用することで，MSC 単独群よりも運動機能をさら に改善させる相乗効果があることが判明した．この運 動機能の改善には，脳梗塞体積の減少ばかりでなくシ ナプス新生や脳梁の肥厚などによる神経可塑性の亢進 が関与している結果が得られた．過去の報告によっ て，リハビリテーションなどの運動効果には，脳実質 における脳由来神経栄養因子（Brain derived neurotrophic factor: BDNF）などの神経栄養因子の産生増加とレセプ
ターの増加などが知られている19）．MSC 移植の効果に
Fig. 5．障害側大脳皮質のシナプス新生
Synaptogenesis in the motor cortex in the infarcted hemisphere at layer III/IV was analyzed with a confocal microscopy. Representative images of immunohistochemical study for synaptophysin from intact animals (C-1), group Vehicle (C-2), group Vehicle+Ex (C-3), group MSC (C-4), and group MSC+Ex (C-5). Quantitative analysis of density of synaptic puncta in the intact and 4 experimental groups. Modified from ref 18.
Fig. 4．脳梗塞体積の継時的変化
(A-D) Evaluation of the ischemic lesion volume with magnetic resonance imaging T2-weighted images (T2WI). The T2WI were obtained at days 1, 14, and 35 from the 4 experimental groups after MCAO. (E) A summary of lesion vol-ume evaluated with T2WI were obtained 1, 14, and 35 days after MCAO in the 4 experimental groups. Modified from ref 18.
よる神経栄養因子の産生強化に加え，運動負荷が生成 をさらに増加し，神経栄養・保護作用を補強している ものと推測される．さらに，その後に起こる神経再生 において，運動負荷がシナプス新生や神経回路の再構 成を助長し，神経可塑性が誘導されていることも考え られる． これらの結果から，骨髄間葉系幹細胞移植のような 新たな治療法である再生医療においてのリハビリテー ションの重要性が示され，本治療法が実用化された暁 には，再生医療においてリハビリテーションは益々重 要な役割を担ってくると考えられる．しかし，同時に 脳梗塞や脊髄損傷などの中枢神経障害の後遺症に対す るリハビリテーションの基本概念が再構築される必要 性は明白であり，目標設定や介入方法などリハビリ テーション医療の再構築など今後の課題も明確になっ たと考えられる．
今後の検討課題
先に行われた臨床研究の結果から，新たな検討事項 も浮かび上がってきた．MSC 移植を受けた患者の機 能回復は，必ずしも一般的な脳梗塞の回復過程に一致 Fig. 6．脳梁の厚さQuantitative results of corpus callosum thickness. Modified from ref 18.
Fig. 7．運動機能とシナプス数・脳梁の厚さの相関
The increased expression of synaptic marker protein correlated well with increased Limb Placement Test (LPT) scores, as illustrated by positive correlations between the density of synaptic puncta and LPT scores. In addition, the increased thickness of corpus callosum (CC) correlated well with increased LPT scores, as illustrated by positive correlations between the thickness of CC and LPT scores. Modified from ref 18.
が特徴である．そのため，従来の回復過程からかけ離 れた回復を示したと考えられる． また，MSC 移植の機能改善を脳梗塞モデルラット の functional MRI で検討した我々の基礎研究では， MSC移植群の一部に，障害側のみならず非障害側の 大脳皮質運動体性感覚野にも賦活化がみられる群を認 め，その群においては，より高い機能改善を示した13）． これらのことを総合的に考えると，①効果を評価す る新たな指標の策定，② MSC 移植の治療効果をさら に高めるリハビリテーションの介入方法の開発，③新 しい目標設定等，様々な面で再検討が必要になる． そのためにも，MSC 移植とリハビリテーションの 併用で得られる相乗効果のメカニズムのさらなる解明 に努める必要があり，今後は神経可塑性の亢進のメカ ニズムに加えて，再構築された神経回路の rewiring な どに注目して研究を進め，臨床におけるリハビリテー ションの再構築に反映させていく予定である．
おわりに
脳卒中は最も介助量の多い疾患の一つである．少子 高齢化を迎えた今日の我が国における家族形態の変化 は，家族の構成人数の減少をもたらし，介護者となる 家族 1 人あたりの負担は莫大となっている．さらに， 患者の長期間にわたる治療，介護には多額の費用を要 し，国の医療財政を圧迫している．医療・介護制度の 再検討も必要であるが，MSC 移植による神経再生医 療という新たな治療法が，脳卒中患者の後遺障害を改 善させ，患者の生活能力を今よりも 1 段階でも 2 段階 でも底上げすることが可能になれば，介護負担の軽減 や在宅復帰率の向上につながると思われる．同時に医 療費や介護費による医療財政圧迫の軽減にもつながる と考えている． MSC 移植は，脳梗塞をはじめとする神経疾患のリ ハビリテーションにパラダイム・シフトを生み出すこ とは間違いなく，再生医療は今までリハビリテーショ ンに携わってきた医療従事者，患者や家族が感じてき た限界を打ち破る新たな治療法になりうる可能性を十 分に秘めている．また，リハビリテーションは MSC 移植の治療効果を適切に発揮させるための重要なパー トナーであり，MSC 移植の臨床応用が間近になって る．とくに，MSC は，少量の骨髄液から，培養・増 殖させることが可能であり，臨床応用するにあたっ て，実用的な細胞として認知されつつある． 本論文の発表に関して，開示すべき COI はない． 文 献1） Akiyama Y, Radtke C, Honmou O, Kocsis JD: Remyelin-ation of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia 39: 229–236, 2002
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Department of Neural Regenerative Medicine, Research Institute for Frontier Medicine,
Sapporo Medical University, Hokkaido, Japan
2
Department of Neural Regenerative Medicine, Sapporo Medical University Hospital,
Hokkaido, Japan
3
Department of Rehabilitation Medicine, Research Institute for Frontier Medicine,
Sapporo Medical University, Hokkaido, Japan
4
